的全局映射肠道沙门菌-感染过程中宿主蛋白质相互作用

细菌菌株和质粒

本研究中使用的所有菌株均列在KRT中。肠道沙门菌第（b）小节。伤寒杆菌14028s(S公司Tm）wildtype用于生成标记的效应器库，如下所述。单基因缺失突变体（Δ日本证券交易所, Δ资产负债表, ΔsteC公司, Δ小型无人直升机, ΔsifA信号)从单个基因缺失（SGD）收集中检索到(Porwollik等人，2014年). PCR确认缺失并重新导入野生型S公司Tm 14028s背景使用P22噬菌体。生成Δ日本证券交易所Δ资产负债表双突变体、FLP-FRT介导的抗生素耐药盒切除如前所述(Datsenko和Wanner，2000年)第二个突变位点的P22转导。克隆PCR验证了产生的双突变体。S公司.伤寒杆菌SL1344(S公司Tm公司^SL1344型)野生型，Δ皮普B和Δ管道B2以前已经描述过菌株(霍伊塞斯和斯托克，1981年;Knodler等人，2002年,2003). 对于的本构表达式m樱桃色来自染色体Δ皮普B用来源于SL1344野生型的P22裂解物转导细菌全球监测系统::Ptrc-mCherryST公司：：Cm（Knodler等人，Cell Host Microbe，2014）和在含有氯霉素（30μg/ml）的LB琼脂上选择的转导体。如上所述，通过FLP-FRT介导的切除去除Cm抗性盒。互补质粒pPipB-2HA和pPipB2–2HA是pACYC184衍生物，已在前面描述过(Knodler等人，2002年,2003).

pPipB（Δ270–291）-2HA质粒构建如下。相应的DNA片段（包括上游启动子区域）从S公司Tm公司^SL1344型寡核苷酸pipB-Sal（5'a cgc gtc gac ata ctt tct taa tga gat aaa acg 3'）和pipB269R-Bgl（5'gga aga tct acc tgt cag atc tcc tgt 3'）的基因组DNA。这个管道B2从pPipB2-2HA（pACYC184-derivative(Knodler等人，2003年)用SalI/BglII替换，并用SalI/BglII修饰的PipB（1–269）片段替换，以创建pPibB（Δ270–291）-2HA。

这个S公司Tm 14028s标记效应器库生成如下。为了产生模板质粒（pJPS1），将2xSTREP-TEV-3xFLAG（STF）标记克隆到pQE30的MCS（EcoRI-HindIII）中，并命名为pMZ2。然后将pMZ2质粒用作PCR模板，使用引物JPS26和JPS27扩增2xSTREP-TEV-3xFLAG标签以及pKD4卡那霉素抗性盒。然后，根据制造商的说明，将该扩增子T/A克隆到pGEM®-T Easy中，然后进行序列验证和命名为pJPS1。纯化的pJPS1用作模板质粒DNA，通过λ-红色重组酶在染色体编码基因的C末端扩增并引入2xSTREP-TEV-3xFLAG（STF）标签，然后引入卡那霉素抗性盒(Datsenko和Wanner，2000年;Uzzau等人，2001年). 在含有卡那霉素30μg/mL的LB琼脂上选择克隆，并验证PCR和目标基因C末端区域的测序。所得到的标记效应物表达以下C末端STF亲和标记序列；GGAAGWSHPQFEKGGGGSGGGSWSHPQFE GENLYFQGADYKDHDYKDIDYKDDDDK。请参见表S1和KRT，获取目标效应器和表S7用于本研究中使用的所有寡核苷酸。

为了避免干扰效应器的C末端丙烯基化基序sifA信号(Brumell等人，2002年)使用与λ-红重组相关的两步选择方法，将STF标记染色体插入开放阅读框中残基D136和I137之间(Kolmsee和Hengge，2011年). 简单地说，要生成S公司Tm 14028s菌株适应pKD45两步选择，内源性S公司Tm公司ccdAB公司位点（STM14_5550和STM14~5550）通过λ-红重组被删除(Datsenko和Wanner，2000年;Uzzau等人，2001年)使用引物JPS38和JPS39，然后PCR验证和P22转导到野生型背景并指定S公司TmΔccdAB:：Cm.质粒pKD45的一个片段(Datsenko和Wanner，2000年)编码卡那霉素抗性盒和立方分贝在鼠李糖诱导启动子的控制下，使用包含与sifA信号位点（STM14_1400）。由此产生的扩增子被染色体整合到S公司TmΔccdAB:：Cm使用λ-红重组并在含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂上筛选(Datsenko和Wanner，2000年). 积极的sifA信号::坎-立方分贝转化子通过PCR进行验证，并在M9最小琼脂上测试L-鼠李糖敏感性。使用引物JPS28和JPS29以及pJPS1质粒作为DNA模板，一个包含与sifA信号并使用λ-红色重组酶扩增出一个内部STF序列并整合到染色体上(Datsenko和Wanner，2000年). 在30°C下孵育2天后，在含有0.5%L-鼠李糖的M9最小琼脂上对转化体进行反选择，并通过PCR进行验证。生成的STF标记效应器列表列于表S1以及总结HeLa和RAW264.7细胞中的测试表达行为。

对于哺乳动物细胞中的异位表达皮普B开放阅读框被放大S公司百万吨^SL1344型带有寡核苷酸pipBGFP-N5'和pipBGFM-N3'2的基因组DNA。用BglII/SalI消化扩增子，并将其连接到BglII/SalI消化的pEGFP-C1（Clontech）中以创建EGFP-PipB。EGFP-PipB（Δ270–291）是通过用PipB-GFP-N5'和GFP-PipB-269R扩增、用BglII/SalI消化并连接到pEGFP-C1而产生的。EGFP-PipB2已在前面描述(Knodler和Steele-Mortimer，2005年). 在PDZD8的C末端标记myc表位进行免疫检测。利用寡核苷酸PDZK8-EcoRI-Kozak和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_173791”，“term_id”：“1519314922”，“term_text”：“NM_173792”}}NM_173791型-Xho公司。在EcoRI/XhoI消化的pCMV-Tag 5A（Stratagene）中连接扩增子，以产生pKozak-PDZD8-myc。

为了在酵母中表达，从S公司Tm公司^SL1344型具有以下寡核苷酸对的基因组DNA，并连接到pGAD424（克隆）中：pGAD-PipB-1F和pGAD-PipB-291R、pGAD-PipB-1F和pGAD-PipB-281R、p GAD-Pip B-1F与pGAD-PipB-271R、pGAD-PibB-1F及pGAD-P1pB-188R、pGA D-PipB 189F和pGA D-PipB 291R。将PDZD8全长和片段PCR扩增为PDZD8cDNA的EcoRI/SalI片段（详见上文）。扩增子被消化并连接到pGBT9（Clontech）。使用了以下寡核苷酸对：pGBT9-PDZK8-F和pGBT9-PDZK8-R用于pGBT8-PDZD8，pGBT9-1PDZK8-F2和pGBT-9-PDZK-R用于pGB T9-PDZ D8（Δ1–338），pGBT 9-PDZK 8-F和p GBT9-PDZK8-R2用于pGBT 9-PD8（△930–1154）。重叠延伸PCR(Horton等人，1989年)用于创建删除残基368–461（pGBT9-PDZD8ΔPDZ）、残基494–814（pGBT-9-PDZD 8（Δ494–81））和残基841–887（pGBT 9-PDZD18ΔC1）的pGBT9结构。

RAW264.7巨噬细胞、pBMDM和HeLa细胞的感染

对于RAW264.7或pBMDM感染，S公司Tm菌株在37°C的LB肉汤（Lennox）中培养过夜，在PBS中洗涤，并以100倍感染率（MOI）添加到单层中。对于用多孔板进行的感染，在170℃时将细菌离心到单层上克持续5分钟，促进细菌与宿主细胞的接触。感染在37°C下进行30分钟，然后通过抽吸清除含有细菌的培养基。细胞在预先加热的PBS中清洗一次，然后在37°C的DMEM（4.5 g/l葡萄糖）中培养，DMEM含有10%FBS和100μg/ml庆大霉素（50μg/ml用于pBMDM），以杀死剩余的细胞外细菌。1小时后，在剩下的实验中，用含有10%FBS和16μg/ml庆大霉素（8μg/ml的庆大霉素，包括用于pBMDMs的m-CSF）的DMEM替换培养基（这也表示时间点0）。对于HeLa和NIH 3T3成纤维细胞感染，隔夜培养S公司对Tm菌株进行继代培养（在含有相关抗生素的10 ml LB Miller中隔夜培养300μL），并在37°C的100 ml Erlenmeyers中以45 rpm的速度培养3.5小时（改编自(斯蒂尔·莫蒂默，2008年)). 单层用100或50的MOI感染（见图图例），庆大霉素保护试验如上所述进行，但在含有1g/l葡萄糖（Gibco）和10%FBS的DMEM存在下进行。

AP-QMS的蛋白质组样品制备

对于自然收获，细胞在室温下在PBS中清洗两次，并添加含有0.1%Triton-X100和1x蛋白酶抑制剂（不含cOmplete EDTA，Roche）的裂解缓冲液（6孔板300μL，15cm皿5ml）。将细胞置于4°C下30分钟，同时轻轻摇晃，然后刮去并用吸管重新悬浮。细胞裂解液悬浮液在4°C和20000℃下离心15分钟克以清除溶解物。清除的裂解物的一小部分样品保存为“总”样品，剩余的裂解物直接用于免疫沉淀。为了在交联后收获，细胞在室温下在PBS中清洗两次，并添加交联缓冲液（PBS，含有1mM DSP（Thermo Fisher，目录号22585））。在4°C下交联2小时，并在pH 7.5下使用20 mM Tris-HCl淬火。细胞在淬火缓冲液中清洗两次，然后进行上述裂解方案。

用于下拉，STF-标记S公司使用抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma，A2220）免疫沉淀Tm效应器。每个样品50μL浆液在裂解缓冲液中洗涤两次（在4°C和2655下离心1分钟克). 将小球添加到新鲜、清洁的裂解液中，并在4°C下旋转培养至少4h（本地样品）或过夜（交联样品）。珠子培养后，在3220下离心悬浮液克持续10分钟（4°C），并除去上清液。通过2655离心，在1mL冰冷洗涤缓冲液（含0.01%Triton-X100的PBS）中洗涤珠子四次克持续1分钟（4°C）。最终清洗后，去除所有剩余缓冲液，并用40μL洗脱缓冲液替换（PBS含有150μg/ml 3x FLAG肽和0.05%RapiGest）。通过在4°C下孵育1h并旋转，然后在7150下离心，洗脱蛋白质克在4°C下，去除含有洗脱蛋白的上清液。用额外的40μL洗脱缓冲液重复洗脱步骤，并与第一次洗脱混合。

AP-QMS样品的TMT标记和质谱

在每个TMT-10plex内，平行评估未标记对照（野生型）以及9株STF效应菌株（RAW264.7第1轮：未标记野生型、PipB、PipB2、SifA、SseJ、SseL、SspH1、SteC、SlrP、第2轮：未标野生型、AvrA、GogB、SipB、SpvC、SseI、SseK1、SspH2、SteA、SteE；HeLa运行1:未标记野生型、PipB、PipB2、SifA、SseJ、SseL、SspH1、SspH2、SteC、SlrP、运行2:未标记的野生型、AvrA、GogB、SifB、SpvC、SseF、SseI、SseK1、SseK2、SteA）。对于SseJ-STF的单独TMT运行(图5A和pBMDM中的验证(图S4，Mendeley Data），将所有三个生物复制品与未标记对照（野生型）组合在同一TMT-10plex中，一式三份作为对照，其倍数变化计算如下所述。

在每次运行中，所有STF-标记的效应菌株都被播种并同时感染。在LC/MS-MS之前，在Western Blot中使用1μL洗脱组分来验证效应剂诱饵的存在。根据制造商的方案，使用Pierce Micro BCA试剂盒测定总蛋白浓度。将所有样品调整为50μL体积中的10μg蛋白质，然后提交给EMBL蛋白质组学核心设施进行样品处理。在HEPES缓冲液（50 mM HEPES，pH 8.5）中使用10 mM二硫苏糖醇在56°C下还原二硫键30分钟后，在室温下使用20 mM 2-氯乙酰胺在HEPES缓冲液中避光30分钟进行烷基化。根据SP3协议制备样品(Hughes等人，2019年)并在37°C下过夜胰蛋白酶化（测序等级，Promega，酶蛋白比1:50）。随后，通过收集磁铁上的上清液，并将其与第二次磁珠洗脱液和HEPES缓冲液结合，在HEPES缓冲器中回收肽。用TMT10plex标记肽(Werner等人，2014年)等压标签试剂（ThermoFisher）符合制造商的说明。简而言之，将0.8mg试剂溶解在42μL乙腈（100%）中，并向样品中添加4μL该储备液，并在室温下培养1h。然后用5%的羟胺对反应进行淬火15分钟。收集TMT-10plex的样品，然后使用OASIS®HLBμ洗脱板（Waters）进行进一步清洁。随后，在Agilent 1200 Infinity高效液相色谱系统上，使用Gemini C18色谱柱（3μm，110º，100×1.0 mm，Phenomenex），以20 mm甲酸铵（pH 10.0）和100%乙腈为流动相，进行离线高pH反相分馏(Reichel等人，2016年). 在LC-MS分析之前丢弃第一个和最后两个级分。

AP-QMS数据采集

样品在UltiMate 3000 RSLC纳米液相色谱系统（Dionex）上进行分析，使用μ-预柱C18 PepMap 100捕集筒（5μm，300μm i.d.x 5 mm，100？）和nanoEase™m/Z HSS T3柱75μm x 250 mm C18作为分析柱（1.8μm，100？，Waters）。以30μL/min的0.1%甲酸水溶液恒流捕集到捕集柱上6 min后，通过分析柱以0.3μL/min恒流进行洗脱，并增加溶剂百分比（乙腈中0.1%甲酸）：4 min内从2%到4%，2 min内从4%到8%，然后8%到28%再持续96分钟，最后在另一个10分钟内从28%到40%。分析柱与QExactive plus（Thermo）质谱仪耦合，并根据前面描述的参数进行质谱分析(Perez-Perri等人，2018年).

AP-QMS数据分析

等高线数量(Franken等人，2015年)和Mascot（v2.2.07）来处理所获取的数据。针对Uniprot进行肽搜索智人蛋白质组数据库（UP000005640，用于HeLa细胞样本）或Uniprot小家鼠数据库（UP000000589，用于RAW264.7细胞样本），结合沙门氏菌鼠伤寒病毒（菌株14028s/SGSC 2262）（UP000002695）数据库，包含常见污染物和反向序列。搜索参数中包括以下修饰：作为固定修饰的氨基甲酰（C）和TMT10（K），作为可变修饰的乙酰基（蛋白质N末端）、氧化（M）和TMT 10（N末端）。质量误差容限设置如下：全扫描（MS1）为10ppm，MS/MS（MS2）光谱为0.02Da。此外，胰蛋白酶最多允许两次缺失裂解，需要七个氨基酸的最小肽长度，肽和蛋白质水平的错误发现率（fdr）设置为0.01。IsobarQuant的输出文件(Franken等人，2015年)使用R编程语言（ISBN 3–900051-07–0）进行分析。只有用至少两种独特的肽进行量化并在三分之二的生物复制品中进行鉴定的蛋白质才能保存下来进行进一步分析。首先将“signal_sum”列注释为它们的生物条件，然后计算每个蛋白质每个复制的所有条件的中位数。首先，使用limma包的“removeBatchEffect”函数删除潜在的批处理影响(Ritchie等人，2015年). 其次，使用方差稳定标准化（vsn–(Huber等人，2002年)). 最后，使用Msnbase包的插补函数（方法=“knn”）插补缺失值(Gatto和Lilley，2012年). 再次使用Limma检测差异表达。计算每个下拉菜单中每个蛋白质相对于各自运行中位数的折叠变化。limma输出的T值也粘贴到fdrtool中(Strimmer，2008年)以便计算替代fdr。如果t值的标准偏差从1偏离到未观察到统计显著点击的收敛程度，则fdrtool输出的q值用作替代fdr。一种蛋白质被标注为“hit”，其fdr小于1%，增加了至少20%；这是对所有四个数据集（RAW264.7天然、RAW2647-交联、HeLa天然和HeLa交联）分别进行的。然后，通过多个步骤进一步完善了最初的命中列表：1）PPI被合并为两个数据集，每个细胞系一个数据集；2） 如果PPI在两种条件下（天然和交联）都通过了折叠变化标准，则fdr要求放宽到fdr≤0.05；3） 根据fdr和每个效应物和每个条件（天然和交联）的倍数变化对所得PPI进行排序；4） 只有在折叠变化或fdr中排名前20的PPI才被称为“hit”；5） 此外，在这两种情况下，所有通过换折要求以及放宽fdr要求的PPI都被称为“命中”。统计分析表的输出位于表S2.

网络建设和GO术语分析

网络是根据本地下拉列表和交叉下拉列表的点击数构建的。已知的宿主-宿主功能相互作用（基因组背景下的物理和/或功能、高通量实验、（保守）共表达和先前的知识）以及细菌功能相互作用被导入细胞图景v3.7.2(Shannon等人，2003年)使用STRING蛋白质查询（STRING DB版本11(Szklarczyk等人，2019))对于各自的有机体，置信区间为0.7（参见表S3不同生物体的功能相互作用网络边缘）。使用LC-MS/MS运行中检测到的针对相应人类（HeLa）或啮齿动物（RAW264.7）宿主的所有蛋白质的参考列表，使用ClueGO 2.5.2版，以细胞系特定AP-QMS蛋白质背景作为参考蛋白质组，对生物过程进行GO-末端富集。在Benjamini-Hochberg p值校正后，使用0.05的p值截止值实现GO-term融合和分组。搜索GO水平4和5中包含的GO-术语，如果至少有40%的基因和术语重叠，则每个术语和合并组需要至少3个基因和15%的基因。领导组术语被选为包含最多基因的GO术语。

SDS-PAGE和免疫印迹

对于蛋白质分离和检测，使用BioRad系统和RunBlue预制梯度凝胶（expedion）。在装入凝胶之前，样品在Laemmli缓冲液中稀释(莱姆利，1970年)含有100 mM DTT并加热至98°C 10分钟。使用Hamilton注射器短暂离心并装载样品。在150V恒定电压下进行SDS-PAGE，持续50分钟。对于Western Blot，在BioRad系统中使用Immobilon-P PVDF或硝化纤维素膜（100V持续90分钟，同时保持系统冷却）。随后，将膜在TBST中的5%牛奶中封闭1小时，并在1:1000稀释的一级抗体中培养过夜（制造商和来源以及使用的抗体稀释液见KRT）。在TBST中清洗膜3次，持续5分钟，然后在与HRP（参见KRT）结合的二级抗体中在TBST的5%牛奶中孵育1小时。在清洗3次，保持5分钟后，使用SuperSignalTM West Pico Plus化学发光底物（Thermoscific）曝露或使用Lucent Blue X射线胶片（advansta）或Kodak胶片在黑暗中的超信号West Femto Max Sensitivity ECL检测蛋白质带。如前所述，对EGFP-PipB和EGFP-PipB（Δ270–291）进行生化分级(Lau等人，2019年).

双向下拉验证

为了验证从AP-QMS工作流程中识别出的PPI，我们使用了一组11种宿主靶向特异性抗体（有关使用的抗体，请参阅KRT）。每次反应，在裂解缓冲液（0.1%Triton-X100，含蛋白酶抑制剂的PBS中）中洗涤两次50μl蛋白-A珠浆（Thermo Fisher，cat.nr.22811），用于检测兔产生的抗体，或蛋白G珠浆（Abcam，ab193259），用于检测小鼠或大鼠产生的抗体。对于每个反应，将3.5μl抗体添加到裂解缓冲液中的100μl洗涤珠中，并在室温下恒温培养2小时，以使抗体与珠结合。将珠抗体混合物涂敷于清洁的新鲜裂解液（按照“蛋白质组样品制备部分”中的描述获得）上，不去除未结合的抗体，并在4°C下孵育4小时。然后在2655下离心样品1分钟克在4°C下，倾析上清液。通过2655离心，在洗涤缓冲液（含有0.01%Triton-X100的PBS）中洗涤抗原结合珠3次克在4°C下保持1分钟。在最后的清洗步骤后，去除上清液和100μL Laemmli缓冲液(莱姆利，1970年)将含有100 mM DTT的溶液添加到珠子中。样品加热至98°C 10分钟，然后在20817离心1分钟克通过免疫印迹分析洗脱物（参见抗体稀释液的KRT）。

PipB和PipB2免疫沉淀和质谱

HeLa上皮细胞（ATCC CCL-2）在含有10%热灭活胎牛血清（Invitrogen）的Eagle's改良培养基（Mediatech）中生长，培养温度为37°C，CO含量为5%₂细胞接种在10 cm组织培养处理的培养皿中，并用FuGENE 6®试剂（Roche）转染24小时。根据制造商的说明，使用QIAfilter Plasmid Midi试剂盒（QIAGEN）制备质粒DNA。用于鉴定PipB-特异性相互作用蛋白(图S6A)用pEGFP-C1、pEGFP-PipB或pEGFP-PipB2转染8个10 cm组织培养处理的HeLa细胞培养皿。单层在冷PBS中清洗两次，并通过刮入PBS收集。细胞在50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1mM EDTA、0.1%Nonide P-40（含蛋白酶抑制剂鸡尾酒组III）和磷酸酶抑制剂鸡尾液组II（EMD Biosciences）中在冰上溶解30分钟。样品在4℃下以3000xg离心10分钟，收集核后上清液，并在4℃用蛋白A琼脂糖预处理1小时。收集上清液，并与小鼠抗GFP克隆3E6（分子探针）在4°C下孵育1小时，然后加入蛋白A琼脂糖。将小球在裂解缓冲液中洗涤四次，并用煮沸的1.5x SDS-PAGE样品缓冲液洗脱结合蛋白。蛋白质在4–15%梯度凝胶（BioRad）上通过SDS-PAGE分离，并使用SilverQuest银染色试剂盒（Thermo）进行可视化。切除GFP-PipB免疫沉淀物特有的150kDa条带，并送往斯坦福大学质谱（SUMS）设施进行LC-MS/MS分析。用于确认感染条件下PipB-PDZD8相互作用(图4B)，接种在10 cm组织培养皿中的HeLa细胞被PDZD8-myc转染，并感染以下病毒S公司Tm公司^SL1344型12小时后的应变：Δ皮普BpPipB-2HA或Δ管道B2pPipB2–2HA，MOI为50（每个菌株10个10厘米培养皿）。在12 hpi时，按照上述方法收集和处理单层。在30分钟的裂解后，样品在4°C下以6000xg离心15分钟（这足以使完整的细菌颗粒化），收集上清液并用蛋白A琼脂糖预先清除，然后用小鼠抗myc克隆4A6琼脂糖结合物（EMD Millipore）孵育。在裂解缓冲液中清洗小球，并用煮沸的1.5x SDS-PAGE样品缓冲液洗脱结合蛋白。免疫沉淀物通过SDS-PAGE分离，并使用亲和纯化的兔多克隆抗PDZD8肽抗体（针对氨基酸残基1101-1118，来自新英格兰肽的定制抗体）进行免疫印迹。和小鼠单克隆抗HA.11抗体（Covance）。

F-actin、Filin和NPC1的显微镜观察

细胞接种在96 well玻璃底板中（Greiner CellContact，RAW264.7为30000个/孔，HeLa或3T3成纤维细胞为7000个/孔）。细胞被感染S公司Tm 14028s菌株从质粒（pFCcGi）组成性表达mCherry。在感染指定时间后（见图图例），细胞在温暖的PBS中清洗3次，并在室温下在含有0.1%Triton-X100的PBS的4%（w/v）甲醛（Thermo Scientific；28908）中固定45分钟。去除固定液，在冷PBS中清洗细胞3次。在室温下，在PBS中用Hoechst（2μg/ml，Invitrogen，cat.nr.H3570）和Phalloidin ATTO-647N（30.6μg/ml，Sigma，cat.n.65906）染色1h。染色后，将细胞在冷PBS中洗涤3次，然后在成像前将其储存在4°C的黑暗中。

为了监测胆固醇的运输，前天将密度为7000个细胞/孔的HeLa细胞接种在96周的培养板中，并按照上述方法进行感染。感染后12小时，细胞在PBS中清洗两次，并在PBS的4%（v/w）甲醛中固定。在PBS内清洗两次后，用filipin（10μg/ml，PBS，Sigma，分类号F4767–1MG）对细胞染色30分钟，然后用HCS CellMask™深红色染色（Thermo，分类号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“H32721”，“term_id”：“978138”，“term_text”：“H2721”}}H32721号)如分配器所述，在室温下将细胞在含有3%牛血清白蛋白的PBS（Gerbu，cat.nr.10620250和10629005）中封闭1小时，然后在室温下用Alexa-488偶联的抗LAMP1抗体培养1小时（在含有1%BSA，Abcam的PBS中1:500）。将细胞在PBS中洗涤两次，并在4°C的黑暗中储存。

为了染色NPC1，如上所述感染并固定HeLa细胞。为了阻断和渗透，细胞在渗透缓冲液（含有10%山羊血清和0.2%皂苷的PBS）中在室温下培养20分钟。随后，细胞在一级抗体（渗透缓冲液中1:500，Novus生物制剂NB400–148）中在室温下培养45分钟，在PBS中洗涤三次，并在二级抗体（山羊抗兔，Alexa 680，渗透缓冲液，abcam ab175773中1:1000）中培养。如上所述进行LAMP-1或阴茎倍体联合染色。在奥林巴斯共焦激光扫描显微镜（FV3000）上，使用×60油浸物镜对NPC1进行共焦成像。使用405 nm激光激发Hoechst 33342捕获单图像平面，Alexa 488（LAMP1）为488 nm，mCherry为594 nm(S公司Tm）和640 nm用于Alexa-680（NPC1）。

使用NIS Elements软件（4.60版）在尼康Eclipse Ti上以10倍或20倍放大率进行宽场成像。每个孔，使用以下滤波器在预定义的均匀间隔位置拍摄9张图像（用于10倍物镜）或16张图像（用于20倍物镜）：DAPI、FITC、Cy3、Cy5。使用Cell Profiler软件（3.0.0版）分割图像。为了进行分割，基于DAPI通道定义了一个核掩码。所识别的对象用于通过阴茎倍体染色（Cy5通道）确定细胞轮廓。最后，S公司使用Cy3-或GFP/FITC-图像中的固定阈值识别Tm，并用细胞膜过滤。根据表型读数（如感染率、细菌负荷），使用积分法对所有主要和次要对象进行量化和进一步分析S公司Cell Profiler（3.0.0版）中的Tm强度。

在ImageJ（版本1.51n）中对联合定位进行量化。将Ostu分割应用于半径为10像素的滚动背景减法后的细胞轮廓图像，或将Huang分割应用于15像素半径的滚动背景减法后的黄分割（用于细胞染色），从而创建细胞掩模。类似地，a沙门氏菌掩码是通过在Cy3通道中滚动背景减法（半径为10像素）后应用Otsu分割，并在适用的情况下，在滚动背景减数（半径为十像素）后，将其与通过Ostu分割获得的LAMP1掩码重叠而创建的。为了量化共定位的程度沙门氏菌将掩模应用于鬼臼蛋白、菲林蛋白或NPC1图像，计算综合强度并将其归一化为细胞大小，从而将掩模除以细胞掩模内的平均强度沙门氏菌面具。因此，随机分布和无共同定位产生的平均值为1，而共同定位沙门氏菌而卵磷脂或菲利平的值大于1。

PipB和PDZD8的免疫荧光

将HeLa细胞接种在24孔板中酸洗过的盖玻片上。如前所述，将细胞固定并渗透(Lau等人，2019年). 在如上所述接种在酸洗盖玻片上的静止细胞中评估内源性PDZD8的定位，并用小鼠单克隆抗PDI（Stressgen，分类号SPA-891）、兔抗PDZD9（Sigma HPA015716，1:100稀释）、小鼠抗TOM20（Santa Cruz克隆F-10，1:100）和大鼠抗BAP31克隆CC-1（Invitrogen分类号。MA3–002）。或者，用EGFP-PipB或EGFP-PipB（Δ270–291）转染HeLa细胞24小时。用一级抗体孵育单层细胞-兔多克隆抗PDZD8（HPA015716，Sigma；1:100稀释）或小鼠抗PDI（克隆RL90，亲和生物试剂；1:200稀释）-然后是Alexa荧光结合二级抗体。将细胞安装在Mowiol的载玻片上。为了在感染细胞中检测PDZD8，HeLa细胞被pKozak-PDZD8-myc转染，并在18小时后感染侵袭性细胞S公司Tm公司^SL1344型Δ皮普BpPipB-2HA或Δ皮普BpPipB（Δ270–291）-2HA细菌（在某些情况下组成型表达m樱桃色MOI为50，持续10分钟。制备入侵细菌，感染条件如前所述(Klein等人，2017年). 单层固定在12 hpi，用以下主要抗体进行渗透和免疫染色-大鼠单克隆抗HA（克隆3F10，罗氏：1:250稀释），小鼠单克隆抗myc（克隆9B11，细胞信号；1:2000稀释），兔多克隆抗LAMP2（由福田实善意提供(福田等人，1988年); 1:1000稀释）或兔多克隆LAMP-1（分类号L1418，Sigma，1:200稀释）-然后是Alexa氟结合二级抗体。图像采集在蔡司LSM510或LSM710共焦显微镜上进行，通过z轴0.25μm的光学部分采用顺序采集模式。图像是z堆栈的最大强度投影。PDZD8对SCV的补充定量来自三个独立的实验，每个实验中每个条件分析大约100个细胞。

酵母双杂交分析

将AH109酵母报告菌株保持在YPD琼脂平板上。按照Matchmaker双杂交系统（Clontech）中的指导原则，通过醋酸锂方法用基于pGAD424和pGBT9的构建物对AH109细胞进行转化。在缺乏亮氨酸和色氨酸的合成培养基上分离出双转化子。融合蛋白的相互作用通过激活HIS3型在缺乏组氨酸、亮氨酸和色氨酸的培养基上电镀后的基因转录(Mattera等人，2003年).

蛋白质纯化和尺寸排除色谱法

如前所述，表达并纯化重组SteC和SteC的一个催化非活性突变体（SteC-K256H）(Poh等人，2008年). 然后在4°C下，在20 mM Tris-HCl（pH 7.4）和200 mM NaCl中透析纯化的SteC和SteC-K256H过夜。将样品浓缩在15 ml Amicon离心柱中（Ultra 15，3000 NMWL截止值-UCF900324），然后将甘油添加到10%的最终浓度，并将样品速冻并储存在−80°C下。从pGEX-4T1-tev-FMNL1-A1（1-385）在Rosetta（DE3）plysRare中表达人FMNL1（1–385）的N末端重组GST融合，如下所示。简单地说，GST融合蛋白在25°C的自诱导培养基中以250 rpm的转速表达过夜(Studier，2005年). 收集细胞并在裂解缓冲液（500 mM NaCl、50 mM Tris/HCl（pH 7.8）、20%甘油、100μg/ml溶菌酶和1x cOmplete mini-EDTA-free蛋白酶抑制剂）中进行超声裂解。GST融合在4℃下过夜与预先平衡的谷胱甘肽Sepharose 4B（GE；17–0756-01）结合。然后用100 mM NaCl、50 mM Tris/HCl（pH 7.8）和10%甘油将珠洗三次。然后根据制造商的说明，使用生物素化凝血酶（Merck Millipore；69672）在4°C下隔夜裂解GST结合蛋白。使用配备Superse 6 Increase 10/300 GL色谱柱（默克）的Akta FPLC UPC-900通过分析凝胶过滤评估SteC和SteC-K256H与FMNL1（1–385）之间的直接相互作用。通常，在样品注入之前，将500μg每种蛋白质加载到与100 mM NaCl、50 mM Tris/HCl（pH 7.8）和10%甘油平衡的色谱柱上。在柱上注射之前，将等摩尔量的每种蛋白质在4°C的冰上混合5分钟，以评估复合物的形成。在整个实验过程中，在280 nm（UV）下监测光密度。作为分子质量的参考，使用覆盖1.35–670 kDa的Bio-Read蛋白质标准物（#1511901）通过线性回归计算预期保留时间。在Prism v7中组合UV迹线并进行可视化。

体外激酶测定

纯化的重组SteC和催化活性的SteC-K256H激酶（各10μg）用激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM MgCl）预激活₂，2 mM DTT和50μM ATP），在30°C下保持5分钟。如前所述纯化FMNL1（1–385）和FMNL2（2–478(Kühn等人，2015年). 接下来，将10μg纯化的FMNL1底物与Tris-DTT缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，2mM DTT）混合，并加入预活化激酶混合物中。无线电标签[³²P] 将γ-ATP添加到混合物中，并在30°C下培养30分钟。通过添加2x Laemmli缓冲液停止反应。标记蛋白通过SDS-PAGE溶解，转移到PVDF膜上，并通过放射自显影术检测。考马斯染色显示蛋白质。

对于磷酸蛋白质组学，如上文所述，使用2μg SteC和SteC K256H激酶实现激酶预激活。将8μg FMNL1（1–385）（FMNL1样品）或8μg FMNL2（2–478）（FMNI2样品）或4μg fnml1和4μg f2（FMNL1+FMNL2样品）与激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM MgCl）混合₂2 mM DTT和50μM ATP（第一次复制）或5 mM ATP（第二次复制）），并添加到预激活激酶中。所有反应均在30°C下孵育30分钟，并在干冰上快速冷冻并在−80°C下储存。解冻后，将pH值为8.5的HEPES添加到最终浓度为100 mM的溶液中。通过分别添加最终浓度为5 mM和30 mM的三（2-羧乙基）膦盐酸盐和氯乙酰胺（Sigma-Aldrich）来还原/烷基化半胱氨酸残基。以1:25的比例（w/w）添加胰蛋白酶（Sigma-Aldrich），并在室温下培养样品过夜。然后样品在舞台尖端脱盐(Rappsilber等人，2003年)内部制备并用1 mg C18材料包装（ReproSil-Pur 120 C18-AQ 5μm，Dr Maisch）。