锚蛋白重复序列和反激活结构域在Notch1诱导T细胞白血病中的重要作用

摘要

Notch受体是高度保守的I型跨膜糖蛋白，通过具有凋亡、增殖和细胞分化多效性效应的新型信号通路调节多细胞动物的形态发生(1,11). 越来越多的证据表明，正常的信号传导是由几个配体诱导的蛋白水解裂解触发的，这些裂解从细胞膜释放Notch（ICN）的胞内结构域(6,16,18,23,25,34,48). 这允许ICN转移到细胞核，在那里上调Su（H）/CBF1家族下游转录因子的活性(4,7,10,18,28,50).

Notch信号的病理生理学改变与多种疾病有关，包括某些类型的白血病。人类槽口1该基因最初是通过分析在t细胞淋巴母细胞白血病和淋巴瘤（t-ALL）亚群中发现的反复（7；9）染色体易位[t（7；9]来鉴定的(9). t（7；9）中断槽口1基因，将其胞内结构域（ICN1）编码部分与T细胞受体β（TCRβ）基因的增强子和启动子元件融合。结果TCRβ-缺口1融合基因编码一系列截短的t（7；9）特异性Notch1多肽，定位于细胞核，结构类似ICN1(2). Notch1的致白血病潜力在我们之前的研究中得到了正式证明，在这些研究中，用编码激活形式的Notch1的逆转录病毒体外转导的骨髓（BM）细胞重建经致命照射的小鼠。约50%的动物用表达“功能丧失”的BM细胞重组槽口等位基因产生CD4⁺-CD8细胞⁺在移植后10到40周，T-ALL与人类的对应物非常相似，而动物用表达全长Notch1的细胞重建，这种细胞缺乏内在的信号活性，因此保持健康(38). 这些发现与白血病起源于一个或多个Notch信号的病理生理学增加的假设一致。

ICN1与其他Notch受体的细胞内部分一样，由一系列不同的结构域组成（见图。​图1），1)这是一个有助于对函数进行删除分析的功能。人类ICN1的N末端部分由一个～110氨基酸RAM结构域（氨基酸1757至1865）组成，其中包含Su（H）/CBF1的高亲和力结合位点(51)和功能性核定位信号序列(三,19). RAM结构域的C端有六个相互作用的锚蛋白重复序列（ANK）（氨基酸1860到2155），这是所有已知Notch功能所必需的高度保守结构域(1). ANK的C端是一段约100个氨基酸，与细胞因子信号通路的功能性相互作用有关(5)，然后是第二个功能性核定位序列(三,24). 氨基酸2155至2374包含一个转录激活域（TAD），该域通过OPA序列在其C末端结合(27)而C端氨基酸2375至2555包含PEST序列。尽管PEST序列经常以多肽为靶点进行快速降解(47)，Notch1中PEST序列的功能未知。

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图1

表达结构编码的Notch1多肽的示意图。N1，核定位信号序列1；N2，核定位信号序列2；O、 OPA序列；P、 PEST序列。

导致Su（H）/CBF1上调的几种不同类型的活动似乎与Notch1诱导T-ALL潜在相关。一种涉及转录辅抑制因子的移位，如CIR(14)和N-Cor/SMRT(21)，在结合ICN1时来自Su（H）/CBF1，从而通过去表达产生转录激活(13). 这种活性主要是使用包含由重复的Su（H）/CBF1-结合位点组成的人工启动子的报告基因进行研究的，并且需要高亲和力的RAM Su（H）/CBF1--结合结构域和ANK区域(8,35,49). 一旦与DNA上的转录因子结合，ICN的几个域也可以招募转录辅活化因子。GLP-1的ANK，a秀丽隐杆线虫Notch受体与人类ICN1(2)当表达为GAL4融合蛋白时，具有在酵母中激活转录的能力，并且在体内消除这种活性的突变会抑制功能(24,45). ICN1的C末端TAD与转录辅激活子PCAF和GCN5相关(26). 遗传和结构分析也表明存在另一种尚不清楚的ICN1活性，该活性与Su（H）/CBF1无关(29,30,32,33,35,36,49). 该途径的一个拟议组成部分是Deltex，它是一种Notch信号的调节剂，可抑制某些碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的活性(32,36).

为了开始分析有助于白血病发生的信号，我们对骨髓移植（BMT）模型进行了修改，导致移植后15周100%的动物诱导Notch1依赖性T-ALL。这种改进的模型使我们能够在体内对人类ICN1进行结构转化分析。我们发现ANK和TAD对于T-ALL的诱导都是必要的，而RAM和PEST结构域是可有可无的。当与GAL4的DNA-结合域融合时，ICN1的最小转化区域是一个强大的转录激活子，并保留从培养细胞中的HES-1启动子元件激活转录的能力。这些发现表明，T细胞祖细胞的Notch1转化可能需要向ICN1核复合体招募转录辅激活物。

材料和方法

结果

ICN1在100%BMT受者中诱导T-ALL。

虽然我们之前的模型确定ICN1是一种致癌基因，但T-ALL仅出现在30%至50%的BM重组小鼠中，并且用pGD逆转录病毒载体转导的细胞不容易识别，这使得很难区分技术失败和真正的阴性结果。为了克服这些局限性，我们替换了一种不同的逆转录病毒载体MigRI，它可以驱动编码感兴趣蛋白和GFP的单个双顺反子转录物的表达，并改变造血祖细胞体外转导的条件(43). 为了评估这些修饰的效果，我们首先检测了ICN1诱导T-ALL的能力。六只接受致命照射的BALB/c小鼠中，有六只接受了转导Mig ICN1的BM细胞，其CD4出现异常⁺-CD8（CD8）⁺双正（DP）GFP⁺骨髓移植后36天PB中未成熟T细胞的数量。移植后6至15周，ICN1小鼠的白细胞（WBC）和GFP数量都增加⁺在BMT后15周，所有动物都会因病死亡。对患病小鼠组织的大体和显微镜检查显示，由于与淋巴母细胞形态一致的细胞广泛浸润器官，导致脾肿大、肝肿大和全身淋巴结病，这也抹去并取代了BM，并可变地涉及胸腺、肠和肾脏（数据未显示）。流式细胞术证实，表达GFP 2至3 logs水平的DP细胞对器官的严重浸润高于对照细胞（见图。​图3A）。三A） ●●●●。接受MigRI转导的BM细胞的六只对照小鼠中，没有一只在超过1年的观察中出现循环DP细胞或造血恶性肿瘤（数据未显示）。在这个稳健的模型中，100%接受ICN1转导的BM细胞的小鼠发育成潜伏期不到16周的T-ALL，这使我们能够对ICN1进行体内结构转化分析。

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图3

接受转基因BM细胞的小鼠脾白细胞的免疫表型。（A） GFP的存在⁺用由致白血病Notch1逆转录病毒转导的BM重建小鼠的DP T细胞。未对从ICNΔRAM动物获得的细胞进行CD43、CD45R、Mac1和Gr1染色。（B） 缺少GFP⁺用非致白血病Notch1逆转录病毒转导的BM重建小鼠的DP T细胞。GFP表达在两个面板的左侧；用于识别GFP的门⁺人口（以百分比表示）。用于染色的抗体显示在相关轴附近的底部；数字对应于GFP中的相对百分比⁺大门。所示结果代表了表中每只小鼠的个别分析​表11总结。从每只小鼠的PB、BM和淋巴结中分离的细胞分析也发现了类似的结果。

C端子Notch1序列的要求。

因为无脊椎动物和哺乳动物细胞中的某些Notch获得功能表型是由仅包含ANK结构域的多肽产生的(46,49)，我们首先研究了Notch1 ANK足以诱导T-ALL的可能性。在同一组动物中，我们还对ANK N端（ΔRAM）或C端残基缺失的Notch1多肽进行评分[Δ（N-TAD-P）]，以评估残基侧翼ANK的作用（多肽的结构，见图。​图1）。1). 将这些多肽的活性与全尺寸ICN1和ΔW的活性进行比较(三)ICN1的一种形式，缺乏RAM结构域的前13个N末端氨基酸。

用ICN1、ΔW-和ΔRAM转导的BM细胞重建的所有小鼠在移植后23至107天之间，PB中出现异常的DP T细胞群，并且随着时间的推移而增加（表​（表11和图。​图2）。2). 在本实验和其他实验中，与ICN1队列相比，用ΔW和ΔRAM转导的骨髓重建的动物的潜伏期有略长的趋势（图。​（图22和数据未显示）。相反，尽管存在10-40%的GFP，但ANK和ΔN-TAD-P动物的PB（或胸腺外的任何器官）中从未出现DP T细胞⁺循环WBC（图。​（图3B）。三B） ●●●●。所有ICN1、ΔW和ΔRAM动物的疾病进展（定义为恶病质和不活动）都很明显，而所有ANK和Δ（N-TAD-P）动物在尸检前（BMT后14个月内）都保持健康。无病ANK和Δ（N-TAD-P）小鼠的大体和显微镜检查未显示血液恶性肿瘤的证据（数据未显示）。

表1

BMT实验结果总结^一

槽口1构造	老鼠		发病时间（天）
	移植数量	没有发展中的白血病	平均值	范围
国际竞争网络	6	6	47	23–55
ΔW	16	16	77	26–107
Δ随机存取存储器	8	8	67	50–75
Δ随机存取存储器ΔP	15	15	89	75–172
Δ（N-TAD-P）	8	0	423	不适用
Δ银行	12	0	242	不适用
ΔRAMΔOP（随机存取存储器ΔOP）	16	0	375	不适用
ΔRAMΔTAD	5	0	419	不适用
澳大利亚国家银行	8	0	242	不适用
ΔRAMΔ（TAD-P）	5	0	390	不适用

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^一平均发病时间表示小鼠移植后未发生白血病的时间。通过检测CD4来确定白血病的发展⁺-CD8（CD8）⁺外周血中的T细胞。不适用。 

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图2

用逆转录病毒转导的骨髓细胞重建的小鼠白血病的发病。白血病发病时间由骨髓移植后CD4⁺-CD8（CD8）⁺DP-GFP公司⁺在外周循环中发现了T细胞。白血病发病后，小鼠通常存活约1至2个月，在此期间，DP-GFP的分数和数量⁺单元格继续增加（数据未显示）。用非转化病毒构建物或空MigRI病毒重组的小鼠均未出现循环DP-GFP⁺细胞或任何肿瘤形成的证据。显示了用非转化病毒（ΔRAMΔOP）重组的小鼠队列的代表性生存曲线。尽管该图显示无白血病存活200天，但这些小鼠在本研究期间仍保持无白血病状态（见表​表11).

对疾病ΔW和ΔRAM动物的组织进行检查，结果与ICN1动物的结果相似，最一致的结果是脾肿大、肝肿大、淋巴结病和骨髓被淋巴母细胞替代（未显示）。流式细胞术分析证实这些肿瘤细胞具有GFP⁺DP表型（图。​（图3三A） ●●●●。

组织提取物中转化和非转化多肽的检测。

尽管我们之前注意到GFP和Notch1多肽水平在MigRI转导的细胞中相关(43)在体内，某些缺失可能会破坏Notch1多肽的稳定性。为了排除这种可能性，对组织提取物进行了蛋白质印迹分析（图。​（图4）。4). ICN1和ΔRAM淋巴结组织含有丰富的适当大小的Notch1多肽（图。​（图4A）。4A） ●●●●。评估并比较BM细胞、脾细胞和胸腺细胞提取物中其他Notch多肽的存在；显示了具有代表性的结果（图。​（图4B4B至D）。从BM和脾脏制备的提取物显示，用于转化ΔRAMΔP的预期大小的多肽（图。​（图4B）4B） 和非转换ΔRAMΔTAD、ΔRAM△OP和ΔRAMδ（TAD-P）（图。​（图4C）4C） 缺口1很容易检测到。在每只动物中，骨髓中Notch1多肽的水平高于脾脏，这一发现与我们先前的观察相符，即转导细胞首先在骨髓中检测到，然后在脾脏中，然后在其他外周部位检测到(43). 我们还观察到，在胸腺细胞提取物中检测到非转化的ΔRAMΔTAD和ΔRAM△（TAD-P）多肽（图。​（图4D），4D） 这表明，即使在健康状态良好的动物中，T细胞祖细胞也被成功转导。在一些提取物中，胸腺细胞中非转化多肽（如ΔRAMΔTAD）的水平（图。​（图4D）4D） 与转化多肽（如ΔRAMΔP）几乎相等，尽管在白血病克隆中明显选择高表达。这些发现表明，特定多肽导致T-ALL的失败不太可能源于表达不足。

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图4

组织提取物的Western blot分析。（A） ICN1和ΔRAM动物淋巴结肿块提取物。（B和C）表达转化ΔRAMΔP或非转化ΔRAMΔTAD、ΔRAM△OP和ΔRAMδ（TAD-P）多肽的动物的BM（B）、脾细胞（S）或（D）胸腺细胞提取物。将部分淋巴结肿瘤、脾脏和胸腺在液氮中快速冷冻，用杵碾碎，然后在95°C的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳加载缓冲液（～100μl/mg组织）中溶解10分钟。用生理盐水从股骨中冲洗BM细胞，造粒，并立即在加载缓冲液中溶解。用αTC兔血清对面板A和B中显示的斑点进行染色(12)针对人类Notch1的TAD升高，而面板C和D中显示的斑点用αT6兔血清染色(2)针对人类Notch1 ANK提出并通过化学发光方法揭示。

Notch诱导的白血病的克隆性。

对从Notch1诱导的白血病浸润组织中提取的DNA进行Southern blot分析，结果显示存在1到4个米格RI前病毒；代表性结果如图所示。​图5A5A到C。同样，TCRβ基因重排研究通常显示1到4个非生殖系带（图。​（图5A5A至C）。相反，从表达非血管活性Notch1的小鼠组织中获得的DNA的Southern blot分析显示前病毒整合的多克隆模式（未显示）。这些发现，加上白血病表型的100%外显率，表明Notch1诱导的白血病是由一个到几个转基因细胞的选择性生长引起的，可能是由于随机获得额外的遗传畸变所致。

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图5

转基因BM细胞小鼠白血病前病毒整合和TCRβ链重排分析。（A） 南部斑点生态从ICN1脾脏（小鼠4和5）、ΔRAM脾脏（鼠1和5）和从对照BALB/c动物获得的肾脏（KID）中分离出的RI消化基因组DNA。（B） 南部斑点生态从ΔW脾脏（spl）（小鼠67和71）和肝脏（liv）中分离的RI消化基因组DNA米格RI对照动物。（C） 两者的南方斑点生态RI-digested（IRES）或欣从ΔRAMΔP BM（小鼠5）或脾脏（小鼠3）获得的dIII-digested TCRβ（TCR）基因组DNA。为了确定前病毒整合位点的数量，用生态RI在前病毒中分裂一次，并在与592 bp脑脊髓炎病毒IRES探针杂交的Southern blots上进行分析。第二组消化Xba公司一、 每一个逆转录病毒长末端重复序列裂解一次，证实所有样本中都存在完整的前病毒DNA（数据未显示）。为了确定TCRβ基因的构型，用生态RI或欣用TCR-Jβ2特异性DNA探针孵育的印迹分析dIII(10)杂交到2.2kb生态RI片段或5-kb欣生殖系DNA中的dIII片段。除了BALB/C肾脏通道（A）外，每个通道（A至C）中都装载了2至5微克的DNA，其中包含15微克。杂交探针列在斑点下面。这个欣dIII-digested lambda大小标记显示在每个印迹附近。尺寸（以千为单位）从上到下依次为23.1、9.4、6.6、4.4、2.3和2.0。

转化和转录激活活动的相关性。

为了将转化与已知的Notch1活性相关联，在组织培养细胞中对每种多肽的激活HES-1启动子的能力以及与GAL4的DNA-结合域融合时作为转录激活物的功能进行评分。我们最关注的是跨越ANK结构域或TAD的C末端缺失分析，因为这些区域似乎对转化活性至关重要。

ICN1和ΔRAM多肽都是293A和NIH 3T3细胞中对Su（H）/CBF1敏感的HES1启动子的强激活剂，而转化ΔRAMΔP多肽产生中等水平的激活（图。​（图6A6A和C）。相反，在这两种细胞类型中，非转化的ΔRAMΔTAD、ΔRAM△OP和ΔRAMδ（TAD-P）多肽都是较弱的激活剂，而非转化的△ANK多肽则没有活性（图。​（图6C）。6C） ●●●●。这些结构物均未对突变的HES-1荧光素酶报告子HESΔAB产生任何影响，该报告子缺乏Su（H）/CBF1-结合位点（数据未显示），与主要通过Su（H）/CBF1介导的观察到的影响一致。

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图6

Notch1多肽对HES-1启动子的转录激活。（A和C）分别在急性表达的293A细胞和NIH 3T3细胞中激活。（B） 293A细胞的剂量反应。在面板A和C中显示的实验中，用250 ng pcDNA3质粒转染6孔培养皿，其中包含所示的Notch1 cDNA、500 ng HES-AB萤火虫荧光素酶质粒和10 ng pRL-TK雷尼利亚荧光素酶质粒。在B组所示的实验中，pcDNA3质粒的数量不同。转染后约48小时制备细胞裂解物。萤火虫荧光素酶活性标准化为相应的雷尼利亚荧光素酶活性。转录活性的表达与用空pcDNA3质粒转染细胞制备的提取物中观察到的归一化活性有关。所示结果代表了三个实验的平均值。

另外两项数据表明，ICN1中的各种缺失主要导致功能的定性变化。首先，使用转染效率归一化蛋白负荷进行的Western blot分析表明，转化ICN1、ΔRAM、ΔRAMΔP和非转化ΔRAMΔTAD多肽在293A细胞中均以相似的水平表达（图。​（图6A，6A、 插图）。其次，293A细胞的剂量反应实验表明，在所有质粒输入水平下，ΔRAM比ΔRAMΔTAD或ΔANK更有效（图。​（图66B） ●●●●。

为了评估反式激活活性本身，在GAL4-反应荧光素酶报告基因上分析了GAL4-Notch1融合多肽（图。​（图7）。7). 所有保留完整TAD的多肽都是中间到强转录激活物。ICN1和ICNΔRAM相当强，而ΔANK在所分析的任何多肽中始终产生最高水平的转录激活。ΔRAMΔP产生中等水平的转录激活，而缺乏TAD任何部分的多肽[ΔRAM△（TAD-P）、ΔRAMδOP和ΔRAMθTAD]都只产生弱转录激活。在对照Western blot分析中，当对转染效率进行标准化时，每一个cDNA都会导致大致等量的蛋白质表达（数据未显示），这表明所观察到的活性变化是由定性而非定量差异引起的。

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图7

GAL4-Notch1融合多肽的转录激活。用250 ng编码各种GAL4-Notch1融合多肽的pM质粒、500 ng GAL4X5萤火虫荧光素酶质粒和10 ng pRL-TK转染生长在六孔板中的293A或NIH 3T3细胞雷尼利亚荧光素酶质粒。萤火虫荧光素酶活性标准化为相应的雷尼利亚荧光素酶活性。转录活性的表达与用空pcDNA3质粒转染细胞制备的提取物中观察到的归一化活性有关。所示结果代表了三个实验的平均值。

总之，这些细胞培养相关性表明，当与GAL4的DNA结合域融合时，转化多肽是HES-1启动子的中到强激活剂和中到强反式激活剂。相反，非转化型Notch1对HES-1启动子的转录激活较弱或可以忽略不计，除ΔANK外，其他均为较弱的反式激活子，ΔANK是一种有效的反式激发子，但对HES-1启动子没有活性。图中总结了这些相关性。​图8。8.

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图8

白血病发生与各种形式Notch1转录活性的相关性。HES-1激活是指激活来自小鼠的启动子元件转录的能力HES-1型基因；反式激活是指Notch1-GAL4 DNA结合域融合多肽在含有五个重复GAL4结合位点的人工启动子上的活性。

讨论

我们使用了一种稳健的体内实验来定义T细胞祖细胞的最小Notch1转换域，该域由ANK区域、包含功能性核定位信号序列的侧翼序列和TAD组成。该分析是白血病源性NOTCH1信号传导工作模型的基础（图。​（图9），9)其中ANK与下游转录因子相互作用，可能会取代辅抑制因子，而TAD用于招募辅激活因子分子。

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图9

致白血病Notch1信号复合物模型。CBF1、转录因子Su（H）/CBF1；CoR/HDAC，共升压-去乙酰化酶复合物；十、 能够与Su（H）/CBF1和ICN1结合的分子，其中SKIP和LAG-3为原型；辅酶A/HAT，辅活化-甾酮乙酰化酶复合物。

ANK结构域通常作为蛋白质相互作用的位点，而Notch信号传导中的多种多肽基因已被证明与该结构域结合，包括Su（H）/CBF1(三,10,45)、Deltex(31)，SPT6（也称为EMB5）(15)和LAG-3(47). 由于缺失跨越Notch1 ANK的多肽在融合到GAL4的DNA结合域时仍然是强的反式激活子，但没有转化活性，也没有反式激活HES-1启动子元件，因此该域似乎对ICN1与下游信号分子的关联至关重要。

除ANK外，Notch1转化T细胞还需要TAD位于氨基酸2215和2374之间。这一结论基于以下发现：四种不同的编码多肽的结构体要么完全缺乏TAD[ANK、ΔRAMΔ（TAD-P）和ΔRAM△TAD]，要么仅仅是TAD的OPA序列部分（ΔRAMδOP）都不能引起T细胞白血病。这种对TAD转化的依赖性与细胞培养分析有关，在细胞培养分析中，TAD是GAL4-Notch1融合多肽反式激活和HES-1启动子强烈激活所必需的。最近，小鼠ICN1的TAD被证明需要与两个转录辅激活物复合物PCAF和GCN5相互作用(26)，为其在培养细胞中的诱导作用以及在体内的诱导作用提供了机制。

我们的致白血病Notch1信号传导模型反映了几个重要的不确定性。一个问题是ICN1的“无RAM-less”形式如何激活Su（H）/CBF1敏感启动子元件。我们所鉴定的Notch1的所有转化形式都能适度地强烈激活来自小鼠HES-1启动子的254-bp DNA序列的转录(18)，是Notch1信号的已知下游目标。Notch1激活该启动子需要两个重复的Su（H）/CBF1-结合位点，这意味着它是通过Su（H）/CBF1介导的。通过Su（H）/CBF1进行信号传递并不严格要求RAM域的独立证据来自无脊椎动物，在无脊椎动物中，无RAM形式的Notch仍然可以产生Su（H）/CBF1-dependent表型(45,46). ANK区域包含Su（H）/CBF1的弱结合位点，可能是体内直接物理相互作用的基础(三,10,22,45). 或者，ICN1的ANK可以通过桥接分子如SKIP间接相互作用(55)或LAG-3(42)（图中的系数X。​图9），9)，每个都与Notch的ANK结构域和Su（H）/CBF1型转录因子结合。值得注意的是，SKIP还与辅压子SMRT和N-CoR结合，它们通过ANK与SKIP的结合而竞争性取代（63）。

我们使用HES-1启动子获得的数据与使用由重复的Su（H）/CBF1-结合DNA位点组成的启动子的实验中观察到的数据不同。在使用这种报告物的急性表达分析中，RAM和ANK结构域都需要用于转录激活(8,35,49)，这与ICN1从Su（H）/CBF1中置换转录共抑制因子CIR和SMRT/N-CoR有关(14,21). 我们最近观察到，我们的ΔRAM多肽对NIH 3T3细胞中的HES-1启动子具有完全活性（图。​（图6）6)显示在由重复的Su（H）/CBF1-结合位点组成的启动子上只有有限的活性，这证实了这种差异适用于我们使用的致白血病形式的ΔRAM（J.C.Aster，未发表的数据）。HES-1启动子包含结合未知因子的两个Su（H）/CBF1-结合位点的额外DNA序列5′，对解释这些差异具有潜在的重要性(17)这些因素可能直接或间接提供额外的联络点，允许招募无RAM形式的ICN1。

虽然我们的结果支持一个模型，其中Su（H）/CBF1-依赖信号是转化所必需的，但我们不能排除Su（H-）/CBF1-independent途径的作用。遗传数据支持通过Su（H）/CBF1依赖通路的Notch信号(33); 然而，介导这种信号传导的分子和途径却知之甚少。Deltex是与Su（H）/CBF1依赖性信号传导相关的少数分子之一，它可以抑制某些bHLH转录因子的活性(32,36). 初步实验表明，Deltex的过度表达不足以引起T细胞转化，因为接受人Deltex1转导的骨髓细胞的小鼠仍然健康（F.G.Karnell和W.S.Pear，未发表）。还需要做更多的工作来确定Deltex介导的信号是否对白血病的发生是必要的。

在我们的小鼠BMT试验中，TAD的C端序列（包括PEST序列）的缺失减弱了T-ALL的诱导，但没有阻止T-ALL诱导。大多数先前对Notch功能的遗传和生化分析表明，C末端结构域是一个负调控区，可能是因为它能够与Notch拮抗剂Numb相互作用(54). 然而，我们的工作表明，该结构域对转录激活也有一定的贡献，可能是通过与目前未知的辅激活子的相互作用，因为ΔP缺失导致HES-1启动子的转录激活和细胞培养分析中GAL4融合多肽的反式激活显著降低。其他小组也观察到，小鼠Notch1相应区域（氨基酸2398至2531）的缺失导致转录激活减少(8,27)，表明该结构域的完整活性要求是哺乳动物Notch1的保守特征。无论其基础如何，我们用ΔRAMΔP观察到的衰减表型进一步突出了我们工作中出现的一个主题：转录激活与转化活性相关。

我们在T细胞祖细胞中确定的最小ICN1转化域与两组在培养的用E1A永生化的幼鼠肾细胞中独立确定的最小转化域不同(8,19). 在这两项研究中，由ANK结构域和延伸至C末端核定位信号序列的保守序列组成的多肽[对应于我们的ΔRAMΔ（TAD-P）结构]足以进行转化。因此，体内T细胞祖细胞转化的机制可能与体外培养的大鼠肾细胞不同。这并不奇怪，因为将培养细胞的转化与体内原代细胞的转化进行比较时，已观察到其他癌蛋白（如BCR-ABL和TEL-PDGFR）的结构转化差异(37,52).

导致ICN1诱导的白血病发生的关键下游事件尚不清楚，但可能是谱系特异性的，因为造血祖细胞向T细胞前体的转化活性似乎受到限制(43). 一个潜在的重要目标是HES-1(18,20)，一个像Notch1一样的因素(43,44)，对T细胞命运的承诺很重要(53). HES-1属于分裂因子的毛状增强子家族，其拮抗谱系特异性分化所需的某些bHLH转录因子。虽然Notch1促进早期T细胞分化，但内源性Notch1通常在DP T细胞中下调，然后在单个阳性胸腺细胞中重新表达(12). BM祖细胞中激活的Notch1的强制表达导致快速出现异常群体的DP T细胞(43)这表明Notch1在这一阶段的下调可能是T细胞成熟的后期所必需的。我们开发了一种与人类疾病相似的小鼠模型，为验证这些假设提供了一个实验框架，以阐明Notch1诱导T细胞白血病的机制。

鸣谢

参考文献