亚历山大病相关的小鼠胶质纤维酸性蛋白突变诱导罗森塔尔纤维形成和白质应激反应

转基因和敲除小鼠与GFAP突变小鼠杂交。

GFAP Tg73.7转基因(梅辛等人，1998年)，GFAP淘汰赛(麦考尔等人，1996年)，Rosa26-Cre公司(Grippo等人，2002年)和抗氧化反应元件-人胎盘碱性磷酸酶（ARE-hPAP）报告小鼠(Johnson等人，2002年)如前所述生成。GFAP转基因、ARE-hPAP和Rosa26-Cre小鼠在FVB/N背景中保持为半合子，GFAP敲除小鼠在129S6株中保持为杂合子。

神经行为测试。

检查小鼠的总体神经功能缺损、突变体和窝友对照(n个≥8岁，男性，3个月大）通过SHIRPA主屏幕进行一系列测试(Rogers等人，1997年). 简言之，该测试包括体重和体位的观察和评分、自发活动、呼吸频率、是否有震颤、开放竞技场中的转移唤醒和运动活动、眼睑闭合、毛发竖立、惊吓反应、步态、骨盆和尾部抬高、触觉反应、体位被动性、躯干卷曲、，视觉定位、肢体抓握、握力、身体张力、pinnea反射、角膜反射、脚趾触碰反应、肤色、心率、肢体张力、腹肌张力、流泪、流涎、刺激性咬伤、翻正反射、接触性翻正反射，负性趋地性，恐惧（转移唤起时冻结），易怒（仰卧约束时的挣扎）、攻击性（挑衅性咬伤或攻击）和发声（处理时挑衅）。有关该方案的更详细描述，请访问小鼠突变计划网站：http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/facilities/mutagenesis/mutabase/shirpa_summary.html（英国牛津郡哈维尔市MRC哺乳动物遗传学单位和英国小鼠基因组中心）。

基因组DNA和cDNA的序列分析。

为了确认目标等位基因的序列，对从突变外显子扩增的PCR产物进行测序。用引物对5′-GGC AGG ATG GAG CGG AGA CG-3′和5′-TCA GTT CAG CTG CCA GCG CCT-3′对第1外显子R76H突变进行扩增，用引物5′-CGA GAA CCG AGC和5′TGG GCA AGA AGA GTC ATC TA-3′对R236H进行扩增。使用Applied Biosytems（加利福尼亚州福斯特城）BigDye终止剂循环测序试剂盒，使用纯化的PCR产物和上面列出的相同引物进行序列反应，并使用威斯康星大学生物技术中心的Applied biosytemsDNA分析仪进行分析。通过多重扩增反应确认序列，以筛选塔克聚合酶错误。

为了确认突变等位基因的全长转录物的表达，在Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）中通过均质分离的脑RNA，根据制造商的协议，在SuperScript II（20μl反应中1μg RNA）的反转录反应中转化为cDNA。用引物5′-GGC-AGG扩增GFAP cDNA自动液位计翻译起始位点的GAG CGG AGA CG-3′和3′-非翻译区聚腺苷酸信号上游的5′-AGG GAA GGA CAA CTG AGC GGA CAC-3′91bp。将PCR产物克隆到载体pCR2.1（Invitrogen）中，并对多个产物进行测序以鉴定突变体和野生型转录物。对突变cDNA克隆进行整体测序，以表明转录物已正确剪接，且未合并其他突变。

GFAP和MBP表达的Western分析。

GFAP突变小鼠与GFAP敲除株杂交(McCall等人，1996年)验证突变等位基因的蛋白表达。通过将1%脱氧胆酸盐/1%Triton X-100/0.1%十二烷基硫酸钠与100μg/ml PMSF和完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）在PBS中均匀化，从大脑中提取蛋白质。17000×离心后克在4°C下持续20分钟，分离上清液，并使用Bio-Rad（Hercules，CA）蛋白质分析测定蛋白质浓度。GFAP的Western分析是在10%的Tris-HCl凝胶上每车道60μg蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad）上进行的。在TBS中封闭3%牛奶/3%正常山羊血清后，用单克隆抗GFAP（MAB3402；Millipore，Temecula，CA）和抗β-肌动蛋白（A-5441；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）一抗分别在TBS和0.05%吐温20中稀释1:1000和1:2000，在4°C下持续16小时，对膜进行探测。用TBS/Tween 20洗涤后，将印迹与稀释为1:500的AlexaFluor 488标记的二级抗体（Invitrogen）在室温下孵育2小时。额外清洗后，用分子动力学风暴磷光成像仪（英国白金汉郡阿默沙姆生物科学公司）对膜进行扫描。

髓鞘碱性蛋白（MBP）的检测遵循相同的程序，但以下例外：在15%Tris-HCl凝胶上加载50μg蛋白质和5-90μg蛋白质的标准曲线。在TBS中的3%牛奶中阻断MBP印迹，并分别在1:2000和1:1000用单克隆抗β-肌动蛋白（A-5441；Sigma-Aldrich）和多克隆抗MBP（SC-13914；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）进行探测。

GFAP转录物和蛋白质的定量。

对来自三只8周龄雌性小鼠的样本进行实时PCR和ELISA分析，以检测129S6背景（第7代或更高代）中每个基因型的GFAP表达。将大脑矢状切开，以制备RNA和蛋白质。如前所述进行定量PCR(Hagemann等人，2005年). 使用与外显子6–8（5′-CAA CGT TAA GCT AGC CCT GGA CAT-3′和5′-CTC ACC ATC CCG CAT CTC CAC AGT-3′）对应的PCR引物，通过与SYBR绿色PCR主混料（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）的反应，从脑转录物cDNA中扩增GFAP特异性序列，并使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行定量。

对于GFAP ELISA，样品在0.5%Triton X-100中均匀化，2 m米三氯化氢，pH 7.4，2 m米EDTA，1米米补充有完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒的PMSF（罗氏应用科学），在17000×克在4°C下保持20分钟。收集上清液作为可溶性部分，将代表不溶性部分的剩余颗粒在2%十二烷基硫酸钠中破碎并煮沸15分钟。用Bio-Rad蛋白质分析法分别定量两个部分的蛋白质浓度。ELISA在涂有多克隆抗GFAP抗体（1μg/ml PBS；#Z334；Dako，Carpintia，CA）的微量滴定板上进行，并用Blotto封闭（PBS中5%牛奶）。蛋白质样品在PBS中用0.5%Triton X-100/1%BSA和1.6μg可溶性或100 ng不溶性蛋白质进行稀释，每个孔进行分析。使用纯化GFAP（新泽西州佛兰德斯研究诊断公司）的系列稀释液作为标准。使用单克隆抗GFAP检测Blotto-TX（0.5%Triton X-100）中1μg/ml的抗体（MAB3402；Millipore）。二级抗体（Blotto-TX中的1:1000）使用过氧化物酶结合的抗鼠IgG抗体（A2304；Sigma）。在所有孵育之间，用PBS（添加蛋白质样品前）或PBS/0.5%Triton X-100（与蛋白质样品孵育后）冲洗微孔。添加SuperSignal ELISA Femto最大灵敏度底物（伊利诺伊州罗克福德Pierce Biotechnology）检测过氧化物酶活性，并用GloRunner微孔板光度计（加利福尼亚州桑尼维尔Turner Biosystems）定量。

罗森塔尔纤维的电子显微镜。

对动物进行麻醉并灌注10 ml 0.1米磷酸钠缓冲液，pH7.4，然后是50 ml 2.5%戊二醛/2%多聚甲醛。在植入Polybed 812之前，大脑被移除并固定2小时，切片在威斯康星大学医学院电子显微镜设备（威斯康星州麦迪逊）的Philips CM120扫描透射电子显微镜上观察。

免疫组织化学和免疫荧光。

对于GFAP免疫组织化学，将动物麻醉并用20ml PBS灌注，取出大脑并在甲基丙烯酸中浸泡固定过夜，然后石蜡包埋并切片切片（6μm）。组织切片脱蜡、复水并用0.15%H预处理₂O（运行）₂持续10分钟，然后用10%正常山羊血清、1%牛血清白蛋白和0.25%Triton X-100在PBS中封闭2小时。用单克隆抗GFAP（MAB3402；Millipore）在4°C下以1:500的比例分块稀释过夜，然后用生物素化山羊抗鼠IgG（1:200）孵育切片2小时，用亲和素/生物素-过氧化物酶复合物溶液孵育30分钟（Elite ABC试剂盒；加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories），然后用Vector SG底物孵育10分钟。用于与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）/硝基蓝四唑（NBT）共渗，0.2 mg/ml 3,3′-二氨基联苯胺（DAB；D5905；Sigma）和0.006%H₂O（运行）₂用于过氧化物酶底物而不是Vector SG。在所有培养期间，用PBS彻底冲洗组织。

对于GFAP和内皮素B受体双重免疫荧光，用4%多聚甲醛灌注动物，取出大脑并固定4-5小时，然后在30%蔗糖中冷冻，然后用滑动切片机切割40μm切片。用0.25%Triton X-100在PBS中用10%的正常山羊血清和1%的BSA渗透漂浮切片2 h。将一级抗体稀释在2%的NGS中；0.2%牛血清白蛋白；0.25%Triton X-100[1:500小鼠抗GFAP，MAB3402（Millipore）；1:100兔抗内皮素B受体（Alomone Labs，Jerusalem，Israel）]和切片在4°C孵育过夜，然后与二级抗体Alexafluor-594结合的山羊抗鼠IgG孵育₁（1:200；Invitrogen）和FITC-结合山羊抗兔IgG（1:100，F0382；Sigma）。图像是用尼康（日本东京）C1激光扫描共聚焦显微镜拍摄的。

髓磷脂组织化学。

动物被一氧化碳杀死₂窒息3个月，10%福尔马林浸泡脑组织，30%蔗糖冷冻，滑动切片机制备30μm切片。切片安装在载玻片上，并在0.02%氯化金（III）（G4022；Sigma）的溶液中培养米PBS钠，pH 7.4，持续3小时(Schmued，1990年). 在H中冲洗两次后₂O静置5分钟，用2.5%硫代硫酸钠固定组织5分钟。随后将载玻片在自来水中冲洗30分钟，脱水，并用Histochoice固定介质（Amresco、Solon、OH）涂敷盖玻片。

髓磷脂定量。

为了寻找髓鞘的改变，我们使用了两种方法：比较前连合的大小和MBP的半定量Western印迹。使用StereoInvestigator（MicroBrightField，Williston，VT）在15只野生型和11只R236H/+小鼠3个月龄时测量前连合的横截面积。为了根据大脑大小调整原始测量值，使用了以下公式：Y′=年负极b条(X（X）负极M（M）)，其中Y′为调整值，年是原始测量值，b条是大脑重量-容积面积回归线的斜率，X（X）是大脑重量M（M）是平均大脑大小(Bishop和Wahlsten，1999年). 然后将调整后的连合区与t吨测试。

对于半定量西方人，使用年龄和应变匹配野生型小鼠的标准曲线来确定肌动蛋白和MBP水平之间的线性关系。然后使用来自8个R236H/+突变体和8个P21野生型雌性同窝雌鼠的肌动蛋白和MBP水平来计算每个样本的相对MBP水平。使用t吨测试。对每个样品进行多次杂交分析，每个样品重复2-8次。

ARE-hPAP组织化学和定量分析。

对于碱性磷酸酶组织化学，用10ml冷PBS和50ml 4%多聚甲醛灌注3个月大的动物。将大脑浸泡固定1h，酒精脱水，石蜡包埋，切片切片（6μm）。脱蜡和复水后，将切片在65°C的碱性磷酸酶（AP）缓冲液（0.1）中加热30分钟米Tris，pH 9.5，0.1米氯化钠，5米米氯化镁₂)灭活内源性碱性磷酸酶。然后将切片在AP缓冲液中与0.17 mg/ml BCIP（B6149；Sigma）在37°C下孵育48小时，或在室温下与0.17 mg/ml BCIP和0.34 mg/ml NBT（N6639；Sigma-）孵育1小时。对切片进行冲洗，用曙红复染，脱水，并使用盖玻片。

为了定量和比较不同年龄的突变系中报告基因的活性水平，从1周、2周、3周和6周以及3个月和6个月大的GFAP突变小鼠和野生型小鼠（均携带ARE-hPAP转基因）收集大脑（每组三个样本）。将半脑样品（在中线处二等分）均匀放置在1 ml溶血缓冲液中[50 m米三氯化氢，pH 7.5，5 m米氯化镁₂，100米米NaCl/4%CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基-氨]-1-丙磺酸）]，17000×离心克在4°C下保持20分钟。收集上清液，并用Bio-Rad蛋白质测定法对蛋白质进行定量。将样品稀释至100 ng/μl，将25μl添加至75μl 200 m米将二乙醇胺（DEA）置于微量滴定板中，并在65°C下加热20分钟，以灭活内源性碱性磷酸酶活性。在室温下，100μl化学发光底物CSPD（二Dium-3-[4-甲氧基螺环{1,2-二氧杂环-3,2′-（5′-氯）三环[3.3.1.1^3,7]癸}-4-基]苯基磷酸酯）与翡翠增强剂（2×；托品；应用生物系统）米氯化镁₂/150米米将DEA添加到每个孔中，在室温下培养20分钟，用GloRunner微孔板光度计（Turner Biosystems）定量酶活性。

铁组织化学。

为了评估大脑中铁的分布和浓度希尔和斯威策（1984）用于染色6周龄野生型和R236H/+小鼠的冰冻切片。解剖前用10%福尔马林在PBS中灌注小鼠。大脑通过浸泡过夜后固定，在30%蔗糖中冷冻，在组织-Tek最佳切割温度复合物（Sakura Finetek，Torrance，CA）中冷冻，40μm切片用滑动切片机切割并安装在载玻片上。用改良的Perl溶液（1%亚铁氰化钾，1%盐酸）处理切片30分钟，在H中冲洗₂O静置30分钟，用5 mg/ml DAB色原在磷酸钠缓冲液中染色，pH 7.4，含0.005%H₂O（运行）₂在H中再次冲洗载玻片15分钟₂O静置30分钟，脱水，并涂抹盖玻片。对照玻片仅用DAB溶液处理，背景过氧化物酶活性最低。