科学。作者手稿;PMC 2018年10月27日发布。
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尼姆斯:美国国立卫生研究院983922
超增强子上的辅活化子凝聚连接相分离和基因控制
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本杰明·萨巴里
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
亚历山德拉·达尔·阿格内塞
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
安·博伊亚
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
艾萨克·A·克莱恩
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
10美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院达纳-法伯癌症研究所肿瘤医学系,邮编02215
艾略特·科菲
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
克里希纳·施里尼瓦斯
三麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥,02139,美国
7美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院医学工程与科学研究所,02139
布莱恩·亚伯拉罕
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
南希·汉内特
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
艾丽西亚·萨穆迪奥
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
约翰·曼蒂加
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
查尔斯·H·李
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
杨建国
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
丹尼尔·戴伊
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
朱利安·舒杰斯
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
伊丽莎·瓦西莱
9科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国
索哈伊尔·马利克
11美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室
丹尼斯·赫尼茨
1怀特黑德生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,美国
李东彦(Tong Ihn Lee)
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
易卜拉欣·I.西塞
4麻省理工学院物理系,马萨诸塞州剑桥,02139,美国
罗伯特·罗德
11美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室
菲利普·夏普
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
9科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国
Arup K.Chakraborty公司
三麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥,02139,美国
4麻省理工学院物理系,马萨诸塞州剑桥,02139,美国
5美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学系,邮编02139
6麻省理工学院生物工程系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
7美国麻省理工学院医学工程与科学研究所,马萨诸塞州剑桥,02139
8美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学拉贡学院总医院02139
理查德·A·杨
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
1怀特海生物医学研究所,455 Main Street,Cambridge,MA 02142,USA
2麻省理工学院生物系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
三麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥,02139,美国
4麻省理工学院物理系,马萨诸塞州剑桥,02139,美国
5美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学系,邮编02139
6麻省理工学院生物工程系,马萨诸塞州坎布里奇,02139,美国
7美国麻省理工学院医学工程与科学研究所,马萨诸塞州剑桥,02139
8美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学麻省总医院拉贡研究所,邮编02139
9科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国
10美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院达纳-法伯癌症研究所肿瘤医学系,邮编02215
11美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室
†第一作者
- 补充资料
补充。
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摘要
超级增强子(SE)是一组增强子,它们协同组装高密度的转录装置,以驱动在细胞鉴定中发挥重要作用的基因的稳健表达。在这里,我们证明了富含SE的转录共激活因子BRD4和MED1在SE处形成核点状,这些核点状表现出液体状缩合物的性质,并被干扰缩合物的化学物质破坏。BRD4和MED1的固有无序区域(IDR)可以形成相分离液滴,MED1-IDR液滴可以分隔和浓缩核提取物中的转录装置。这些结果支持这样一种观点,即辅激活子在SE处形成相分离的浓缩物,分隔和浓缩转录装置,提示辅激活子IDR在这一过程中的作用,并为关键细胞身份基因的控制机制提供了见解。
流体的相分离是一个物理化学过程,通过这个过程,分子分离成浓相和稀相。相分离的生物分子凝聚物,包括核仁、核斑点、应力颗粒等,提供了一种分隔和浓缩细胞内生化反应的机制(1–三). 液-液相分离产生的生物分子冷凝液允许组分快速进入密相并在密相内移动,并表现出液滴的特性,如聚变和裂变(4). 分子之间的动态和协同多价相互作用,例如由蛋白质的某些固有无序区域产生的多价相互影响,已牵涉到液-液相分离中(5–7).
增强子是由转录因子和转录装置的其他成分结合的基因调节元件,其功能是调节细胞类型特异性基因的表达(8–13). 超级增强子(SE)是一组被异常高密度的转录机制占据的增强子,调节在细胞识别中具有特别重要作用的基因(14,15). DNA相互作用数据表明,簇中的增强子元件彼此之间以及它们调控的基因的启动子之间在空间上非常接近(16–18)与这些位点上转录机制的密集集合的概念一致。SEs的这种高密度组装显示出形成和溶解的急剧转变,是单个成核事件的结果(19,20)当染色质中的浓缩因子被耗尽时,细胞会崩溃(21–25)或当核化位点被删除时(26–29). SE的这些特性导致人们提出,活性SE上生物分子的高密度组装是由于这些遗传元素上富集因子的相分离(30). 在这里,我们提供了实验证据,证明转录辅激活子BRD4和MED1在SE处形成缩合物。这建立了一个新的框架来解释这些调节元件所描述的各种特性,并扩展了由相分离调节的生化过程,以包括细胞特性基因控制。
BRD4和MED1辅活化子形成核点
包括SE的增强子簇被主转录因子和异常高密度的因子占据,包括BRD4和MED1,它们是共激活因子(31–35)其存在可用于定义SE(14,15,21). 我们推断,如果BRD4和MED1,介体复合体的一个亚单位,是核凝聚物的组成部分,那么它们可能被视为细胞核中的离散点,并且可以研究这些点的性质。小鼠胚胎干细胞(mESC)中BRD4和MED1抗体的固定细胞免疫荧光(IF)显示这两种因子的核点(). 为了确定这种点状突起是否发生在活细胞中,利用CRISPR/Cas9对mESCs进行工程设计,用mEGFP标记内源性BRD4和MED1(图S1). 这些工程化的mESCs细胞系的活细胞荧光显微镜也显示出离散的核点(). 对这些图像的分析表明,每个细胞核有1034±130(SEM)BRD4和983±102(SEM(表S1). 这些结果表明,BRD4和MED1是mESCs细胞核内点状结构的组成部分。
BRD4和MED1在超级增强器上形成亮点(A类)小鼠胚胎干细胞BRD4和MED1的免疫荧光(IF)成像。荧光信号单独显示(左),与Hoechst染色合并显示(右)。(B类)mESC内生标记mEGFP-BRD4和mEGFP-MED1的实时成像。(C)描述纳克基因座、相关超增强子(黑条)、DNA接触(红弧)、BRD4和MED1 ChIP-seq(绿色直方图)以及FISH探针的位置。(D类)BRD4或MED1与纳克IF和DNA-FISH在固定mESC中的定位。显示所示IF和FISH的单独图像,以及显示合并通道的图像(白色重叠信号)。蓝线突出核外周,由赫斯特染色确定(未显示)。“合并(缩放)”列显示放大后的图像区域(黄色框),以获得更详细的信息。(E类)BRD4的FISH、IF或MED1的IF的平均信号集中在纳克DNA-FISH病灶或随机选择的核位置。(F类)BRD4或MED1与纳克固定mESC中的IF和RNA-FISH。数据如(D)所示。(G公司)BRD4的FISH、IF或MED1的IF的平均信号集中在纳克RNA-FISH病灶或随机选择的核位置。
超增强子与辅激活子点相关
一些证据表明,SE可能与mESC中的一些BRD4和MED1点有关。BRD4和MED1的ChIP-seq数据表明,SE在这些辅活化剂中特别富集(14,15). DNA相互作用数据表明,BRD4和MED1占据的SE成分在空间上彼此接近(,图S2A). BRD4和MED1的基因组共现性在SE中最为明显(图S2B)(14,15). 为了确定SE是否与某些BRD4和MED1点相关,我们对BRD4或MED1进行了if,同时对包含纳克基因及其超增强子(). 我们发现BRD4和MED1点状始终与DNA-FISH病灶重叠()或RNA-FISH焦点(). 以DNA-FISH病灶为中心的BRD4或MED1中频信号(BRD4为137,MED1为125)或RNA-FISH-病灶(BRD4=121,MED1=181)的平均图像分析(详见方法)表明,平均而言,BRD4和MED1荧光强度在FISH灶的中心最为丰富(); 在随机选择的核位置中心的平均图像中没有观察到这种趋势(). FISH和IF对平均图像的径向分布函数显示出显著的相关性(Spearman相关系数>0.6,p值<1×10−16),BRD4和MED1在FISH焦点的中心具有最高的信号强度,随着距离该中心的距离而衰减(图S3). 在随机选择的核位置,FISH和IF的径向分布没有显示出相关性(Spearman相关系数<0.2)(图S3). 当我们对BRD4或MED1进行IF并对SE调节基因进行新生RNA-FISH时,也获得了类似的结果Klf4,Mir290号、和修剪28(图S3和S4A–F系列). 当对mESCs中表达但与SE无关的两个基因进行类似实验时(家族168b和Zfp606型),FISH病灶和BRD4点之间没有明显重叠(图S4G). 这些结果表明,SE中同时存在BRD4和MED1点。
助活化剂puncta在光漂白后表现出类似液体的荧光恢复率
接下来,我们试图研究BRD4和MED1 punta是否表现出液态冷凝液的特征。类液体冷凝物的一个标志是内部动力学重组和快速交换动力学(1–三)这可以通过测量光漂白后的荧光恢复率(FRAP)进行查询。为了研究BRD4和MED1病灶在活细胞中的动力学,我们在内源性标记的mEGFP-BRD4或mEGFP-MED1细胞系上进行了FRAP实验。在光漂白后,mEGFP-BRD4和mEGFP-MED1 punta在秒的时间尺度上恢复荧光(),表观扩散系数约为0.37±0.13μm2/s和0.14±0.04μm2/s、 分别。这些值与之前描述的液相冷凝液组分类似(36,37). ATP通过驱动依赖能量的过程和/或其固有的水滑石活性,参与促进冷凝液流动性(38,39). 葡萄糖剥夺和寡霉素处理导致的细胞ATP耗竭改变了mEGFP-BRD4和mEGFP-MED1病灶光漂白后的荧光恢复,MED1的恢复率降低,BRD4的恢复程度降低(). 这些结果表明,含有BRD4和MED1的点状物在细胞中具有液相性质,与之前描述的相分离凝聚物一致。
BRD4和MED1核点具有生物分子凝聚物预期的特性(A)mEGFP-BRD4工程mESCs的FRAP实验的代表性图像。黄色方框突出显示正在进行目标漂白的点心。(B)mEGFP-BRD4泪点的FRAP数据的量化。t=0s时发生漂白事件。对于漂白区和未漂白对照,绘制了相对于预漂白时间点(t=-4s)的背景荧光强度。数据绘制为平均+/-SEM(N=9)。(C)与(A)mEGFP-MED1工程化mESC细胞相同。(D类)mEGFP-MED1 punta(N=9)的FRAP数据量化,与(B)相同。(E)ATP耗竭后mEGFP-BRD4工程mESCs的FRAP实验的代表性图像。(F类)ATP耗竭后mEGFP-BRD4的FRAP数据定量(N=8),与(B)相同。(G公司)ATP耗竭后mEGFP-MED1工程化mESC细胞的FRAP实验的代表性图像。(H(H))ATP耗竭后mEGFP-MED1点的FRAP数据量化(N=8),与(B)相同。使用蔡司LSM 880共焦显微镜和Airyscan探测器在37°C下拍摄图像,63x物镜。
共激活子puncta和超增强子占用对凝结水扰动很敏感
为了进一步研究BRD4和MED1 punta的生物物理性质,我们研究了它们对1,6-己二醇的敏感性,这是一种已知的破坏液相冷凝液的化合物,推测是通过破坏疏水相互作用(40). 我们发现,用1,6-己二醇处理表达内源性标记mEGFP-BRD4或mEGFP-MED1的mESCs,可以减少BRD4和MED1点的数量().
1,6-己二醇破坏BRD4和MED1 punta,并破坏超增强基因和超增强基因驱动的BRD4、MED1和RNAPII占用。(A)mEGFP-BRD4或mEGP-MED1工程mESCs在3%己二醇治疗15秒前后的代表性图像。(B类)在添加载体或1,6-己二醇至3%的最终浓度之前和之后观察到的mEGFP-BRD4或mEGFP-MED1点的数量的倍数变化的盒图呈现。(C)未经处理或1,6-己二醇处理(1.5%,30分钟)的mESCs的BRD4(蓝色)、MED1(红色)和RNAPII(棕色)ChIP-seq数据的基因组浏览器视图Klf4公司轨迹。(D类)对于被定义为超增强剂(SE)或典型增强剂(TE)的区域,BRD4(蓝色)、MED1(红色)和RNAPII(棕色)ChIP-seq读取密度(1,6-己二醇与未经处理的)中log2折叠变化的方框图表示(参见方法和表S2). (E类)所有活性基因(RPKM>1)、典型增强子相关基因(TE基因)或超增强子关联基因(SE基因)的基因体内(转录起始位点到转录终止位点)RNAPII ChIP-seq密度的log2折叠变化的箱线图表示。(F类)基因集富集分析:根据基因体内RNAPII ChIP-seq密度的log2 fold-change对基因进行排序,并根据超增强子相关基因集进行注释。图中显示了SE相关基因的富集分数分布和位置。
为了确定1,6-己二醇对BRD4、MED1和RNA聚合酶II(RNAPII)在增强子和基因中的占有的影响,在未处理或1,6-己二醇处理的mESCs中用针对这些蛋白质的抗体进行ChIP-seq。结果表明,1,6-己二醇处理导致增强子中所有三种蛋白质的减少,其中最深刻的影响发生在超增强子上(,5安). 例如,在Klf4公司超增强剂,经1,6-己二醇处理后,BRD4水平降低了44%,MED1水平降低了80%,RNA聚合酶II水平降低了56%(). 在全基因组范围内观察到了类似的效果,其中BRD4、MED1和RNAPII在超增强时的减少量明显大于典型增强剂()SE中BRD4和MED1的丢失程度呈正相关(图S5B). 这些结果与BRD4和MED1在对1,6-己二醇敏感的超增强器上形成缩合物的概念一致。
跨基因体的RNAPII占用水平可用于测量转录输出(41). ChIP-seq数据显示,SE中BRD4和MED1占用率的降低与SE相关基因体中RNAPII占用率的丢失有关(、和5安). 当基因根据1,6-己二醇处理后RNAPII丢失的程度进行排序时,在丢失最多RNAPII的基因中,SE相关基因高度富集(). 这些结果与BRD4和MED1缩合物与超增强子相关的观点以及缩合物完整性丧失对转录产生不利影响的观点一致。
BRD4和MED1相分离的本征无序区在体外
BRD4和MED1包含大的内在无序区域(IDR)()并与已知的几种有助于凝结物形成的蛋白质的IDR共享特征(2,三)包括高脯氨酸和谷氨酰胺含量(BRD4)、高丝氨酸含量(MED1)以及酸性和碱性区域。几种参与冷凝液形成的蛋白质的纯化IDR形成相分离液滴在体外(36,37,42,43)因此,我们研究了BRD4或MED1的IDR是否会形成这种液滴在体外纯化重组mEGFP-IDR融合蛋白(BRD4-IDR和MED1-IDR)()添加到含有10%PEG-8000的缓冲液中(参见材料和方法),使溶液变得不透明,而仅含mEGFP的等效溶液仍然保持透明(). 不透明MED1-IDR和BRD4-IDR溶液的荧光显微镜显示GFP阳性的微米级球形液滴在溶液中自由移动(电影S1和S2)落在玻璃盖玻片表面并润湿其表面,此时液滴静止不动(电影S3). 根据长宽比分析,MED1-IDR和BRD4-IDR液滴呈高度球形(图S6A),预计液滴的性质(1–三).
BRD4和MED1相分离的本质无序区(IDRs)在体外(A类)绘制BRD4和MED1内在无序(PONDR VSL2)的图形。显示了PONDR VSL2评分(y轴)和氨基酸位置(x轴)。紫色条表示正在调查的IDR。(B类)此处使用的重组mEGFP融合蛋白示意图。紫色方框表示BRD4(BRD4-IDR)和MED1(MED1-IDR)的IDR,如(A)所示。(C)与液滴形成相关的浊度可视化。显示了在PEG-8000存在(+)或不存在(−)的情况下含有BRD4-IDR(左对)、MED1-IDR(中对)或GFP(右对)的试管。配对之间包括空白管,用于对比。(D类)不同蛋白质浓度下液滴形成的典型图像。将BRD4-IDR、MED1-IDR或mEGFP添加到液滴形成缓冲液中,使其达到所示的最终浓度。(E类)不同盐浓度下液滴形成的典型图像。将BRD4-IDR或MED1-IDR添加到液滴形成缓冲液中,以达到10μM蛋白质浓度,最终NaCl浓度如图所示。(F类)液滴可逆性实验的代表性图像。BRD4-IDR(顶行)或MED1-IDR(底行)BRD4-ID或MED1-IDR,如图所示,(20μM蛋白质,75 mM NaCl)(初始)或随后进行1:1稀释(稀释1/2)或1:1稀释,增加到425mM NaCl-(稀释1/2+NaCl
相分离液滴的大小通常取决于系统中成分的浓度(44). 我们使用不同浓度的BRD4-IDR、MED1-IDR和mEGFP进行了液滴形成分析,浓度范围为0.625μM至20μM。BRD4-IDR和MED1-IDR形成了具有浓度依赖性尺寸分布的液滴,而mEGFP在所有测试条件下都保持扩散(和S6B系列). 尽管这些液滴在较低浓度下较小,但我们在测试的最低浓度(0.625μM)下观察到BRD4-IDR和MED1-IDR液滴(图S6C).
为了研究这些液滴的生物物理特性,我们测试了它们在不同盐浓度下形成液滴的能力(以探测静电相互作用的贡献)或在1,6-己二醇上形成液滴(以探测疏水相互作用的作用)。随着NaCl浓度的增加(从50mM到350mM),BRD4-IDR和MED1-IDR液滴的尺寸分布或不透明度都向较小的液滴移动(,第6d页)或在10%1,6-己二醇中(S7A系列). 这些结果表明,多种分子相互作用有助于BRD4-IDR和MED1-IDR液滴的形成。
接下来,我们试图测试液滴是不可逆的聚集物还是可逆的相分离凝聚物。为此,允许BRD4-IDR和MED1-IDR在初始溶液中形成液滴。然后将蛋白质浓度在等摩尔盐或更高的盐溶液中稀释一半(). BRD4-IDR和MED1-IDR预形成液滴的尺寸和数量随着稀释而减小,甚至随着盐浓度的升高而进一步减小(,图S7B). 这些结果表明,BRD4-IDR和MED1-IDR液滴的尺寸分布取决于系统的条件,一旦形成,就会对系统的变化做出响应,并快速调整尺寸。这些特征是由弱蛋白质相互作用网络形成的相分离凝聚物的特征(1–三).
MED1-IDR参与细胞液液相分离
为了研究辅激活物IDR是否促进细胞内的相分离,我们使用了一种先前开发的方法来控制细胞内的局部蛋白质浓度;这种光IDR分析测试依赖IDR的、光诱导的液滴形成体内(45). 简单地说,光激活的自结合Cry2蛋白被标记为mCherry并融合到感兴趣的IDR。这种融合介导了蓝光诱导的细胞内选定IDR局部浓度的增加()(45). 在该测定中,已知促进相分离的IDR增强了Cry2的光响应聚集特性,导致在蓝光刺激下快速形成液体状球形液滴(46,47). MED1 IDR的一部分与Cry2-mCherry的融合在蓝光刺激下促进了微米级球形液滴的快速形成(optoDroplets)(,第8节). 在蓝光刺激期间,观察到近端液滴融合(和电影S4). 熔融表现出典型的液相熔融特性,即缩颈和松弛成球形(). MED1-IDR液滴在蓝光刺激后持续存在,并且在没有蓝光刺激的情况下表现出类似液体的FRAP恢复率(). 在没有光激活Cry2相互作用的情况下快速FRAP动力学表明,由蓝光建立的MED1-IDR光滴是与稀相交换的动态组装体。
MED1的IDR参与细胞的相分离(A类)optoIDR分析示意图,描绘了在暴露于蓝光的细胞中表达的具有内在无序结构域(紫色)、mCherry(红色)和Cry2(橙色)的重组蛋白。(B类和C)NIH3T3细胞表达(B类)mCherry-Cry2或(C)MED1 IDR的一部分(氨基酸948–1157)融合到mCherry-Cry2(MED1-optoIDR)。每隔2秒对细胞进行一次激光激发,持续指定的时间。(D类)表达MED1光IDR的NIH3T3细胞的细胞核每2秒经受一次激光激发,持续所指示的时间的时间推移图像。在黄色方框突出显示的区域发生熔滴融合事件。(E类)如图所示,(D)中突出显示的液滴融合事件具有更高的分辨率和更长的时间。(F类)MED1-optoIDR optoDroplet(黄色方框)在光漂白之前(左)、期间(中)和之后(右)的图像。蓝色方框突出显示未着色区域以进行比较。指示与光漂白相关的时间(0“)。(G公司)显示了相对于预漂白信号的信号强度(y轴)和相对于光漂白的时间(x轴)。数据显示为平均相对强度±SD(n=15)。(H(H))(F)中突出显示的区域的液滴恢复的时间间隔和特写视图。指示了与光漂白相关的时间。比例尺,1μm。
MED1-IDR中的保守丝氨酸偏压对相分离是必要的
先前的研究表明,液液相分离中蛋白质的低复杂性、内在无序区域(7,36,37,43). 对MED1的氨基酸含量的检查表明,IDR对丝氨酸有显著的成分偏倚(). 有趣的是,这种丝氨酸组成偏差在脊椎动物中是保守的(). 为了研究这种丝氨酸偏倚对MED1 IDR的相分离能力是否必要,我们将所有丝氨酸残基突变为丙氨酸,并研究这种突变的IDR形成相分离液滴的能力在体外在野生型IDR容易形成液滴的条件下,MED1-IDR S-to-A突变体无法形成相分离液滴(),表明MED1-IDR中保守的丝氨酸偏置对于液滴形成是必要的。
MED1-IDR相分离需要保守的丝氨酸偏压(A)MED1蛋白质的氨基酸组成。每行代表一个氨基酸的信息,单字氨基酸代码如右图所示。行的长度对应于MED1蛋白的长度。黑条表示指示氨基酸在MED1中该位置的出现。紫色条代表调查中MED1的IDR。(B类)来自指定生物体的MED1蛋白的丝氨酸组成。如(A)所示。(C)将所有丝氨酸突变为丙氨酸会破坏相分离。野生型MED1-IDR或所有丝氨酸到丙氨酸突变型MED1-IDR(MED1-IDRS-to-A突变型)的代表性图像在液滴形成分析中与mEGFP融合(10uM蛋白质,125mM NaCl,10%Ficoll-400)。
MED1-IDR液滴可以结合转录所需的蛋白质
SE相分离的一个拟议功能是在生物分子冷凝液中分隔和浓缩因子的能力,因此我们试图测试MED1-IDR液滴是否能够重现这种分隔功能在体外我们确定了MED1-IDR可以形成液滴但BRD4-IDR无法形成液滴的条件(图S9). 然后我们研究了MED1-IDR液滴在这些条件下是否能够分隔BRD4-IDR蛋白(). 使用mEGFP或mCherry融合蛋白,我们发现MED1-IDR液滴(mCherry融合)可以掺入并浓缩BRD4-IDR蛋白(mEGFP融合)(). MED1-IDR液滴(mCherry-fuse)中没有mEGFP(). 探测MED1-IDR液滴的近似网格尺寸(48),我们用平均分子量为4kDa、10kDa和40kDa的荧光标记右旋糖酐培养MED1-IDR液滴。我们发现4kDa右旋糖酐被纳入MED1-IDR液滴,10kDa左旋糖酐的纳入效率较低,40kDa的右旋糖聚糖被排除在外(图S10). 这些结果表明,mEGFP-BRD4-IDR(105 kDa)并入MED1-IDR液滴是由于有吸引力的分子相互作用,而不是通过液滴网格的被动扩散。
MED1-IDR液滴分隔并浓缩转录所需的蛋白质(A类)MED1-IDR液滴在体外含有BRD4-IDR蛋白。在含有10%Ficoll-400和125mM NaCl的缓冲液D中以10μM的浓度混合所示的mEGFP或mCherry融合蛋白。显示了每种混合物的指示荧光通道。总结结果的插图如左图所示。(B类)MED1-IDR在含有HeLa细胞核提取物的体外转录反应中形成液滴,而MED1-IDRS-to-A突变体不形成液滴。当以最终浓度3mg/ml添加到含有HeLa细胞核提取物的体外转录反应中时,所示mEGFP-融合蛋白的代表性图像(完整成分列表见材料和方法)。(C)MED1-IDR液滴分隔来自核提取物的转录机制。添加到体外转录反应中的指示蛋白质的颗粒级分的免疫印迹(如在B中)。右图展示了核提取物中MED1-IDR液滴内发生的分子相互作用的拟议模型。(D类)MED1-IDR液滴分隔体外转录反应所需的机械装置。在指定条件下,体外转录反应的放射性标记RNA产物的自动放射自显影。箭头表示预期的RNA产物。按照(69)稍作修改。有关详细信息,请参见材料和方法。右边展示了核提取物中MED1-IDR液滴内发生的分子相互作用的拟议模型及其对体外转录反应的影响。
接下来,我们研究了将MED1-IDR引入转录竞争性核提取物中,是否会形成可能包含BRD4或其他转录组分的液滴。我们发现野生型MED1-IDR而非MED1-IDRS-to-A突变体在这些提取物中形成液滴(). MED1-IDR相分离液滴比周围提取物密度更高,因此可以通过离心从溶液中提纯。免疫印迹分析显示,BRD4和RNAPII的最大亚单位(RPB1)以MED1-IDR剂量依赖性的方式富集在颗粒液滴中(). 这些结果表明MED1-IDR液滴可以合并BRD4和RNAPII。
MED1-IDR蛋白将BRD4和RNAPII纳入人工相分离隔间的能力表明,它隔离了转录装置的关键成分,因此可能用于“抑制”核提取物中的转录。我们对这些提取物进行了体外转录检测,发现野生型MED1-IDR蛋白确实能抑制转录,这与MED1-ICR液滴从溶液中分离出的物质数量有关(). 我们没有在同等浓度的mEGFP或MED1-IDR S-to-A突变体中观察到这些作用(). 这些结果表明,MED1-IDR具有从复杂的核提取物中划分和集中转录机制的能力。
讨论
超增强子(SE)调节在健康和疾病细胞状态中具有显著作用的基因(14,15,19–25,49,50). SE及其组分被提议形成相分离冷凝液(30)但没有直接证据。在这里,我们证明了SE的两个关键成分BRD4和MED1在SE驱动的转录位点形成核浓缩物。在这些缩合物中,BRD4和MED1表现出明显的扩散系数,与之前报道的相分离缩合物其他蛋白质的扩散系数相似体内(36,37). BRD4和MED1的IDR足以形成相分离液滴在体外MED1-IDR有助于活细胞中的相分离。MED1-IDR形成的液滴能够在转录活性核提取物中浓缩转录机制。这些结果支持一种模型,即转录辅激活物形成相分离凝聚物,将转录器分隔并集中在SE调节基因处,并识别可能在相分离中起作用的SE成分。
SE是通过主转录因子(TF)与增强子簇结合而建立的(14,15). 这些TF通常由结构DNA结合域和内在无序转录激活域组成(51–53). 这些TF的激活域招募了许多高密度的转录蛋白,这些转录蛋白作为IDR的富集类(54). 而确切的客户-咖啡关系(55)这些组分之间的相互作用仍然是一个悬而未决的问题,这些蛋白质序列很可能介导弱多价相互作用,从而促进缩合。我们认为,在SE处这种高价因子的浓缩会在分离的密相内形成反应坩埚,在密相中,高浓度的转录机制可确保稳健的基因表达。
染色体的核组织可能受到SE处凝聚物的影响。DNA相互作用技术表明,SE中的单个增强子彼此之间的相互作用频率极高(16–18),与冷凝物将这些元素吸引到致密相中的想法一致。最近的几项研究表明,SE可以相互作用,也可能以这种方式促进染色体组织(56,57). 凝集素是染色体(SMC)蛋白质复合体的一种结构维持蛋白,它的缺失导致了核内SE的广泛融合,因此被认为是限制SE-SE相互作用的因素(57). 这些SE-SE相互作用可能是由于液相冷凝物倾向于熔融(1–三).
辅活化子的相分离将转录器分隔并集中在SE及其调控基因上的模型提出了许多问题。凝缩如何促进转录输出的调节?RNAPII簇可能是相分离的凝聚体,研究表明凝聚体寿命和转录输出之间存在正相关(58). 哪些成分驱动转录缩合物的形成和溶解?我们的研究表明,BRD4和MED1可能参与其中,但DNA-结合TF、RNAPII和调控RNA的作用需要进一步研究。为什么一些蛋白质,如HP1a,有助于形成相分离异染色质凝聚物(59,60)以及其他促成常染色凝聚物的因素?已经开始了研究,以剖析控制特定类型冷凝物划分的规则(61–65)并且需要定义参与转录缩合物的蛋白质。冷凝液失调是否会导致疾病的病理过程,对冷凝液行为的新认识是否会为治疗提供新的机会?IDR内的突变和相分离的错误调节已经牵涉到许多神经退行性疾病(66–68). 肿瘤细胞在驱动癌基因处有非常大的SE,而这些SE在其来源细胞中没有发现,其中一些对靶向SE成分的药物特别敏感(22–25). 我们如何利用物理和化学中建立的相分离原理来更有效地提高我们对这种调控生物学形式的理解?在物理、化学和生物的十字路口解决这些问题需要这些不同科学之间的合作。
致谢:
我们感谢W.M Keck显微镜设备的Wendy Salmon;哈佛生物成像中心的Douglas Richardson和Sven Terclavers;Whitehead Genome Technologies Core的Tom Volkert、David Reynolds、Stephen Mraz和Sumeet Gupta负责技术援助,Broad Institute的成像平台负责CellProfiler援助。
基金:这项工作得到了NIH拨款GM123511(R.A.Y.)和P01-CA042063(P.A.S.)、NSF拨款PHY-1743900(A.K.C.、R.A.Y、P.A.S.)、NCI(P.A.S)科赫研究所支持(核心)拨款(P30-CA14051)、Damon Runyon癌症研究基金会奖学金(2309-17)(B.R.S.),瑞典研究委员会博士后奖学金(VR 2017-00372)(A.B.),癌症研究奖学金希望基金(B.J.A.)、NSF研究生研究奖学金(A.V.Z.)、癌症研究所欧文顿奖学金(Y.E.G.)、美国癌症学会新英格兰分部博士后奖学金PF-16–146-01-DMC(D.S.D.)和NWO Rubicon奖学金(J.S.)。作者贡献:B.R.S.和A.D.对项目进行了概念化和组织化,并撰写了手稿。A.D.、A.B.、J.C.M.和Y.E.G进行了细胞成像实验和图像分析。I.A.K.和A.V.Z.产生了内源性标记细胞系。B.R.S.和A.B.执行了ChIP-Seq。执行B.R.S.和E.L.C在体外液滴分析和光IDR实验。K.S.和B.J.A.开发并执行图像分析,并制作可视化效果。B.J.A.制作了ChIP-seq分析和可视化。N.M.H.生产并纯化重组蛋白。A.V.Z.帮助进行生化实验。C.H.L.进行蛋白质氨基酸分析。D.S.D.进行了ChIA-PET分析和可视化。B.R.S.、I.A.K、E.L.C.、J.S.和A.V.Z.生成的构造。执行S.M在体外转录分析。D.H.、E.V.、T.I.L.、I.I.C.、R.G.R、P.A.S.、A.K.C.和R.A.Y.为实验设计和解释提供了输入。P.A.S.、A.K.C.和R.A.Y.获得了本研究的资金。T.I.L.和A.K.C.帮助监督该项目。R.A.Y.对项目进行了概念化、组织和监督,并撰写了手稿。所有作者都对编辑手稿作出了贡献。竞争利益:怀特黑德研究所根据这篇论文提出了专利申请。R.A.Y.是Syros Pharmaceuticals、Camp4 Therapeutics和Omega Therapeunics的创始人和股东。B.J.A.和T.I.L是Syros Pharmaceuticals的股东,T.I.L.是Camp4 Therapeutics的顾问。所有其他作者均声明没有相互竞争的利益。数据和材料可用性:本研究中生成的数据集已以登录号保存在基因表达总览中{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE112808”,“term_id”:“112808”}}GSE112808标准.
补充资料
材料和方法
表S1至S3
图S1至S10
参考文献70–82
电影S1到S4
一句话总结:相分离的缩合物在关键的细胞身份基因处划分转录装置。
参考文献和注释:
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