瞄准ASCT2型介导的谷氨酰胺摄取阻止前列腺癌生长和肿瘤发展

患者标本

前列腺癌根治术标本(n个= 194）从温哥华前列腺中心组织库获得(http://www.prostatecentre.com/our研究/核心设施/生物储存). 该项目得到了不列颠哥伦比亚大学（加拿大温哥华）和CHUQ研究中心（加拿大魁北克省）机构审查委员会的批准。获得了所有参与者的书面知情同意。回顾了苏木精和伊红（H&E）染色的载玻片，并在石蜡块上确定了所需的区域。组织微阵列（TMA）是手动构建的（Beecher Instruments，MD，USA），通过对每个样品冲压1mm的重复核心，并根据单个核心（单个Gleason评分）或重复核心的平均值（NHT TMA分析）计算定量分析。

TMA公司免疫组织化学

TMA染色使用Ventana自动染色器Discover XT™型号，酶标记生物素-链霉亲和素系统和耐溶剂DAB Map试剂盒，使用1:4000稀释的兔抗-SLC1A5（HPA035240）进行。病理学家（LF）采用半定量四点评分法对染色进行分级，其中0表示无染色，1表示微弱或局部染色，2表示至少四分之一的肿瘤细胞呈中等强度，3表示大多数肿瘤细胞呈强染色。染色示例如图S1B所示（见补充材料）。

细胞培养和摄取分析

人类前列腺癌细胞系LNCaP-FGC、PC-3和DU145购自ATCC（美国马里兰州罗克维尔）。LNCaP细胞直接从原始低传代株传代（2009年），我们于2010年和2014年通过STR分析确认了PC-3、LNCaP和DU145细胞的身份（悉尼Cellbank）。细胞在含有10%v/v胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液和1 m米丙酮酸钠。细胞在含有5%CO的大气中保持在37°C₂化学物质稀释如下，对照孔用适当的溶媒对照物处理：H‐Ser（Bzl）‐OH（BenSer；Bachem；在H中稀释₂O） ；l‐γ‐谷氨酰‐第页‐硝基苯胺（GPNA；MP生化制剂；H稀释₂O） ；比卡鲁胺（阿斯利康；在二甲基亚砜中稀释）。[^三H] ‐我亮氨酸和[^三H] ‐我按照之前的详细说明进行谷氨酰胺摄取分析18,32.

击倒ASCT2型

ASCT2 shRNA敲除如前所述18在本研究中使用了两种不同的ASCT2 shRNA（Sigma）：shASCT2#1（CCGGGCTGCTTATCCGCTTCTTCAACTCGAGTTGAAGAGCGGATAAGCAGCTTTTTG）和shASCT2#2（CCGGCTGGATTATGAGGAATGGATACTCGA GTATCCATTCCATCATCATCATATCCAGTTTTTG）。

基因表达分析

将PC‐3细胞在有或无GPNA或BenSer的条件下培养48小时，收集细胞并使用Trizol提取总RNA。在安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司）上使用RNA 6000纳米芯片确认RNA质量（RIN值9.8-10）。使用TruSeq Straded Total RNA试剂盒（Illumina，San Diego，CA，USA）制备文库，并在Kinghorn癌症中心（悉尼）对Illuminia HiSeq 2500进行配对末端测序。使用默认设置的Tophat2对末端RNA测序读数进行修剪并映射到带注释的人类基因组（hg19/GRCh37.p13）。对于每一个基因，读取的数量被计算出来，并根据库大小进行标准化。在至少一个实验组中，表达阈值设置为五次读取。采用精确测试来比较治疗组和未治疗组之间四个重复的读取计数平均值的差异。基因表达水平为估计计数/百万读（CPM）。本研究中描述的国家生物技术信息中心mRNA测序数据集的基因表达总括数为GSE65112。

个人计算机‐3–luc异种移植物和生物发光成像

Athymic公司(数值/数值)根据悉尼大学动物伦理委员会的指导方针，将6-8周龄的雄性裸鼠（澳大利亚珀斯动物资源中心）饲养在一个特定的无病原体设施中。小鼠通过2%异氟醚吸入麻醉，并接受皮下注射1×10⁶将PC-3-luc细胞重悬于100 ml Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。如前所述，将异种移植物移植到小鼠的左右腹侧翼30细胞植入48小时后通过生物发光成像监测肿瘤生长，此后每两周进行一次，持续32天。在实验期间，两只shASCT2小鼠在注射后4天因打斗而死亡；他们没有包括在分析中。麻醉小鼠腹腔注射d日荧光素底物（DPBS中150 mg/kg；Gold Biotechnology），并在间隔15分钟后使用Xenogen获取图像体内成像系统（IVIS）Lumina II（Caliper Life Science，MA，USA）。使用Living Image软件（Caliper Life Science）确定感兴趣区域，并以光子/秒（p/s）为单位进行量化。32天后，在最终成像时间点后处死动物。切除肝和肺进行IVIS‐Lumina II分析，以检测自发转移。在成像和称重后，将肿瘤收集在Trizol中进行RNA分析或裂解缓冲液中进行western blotting分析，或固定在10%v/v中性缓冲福尔马林中进行切片和免疫染色。

抑制ASCT2型抑制前列腺癌细胞生长

ASCT2蛋白的分析显示，LNCaP和PC-3细胞中都有高表达，DU145细胞中检测到的水平较低（图​（图2A）。2A） ●●●●。添加ASCT2竞争抑制剂苄基丝氨酸（BenSer；参见补充材料，图S2A）25显著降低LNCaP、PC-3和DU145细胞中谷氨酰胺和亮氨酸的摄取（图​（图2B，2B、 C）。谷氨酰胺与亮氨酸的交换导致亮氨酸摄取受到抑制我型氨基酸转运蛋白1（LAT1；SLC7A5），但也可能通过直接抑制LAT115比卡鲁胺对雄激素受体信号传导的抑制也显著降低了雄激素敏感的LNCaP细胞的谷氨酰胺摄取，但没有降低雄激素不敏感的PC-3细胞的谷氨酰胺摄取（见补充材料，图S2B，C），证实AR信号传导调节ASCT2水平23和ASCT2介导的谷氨酰胺转运。使用BenSer治疗3天后，LNCaP、PC-3和DU145细胞的细胞生长显著下降（图​（图2D）。2D） ●●●●。我们之前已经证明，LAT1抑制通过E2F调节的细胞周期蛋白CDK1、CDC20和UBE2C影响细胞周期23这三种细胞周期调节蛋白在前列腺癌转移中也显著增加23CDK1、CDC20和UBE2C在BenSer治疗后表达降低（图​（图22E） ●●●●。

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图2

抑制前列腺癌细胞系中ASCT2介导的谷氨酰胺转运。（A） 通过western blotting在LNCaP、PC-3和DU145细胞系中检测ASCT2蛋白。（B，C）BenSer的影响（10 m米)对LNCaP、PC-3和DU145细胞系中谷氨酰胺（B）和亮氨酸（C）的转运进行了评估。（D） 在BenSer存在下检测LNCaP、PC-3和DU145的细胞生长。（E） 通过western blotting检测BenSer存在下LNCaP和PC-3细胞中CDK1、CDC20和UBE2C的表达。（F） BenSer或GPNA处理2小时后，分析LNCaP和PC-3细胞中mTORC1途径激活（p‐p70S6K）。（B，C）数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3); 采用Mann-Whitney U检验分析数据。（D） 数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3); 数据分析采用双向方差分析；^*第页< 0.05,^** 第页 < 0.01,^*** 第页 < 0.001

抑制ASCT2型抑制前列腺癌中的谷氨酰胺代谢

由于亮氨酸和谷氨酰胺参与mTORC1信号的激活14,26,27，我们检测了mTORC1下游靶点p70S6K的T389磷酸化。BenSer在PC-3细胞中降低了p70S6K的磷酸化，但在LNCaP细胞中没有（图​（图2F）。2F） ●●●●。使用另一种ASCT2抑制剂，l‐γ‐谷氨酰‐第页硝基苯胺（GPNA；参见补充材料，图S2D）28，证实谷氨酰胺剥夺抑制PC-3细胞中的mTORC1途径，但不抑制LNCaP细胞（图​（图2F）。2F） ●●●●。这些数据表明，除mTORC1外，其他机制也有助于调节前列腺癌细胞生长。

大多数细胞内谷氨酰胺被转化为谷氨酸，谷氨酸可被TCA循环用于ATP和脂肪酸的生成，或通过xCT（SLC7A11）从细胞中输出以交换胱氨酸，从而促进谷胱甘肽的生成和抗氧化应激。或者，谷氨酰胺作为大分子合成的氮和碳供体，包括核苷酸和非必需氨基酸/蛋白质。因此，我们着手确定细胞内谷氨酰胺的变化如何影响这些下游途径。与LNCaP和PC-3细胞中的对照组相比，使用Seahorse通量分析仪、BenSer或GPNA处理导致基础耗氧率（OCR）降低（参见补充材料，图S2E，F）。GPNA（而非BenSer）显著降低LNCaP和PC-3细胞的基础OCR（图​（图3A，三A、 B）。然而，OCR的降低似乎并不是谷氨酰胺使用的直接结果，因为氧化的OCR没有显著降低¹⁴BenSer或GPNA后细胞系中的C-标记谷氨酰胺（图​（图3C，三C、 D），尽管更低¹⁴C-谷氨酰胺摄取（参见补充材料，图S2G，H）。然而，LNCaP细胞中谷氨酰胺的脂质合成显著减少（图​（图3E），三E） ，但不在PC-3电池中（图​（图3F）。三F） ●●●●。这些数据表明LNCaP细胞直接利用谷氨酰胺合成脂肪酸，而PC-3细胞可能利用谷氨酰胺进行其他途径，包括交换亮氨酸（图​（图2C）2C） 激活mTORC1信号（图​（图2F），2F） 间接影响线粒体呼吸。

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图3

抑制ASCT2影响LNCaP和PC-3细胞的细胞代谢。（A，B）使用SeaHorse XF分析仪分析用BenSer（10 m）预处理的LNCaP（A）和PC-3（B）细胞的基本耗氧率（OCR）米)或GPNA（1米米). （C、D）¹⁴一氧化碳₂用BenSer（10 m）处理LNCaP（C）和PC-3（D）细胞后，测定谷氨酰胺生成量米)或GPNA（1米米). 用BenSer（10 m）处理LNCaP（E）和PC-3（F）细胞后，分析谷氨酰胺生成的脂质米)或GPNA（1米米). （G–J）用BenSer（10 m米)，GPNA（1米米)或TOFA（10µ米). 用BenSer、GPNA或TOFA处理LNCaP（K）和PC-3（L）细胞后，测量（K，L）脂滴。（A–F）数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3); 采用单因素方差分析对数据进行分析。（G–L）数据为平均值±SEM(n个 ≈ 300个单元格）；采用单因素方差分析进行数据分析；^*第页< 0.05,^** 第页 < 0.01,^*** 第页 < 0.001

为了进一步研究脂质稳态，我们测量了细胞磷脂和中性脂质的水平。LNCaP细胞的脂质含量分析表明，GPNA显著降低了磷脂的细胞水平（图​（图3G）三G） BenSer和GPNA降低了中性脂质（图​（图3I）三一） 以及脂滴数（图​（图3K）。三K） ●●●●。值得注意的是，BenSer和GPNA的抑制程度与抑制脂肪酸合成速率限制酶乙酰辅酶A羧化酶（图​（图3G，三G、 I、K）。在PC-3细胞中也观察到磷脂的显著减少（图​（图3H）；三H） ；然而，中性脂质没有显著下降（图​（图3J）三J） 或脂滴数量（图​（图3L）。三五十） ●●●●。综上所述，ASCT2的药理抑制激发了作为燃料来源的谷氨酰胺流量的细胞系特异性效应，但最终导致两种前列腺癌细胞系的OCR和细胞脂质水平降低。然而，BenSer和GPNA均未导致活性氧物种水平增加（ROS；参见补充材料，图S2I）。

全球影响BenSer公司或全球行动计划抑制个人计算机‐3个电池

为了确定ASCT2抑制的整体效应，我们使用下一代测序来确定BenSer或GPNA处理48小时后PC-3细胞的mRNA表达变化(第页< 0.05）与对照组相比，GPNA上调或下调（见补充材料，表S1）显示与BenSer基因表达有显著重叠（上调，45.1%；下调，49.7%），突出了ASCT2的共同靶点（图​（图4A）。4A） ●●●●。BenSer似乎具有额外的非ASCT2介导的影响，与GPNA相比，更多的基因表现出显著的上调和下调（参见补充材料，表S2）（图​（图4A）。4A） ●●●●。这并不奇怪，因为BenSer已被证明在卵母细胞中抑制ASCT2和LAT1功能18.

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图4

用BenSer或GPNA处理的PC-3细胞的RNA‐seq分析。（A） BenSer和GPNA治疗组中上调或下调基因的维恩图。（B，C）对照组与GPNA（1 m）中基因本体类别RNA处理和细胞周期过程的基因集富集分析（GSEA）图米; B） 或BenSer（10米米; C） 治疗。对照组E2F转录因子基序基因集与GPNA（1 m）的（D，E）GSEA图米; D） 或BenSer（10米米; E） 治疗。BCH下调基因集的（F，G）GSEA图（来自23)对照GPNA（1 m米; F） 或BenSer（10米米; G） 治疗组

与GPNA相比，使用基因本体分类的基因集富集分析（GSEA）在RNA、DNA处理和代谢以及细胞周期过程中显示出显著的对照富集（图​（图4B；4B；另见补充材料，表S3）。与BenSer相比，对照组中也富集了类似类别（图​（图4C；4C类；另见补充材料，表S4）。与GPNA或BenSer相比，GSEA对基序富集的分析表明与E2F转录因子基序有显著的相关性（图​（图4D，4D、 E；另见补充材料，表S5、S6）。我们之前已经证明，LNCaP细胞对亮氨酸摄取的抑制显示出类似的E2F介导的细胞周期抑制，122个基因的子集被亮氨酸摄取抑制剂BCH下调23对对照组与GPNA和BenSer的122基因特征的分析表明，对照组中的122基因富集（图​（图4F，4F、 G），提示前列腺癌中亮氨酸饥饿和谷氨酰胺饥饿后存在共同的基因表达调控机制。

氨基酸饥饿导致应激反应转录因子ATF4上调，进而导致多种氨基酸转运蛋白的表达增加，包括ASCT2和LAT123.ATF4是第一个(第页= 1.10E‐11）和十六(第页= 4.21E‐21）分别在GPNA或BenSer处理的细胞中最显著上调的基因（见补充材料，表S1和S2），这通过RT–qPCR进行了验证（见补充材料，图S3A，B）。ATF4先前已被证明直接转录调节转运体的表达，包括ASCT2、ASCT1、xCT和SLC3A223,29对GPNA抑制后调节的基因组的分析表明，基因本体分类显著丰富，包括氨基酸转运（参见补充材料，图S3C），转运体显著上调，包括SLC1A5（ASCT2，第页= 0.020），SLC1A4（ASCT1；第页= 7.72E‐5），SLC7A11（xCT；第页= 7.02E-8）、SLC38A1（SNAT1；第页= 3.51E‐5），SLC7A8（LAT2；第页= 5.63E‐5），SLC3A2（4F2hc；第页= 0.041）和SLC3A1(第页= 0.005). 另一个关键基因被两种GPNA显著增加(第页= 0.009）和BenSer(第页= 0.0002）是EIF2AK3（PERK），它可以磷酸化eIF2α，导致全局蛋白质合成抑制。一组属于真核翻译起始因子的基因在GPNA处理后显著减少，包括EIF3B(对= 0.0003），EIF2A(第页= 0.003），EIF4H(第页= 0.005），EIF5A(第页= 0.009），EIF2B3(第页= 0.034），EIF4G1(第页= 0.039），EIF2B4(第页= 0.040）和EIF2B5(第页= 0.048).

击倒ASCT2型抑制前列腺癌细胞的生长

我们使用慢病毒shRNA介导的ASCT2敲除来证实BenSer和GPNA在LNCaP和PC-3细胞中的直接ASCT2效应。与非靶向shRNA对照组相比，两种不同的shRNA降低了LNCaP和PC-3细胞中ASCT2的表达和谷氨酰胺转运（图​（图5A，5A、 B类；另请参见补充材料，图S3D）。使用shASCT2#2的抑制也显著降低LNCaP和PC-3细胞的亮氨酸摄取（图​（图5C），5C） 表明ASCT2转运的谷氨酰胺被用于亮氨酸摄取。

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图5

前列腺癌细胞增殖需要ASCT2。（A） 使用shASCT2#1或shASCT2#2分析LNCAP或PC-3细胞中shRNA敲除后的ASCT2蛋白。（B，C）shASCT2敲除后LNCaP或PC-3细胞摄取谷氨酰胺（B）或亮氨酸（C）的分析。用MTT法分析shASCT2#2敲除后（D，E）LNCaP（D）和PC-3（E）细胞的生长。（F，G）在PC-3细胞中shASCT2#2敲除后，分析细胞周期进展（BrdU掺入；F）和mTORC1途径激活（p‐p70S6K；G）。（B、C、F）数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3); 采用Mann-Whitney U检验分析数据。（D，E）数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3); 采用双向方差分析评估显著性；^*第页< 0.05,^** 第页 < 0.01,^*** 第页 < 0.001

与shControl细胞相比，表达shASCT2#2的LNCaP和PC-3细胞的细胞活力显著降低（图​（图5D，5D、 E）。BrdU合并分析（图​（图5F）5F） shASCT2#2表达的PC-3细胞中的凋亡（参见补充材料，图S3E）证实ASCT2敲除抑制细胞周期而非凋亡。在shASCT2#1 PC-3细胞中也观察到谷氨酰胺摄取、BrdU掺入和凋亡的类似结果（参见补充材料，图S3D，F，G）。最后，我们通过western blotting检测了mTORC1途径的激活，显示表达shASCT2#2的PC-3细胞中p70S6K磷酸化降低（图​（图55G） ●●●●。

我们感谢百年研究所流式细胞术支持中心的Frank Kao对细胞进行分类。我们感谢Kinghorn癌症中心的文库准备和下一代测序工作。本研究得到了Movember通过澳大利亚前列腺癌基金会（YI0813号拨款，QW，PG2910至JH，YI0707至JH）以及澳大利亚Movember针对晚期前列腺癌的革命团队奖（JH，QW、MCS、CCN和ML）、国家乳腺癌基金会的资助（ECF‐12‐05号拨款，JH），国家卫生和医学研究委员会（授予JH的1051820号拨款）、治愈未来和一个匿名基金会（授予JEJR）；巡回治疗奖学金（CGB）和新南威尔士州癌症研究所（JJLW和WR奖学金）。