扶正和扶植阳方改善表皮分化通过银屑病模型中Akt/mTORC1/S6K1信号通路的抑制

FZHFZY的植物材料和制备

本研究中的FZHFZY配方包含七种中草药成分(表1). 所有植物材料均为药典级，取自中国广东广州康美药业有限公司。用蒸馏水提取草药，将提取物浓缩至5 g/ml，并在4°C下保存，以备研究。

超高效液相色谱分析

将标准化合物和FZHFZY干粉溶解在含有0.1%甲酸的甲醇中。使用UHPLC-Acquity系统（美国Waters）收集色谱指纹，该系统包括UHPLC泵和光电二极管阵列检测器，扫描范围为200至400 nm，记录范围为330 nm。HPLC条件如下：色谱柱：ACQUITY BEH C18，100×2.1 mm，1.8μm粒径（Waters），柱温40℃；流动相：（A）乙腈；（B） 0.1%甲酸；流速，250μl/min；注射体积，3μl；梯度，8%A（0分钟），30%A（15分钟），55%A（17分钟）和60%A（20分钟）。

IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α刺激的HaCaT细胞

HaCaT细胞系来自上海科学院细胞培养室（中国上海）。细胞在补充有10%FBS的DMEM中生长，并在加湿的5%CO中培养₂大气温度为37°C。用IL-17A（10 ng/ml）、IL-22（10 ng/ml）、IFN-γ（10 ng/ml）和TNF-α（25 ng/ml(Jiang等人，2017年;Jiang等人，2019年).

MTT分析

用MTT还原法测定细胞活力。将细胞接种到96个培养皿中，培养液为DMEM+10%胎牛血清，密度为每孔5000个细胞，然后用IL-17A（10 ng/ml）、IL-22（10 ng/ml）、IFN-γ（10 ng/ml）和TNF-α（25 ng/ml）处理。培养24小时后，将FZHFZY或DMEM（对照）添加到微孔中，然后培养24小时。然后，向每个孔中添加10μl MTT溶液，培养平板4小时。最后，用0.04 N HCl在异丙醇中溶解细胞，并评估每个孔在570 nm处的吸光度。

动物

雄性BALB/c小鼠（6-8周龄；18-22 g）来自广东省实验动物中心（中国广州）。给这些小鼠喂食标准饮食，可以自由饮水，并在标准实验室条件下饲养。动物实验方案由广东省中医医院动物实验伦理委员会批准。

咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型

将每日局部剂量为50 mg的IMQ乳膏涂抹在小鼠背部的剃光区域（3×2.5 cm），持续7天，以创建如前所述的银屑病样小鼠模型(Lu等人，2019).

FZHFZY管理

30只BALB/c小鼠随机分为5组：1）对照组和IMQ组外用凡士林；2） IMQ+DEX组局部应用10 mg/kg DEX；3） IMQ+中剂量FZHFZY组外用0.2ml FZHFZ，浓度0.125g/ml，每日1次；4）IMQ+高剂量FZHFZY组每天在背部剃须区局部涂抹0.2ml浓度为0.25 g/ml的FZHFZ。每日使用IMQ乳膏前2天开始给药，持续7天。

银屑病面积和严重程度指数分析及皮肤组织学检查

使用改进的人类评分系统，即银屑病面积严重程度指数（PASI），对每个病变的严重程度进行分级和监测，该指数包括连续9天的皮肤病变面积、红斑、鳞屑和增厚。PASI得分为0（无）；1（轻）；2（中等）；3（严重）；和4（极其严重）(Pang等人，2018年). 从石蜡切片上切下组织切片（7μm），用苏木精和伊红（H&E）染色，用光学显微镜进行病理观察。

实时聚合酶链反应分析

使用Trizol（Invitrogen，美国）从样品中提取总RNA，并使用紫外分光光度计（Beckman，DU-530，美国）检测RNA浓度。根据PrimeScript RT试剂盒（中国塔卡拉）说明书中提供的条件，在95°C下变性15秒，在61°C下退火15秒后，RNA被反转录为cDNA通过共扩增35个周期。基于SYBR Premix Ex Taq II配方（中国塔卡拉），使用荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪器（美国Thermo Life，ViiA7）进行定量分析。本研究中使用的引物序列列于表2相对mRNA数量由2^ΔΔCT方法，数据归一化为GAPDH看家基因。

西方印迹法

使用裂解缓冲液对组织进行裂解，然后在4°C下以15000 rpm离心15分钟，以获得总蛋白样品。用比辛可尼酸试剂盒定量细胞总蛋白浓度。通过12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每个样品中的蛋白质，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用3%牛血清白蛋白封闭膜30分钟。然后在4°C下将封闭的膜与各种一级抗体培养过夜，然后与各种二级抗体培养1小时。最后，使用Bio-Rad成像系统（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Biosciences）检测蛋白质。

FZHFZY抑制IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖并改善其表皮分化

由于IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α诱导的HaCaT细胞更可取在体外迄今为止的银屑病模型(Jiang等人，2017年;Jiang等人，2019年)我们在培养基中用多种细胞因子（10 ng/ml IL-17A、10 ng/ml IL-22、10 ng/ml IFN-γ和25 ng/ml TNF-α）处理HaCaT细胞24小时，以诱导银屑病状态。我们首先评估了FZHFZY对IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α刺激的HaCaT细胞增殖的影响。在暴露于不同浓度（0.625、1.25、2.5、5和10 mg/ml）的FZHFZY 24 h后，IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α刺激的HaCaT细胞的活性以剂量依赖性的方式降低(图2A).

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图2

FZHFZY抑制白细胞介素（IL）-17A/IL-22/干扰素（IFN）-γ/肿瘤坏死因子（TNF）-α刺激的HaCaT细胞的增殖并改善其表皮分化。（A）用IL-17A（10ng/ml）、IL-22（10ng/ml）、IFN-γ（10ng/ml）和TNF-α（25ng/ml）处理HaCaT细胞24小时，然后向孔中加入0.625至10mg/ml的不同浓度的FZHFZY，然后再孵育24小时，测量FZHFZY对细胞活力的影响通过MTT分析。（B）用1.25或2.5 mg/ml FZHFZY处理IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α刺激的HaCaT细胞24 h。从HaCaT细胞中分离出总RNA，并用RT-PCR研究表皮分化的各种分子的mRNA水平。

为了评估FZHFZY对IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α刺激的HaCaT细胞表皮分化的影响，我们测量了loricrin、filagrin、invlucrin、角蛋白5、角蛋白14和角蛋白15的mRNA表达，这些mRNA表达与经典的表皮分化有一定的关系(Szczerkowska-Dobosz等人，2020年).图2B与对照组相比，IL-17A/IL-22/IFN-γ/TNF-α诱导的HaCaT细胞中loricrin、filagrin和involucrin mRNA水平下调，角蛋白5、角蛋白14和角蛋白15水平上调；如RT-PCR所示，FZHFZY显著调节与表皮分化相关的标记物浓度。

FZHFZY改善IMQ诱发银屑病的皮肤症状

在小鼠模型中评估了FZHFZY对IMQ诱导的银屑病样皮肤损伤的疗效(图3A)是研究银屑病及其治疗药物的理想小鼠模型(Lu等人，2019年). 实验期间，每天对IMQ诱导的皮肤炎症的特征特征（鳞屑、红斑和浸润）进行PASI评分。连续9天将FZHFZY或载药外敷于BALB/c小鼠背部的剃须区，第3天至第9天使用IMQ。开始使用IMQ两天后，小鼠背部皮肤开始出现增厚和红斑的迹象。与IMQ组相比，FZHFZY治疗组在第5-9天的特定皮肤鳞屑、红斑和浸润明显减少。与仅IMQ组相比，中剂量或高剂量FZHFZY组的PASI评分显著降低(图3B).

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图3

FZHFZY对咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病具有保护作用。（A）第一次使用FZHFZY后第9天的小鼠背部照片。将所有小鼠随机分为五组，在每日涂抹IMQ乳膏前2天开始服用地塞米松（DEX）或FZHFZY，持续7天。（B）通过银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分评估IMQ诱导银屑病过程中银屑病的严重程度。（C）不同组小鼠皮肤组织的血红素和曙红（H&E）染色（放大×200，比例尺=50μm）。（D）小鼠背部皮肤的表皮厚度(***对< 0.001与IMQ诱导银屑病组；n个=6）。

FZHFZY改善IMQ小鼠皮肤组织病理学

为了评估FZHFZY对IMQ诱导的银屑病小鼠的影响，用4%多聚甲醛固定各组小鼠的部分背部皮肤，然后用H&E染色，如图所示图3C、D与正常对照组相比，IMQ治疗组小鼠的H&E染色显示出明显的组织学特征，特征是表皮棘细胞层增厚、角化不全和真皮层大量炎性细胞浸润。相反，在DEX组、中剂量和高剂量FZHFZY组中，症状得到缓解，表现为背部皮肤病变中角化不良细胞数量减少，表皮棘细胞层变薄，表皮变薄。结果表明，FZHFZY治疗可减轻IMQ诱导的银屑病样皮肤表型。

FZHFZY调节银屑病小鼠皮肤表皮分化相关分子的表达

为了评估FZHFZY是否影响IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤的表皮分化，我们通过RT-PCR和western blotting检测了皮肤中的loricrin、filaggrin、invlucrin、角蛋白5、角蛋白14和角蛋白15的表达。结果表明，与对照组相比，IMQ组loricrin、filagrin和involucrin的表达显著降低，角蛋白5、角蛋白14和角蛋白15的表达增加(图4). 然而，与IMQ组相比，FZHFZY组背部皮肤中lorisrin、filagrin和involucrin的表达增加，角蛋白5、角蛋白14和角蛋白15的表达减少(图4). 这些结果表明，FZHFZY可以调节IMQ诱导的银屑病小鼠表皮分化蛋白的表达。

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图4

FZHFZY调节IMQ诱导的银屑病小鼠表皮分化分子的mRNA和蛋白表达。（A）从皮肤组织中分离总RNA，并使用RT-PCR来研究洛林、丝聚集蛋白、总合蛋白、角蛋白5、角蛋白14和角蛋白15的水平。（B）IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤中表皮分化蛋白的典型western印迹。（C）定量表皮分化蛋白到β-肌动蛋白的数量。数据显示为至少三个独立实验的平均值±标准误差(*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001与IMQ诱导银屑病组；n个= 6).