Curcumin ameliorates neuropathic pain by down-regulating spinal IL-1β via suppressing astroglial NALP1 inflammasome and JAK2-STAT3 signalling

Shenbin Liu; Qian Li; Meng-Ting Zhang; Qi-Liang Mao-Ying; Lang-Yue Hu; Gen-Cheng Wu; Wen-Li Mi; Yan-Qing Wang

doi:10.1038/srep28956

科学代表。2016; 6: 28956.

2016年7月6日在线发布。数字对象标识：10.1038/srep28956

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PMID：27381056

姜黄素通过抑制星形胶质细胞NALP1炎性体和JAK2-STAT3信号，下调脊髓IL-1β，从而改善神经病理性疼痛

刘申斌,^1,^* 钱丽,^1,^* 张梦婷,¹ 齐梁茂英,¹ 琅琊湖,¹ 吴根成,¹ 文丽美,^a、，¹和王燕青（Yan-Qing Wang）^b、，¹

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摘要

姜黄素在许多疾病中具有很强的抗炎活性。已经证明，janus激酶2（JAK2）-信号转导子和转录激活子3（STAT3）级联和富含NAcht亮氨酸重复蛋白1（NALP1）炎症小体对于前白细胞介素（IL）-1β的合成和将无活性蛋白加工成其成熟形式是重要的，在神经病理性疼痛的发病机制中起积极作用。本研究表明，反复腹腔注射姜黄素可以剂量依赖性地改善SNI诱导的机械性和冷性痛觉超敏反应，并抑制脊髓成熟IL-1β蛋白水平的升高。此外，反复姜黄素治疗显著抑制脊髓星形胶质细胞中NALP1炎性体的聚集和JAK2-STAT3级联的激活。此外，NALP1 siRNA对NALP1炎性体激活的基因下调和AG490对JAK2-STAT3级联的药理抑制分别显著抑制了IL-1β成熟和Pro-IL-1β合成，并降低了SNI诱导的疼痛超敏反应。我们的结果表明，姜黄素通过抑制NALP1炎性体的聚集和星形胶质细胞中JAK2-STAT3级联的激活，减轻神经病理性疼痛并下调脊髓成熟IL-1β的生成。

姜黄素，从根茎中提取的主要成分姜黄几百年来，它一直被人类作为咖喱香料食用。由于姜黄素具有较强的抗炎活性并抑制炎性细胞因子的产生，因此姜黄素被用于治疗中枢神经系统（CNS）的各种神经炎症和神经变性疾病，如阿尔茨海默病、抑郁症和糖尿病神经病变¹最近，一些研究表明姜黄素在神经病理性疼痛和炎症疼痛中具有抗伤害作用²^,三然而，其确切的作用机制尚不完全清楚。

白细胞介素（IL）-1β作为一种重要的促炎细胞因子，已被证明积极参与神经病理性疼痛的发病机制，并在疾病过程中诱导继发性损伤级联⁴先前的研究表明，外源性鞘内注射IL-1β可诱导明显的疼痛行为⁵而脊髓IL-1β信号传导的阻断缓解了神经损伤引起的神经病理性疼痛⁶支持脊髓IL-1β在神经病理性疼痛发生中的关键作用。最近的研究表明，姜黄素是一种高度多效性的分子，与许多分子靶点相互作用⁷然而，姜黄素对神经病理性疼痛时脊髓IL-1β生成的影响尚不清楚。

提出了一个双信号模型来解释IL-1β生成的调节⁸^,9^,10一个信号是Pro-IL-1β基因的表达，该基因通过Toll样受体配体诱导细胞信号通路（例如JAK2-STAT3通路）介导，而第二个信号涉及炎症小体寡聚化（例如NAcht亮氨酸丰富重复蛋白1（NALP1）炎症红细胞），这导致caspase-1依赖性的Pro-IL-1β裂解和生物活性成熟IL-1β的释放。我们之前的研究报道，由NALP1蛋白、胱天蛋白酶-1和含有胱天蛋白酶激活募集结构域（ASC）的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白组成的脊髓NALP1炎症小体可能参与IL-1β的成熟，并有助于神经性疼痛的发展¹¹这些结果使我们质疑IL-1β和NALP1炎症小体是否对姜黄素的镇痛作用负责。

本研究旨在确定姜黄素反复治疗对备用神经损伤（SNI）诱导的神经病理性疼痛的影响，并探讨姜黄素刺激小鼠脊髓中产生生物活性成熟IL-1β的机制。我们目前的研究首次证明姜黄素能有效抑制JAK2-STAT3级联和NALP1炎性体。这样可以抑制Pro-IL-1β的表达和IL-1β的成熟，从而控制神经病理性疼痛。

结果

反复腹腔注射姜黄素对SNI小鼠机械和冷超敏反应的影响

通过测量冯·弗雷试验（机械性痛觉超敏）中的爪子撤退阈值和丙酮试验中爪子抬起/舔的持续时间（冷痛觉超敏感），可以检查小鼠的神经病理性疼痛¹²^,13在SNI后用载体（20%二甲基亚砜）处理7天的小鼠中，观察到机械阈值显著降低，提升/舔舔持续时间增加，表明SNI诱导的持续机械和冷超敏反应(图1A、B). 为了检查姜黄素的镇痛效果，从术后第1天到第7天，每天两次腹腔注射不同剂量的姜黄素或载体（SNI和Sham）。如所示图1A、B姜黄素反复治疗有效且剂量依赖性地缓解了SNI诱导的疼痛超敏反应。用于机械性痛觉超敏(图1A)，双向方差分析显示治疗（F_3,196 = 36.79和P<0.001），时间（F_7,196 = 59.80和P<0.001），以及时间×治疗（F_21,196 = 9.57，P＜0.001）。Bonferroni事后测试表明，120 mg/kg剂量的姜黄素不会影响第一天的拔爪阈值。然而，机械性超敏反应在第3天出现减弱，并持续到SNI后第7天。姜黄素60 mg/kg降低了SNI后第5天到第7天SNI诱导的机械性超敏反应(图1A). 姜黄素还减弱了SNI诱导的冷超敏反应(图1B，治疗，F_3,196 = 65.98，P<0.001；时间，F_7,196 = 68.34，P<0.001；和时间×治疗，F_21,196 = 10.30和P<0.01）。Bonferroni事后测试表明，120 mg/kg剂量的姜黄素可逆转SNI后第3天至第7天引起的冷痛觉超敏反应。60 mg/kg剂量的姜黄素还可减少SNI诱导的第5天到第7天的冷痛觉超敏反应(图1B). 最低剂量的姜黄素（30 mg/kg）在任何时间点都不会显著影响机械性和冷性痛觉超敏(图1A、B).

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图1

姜黄素对SNI诱导的神经病理性疼痛的抗痛觉超敏作用。

显示冯-弗雷试验中机械撤回阈值变化的时间进程(A类)以及丙酮试验中提起/舔舐的持续时间(B类)在用载体（20%DMSO）或姜黄素（30mg/kg、60mg/kg或120mg/kg）长期腹膜内（i.p）处理的小鼠的同侧后爪中。SNI后第1天开始治疗，每天两次，直到第7天*与DMSO治疗组相比，p<0.05和**p<0.01；双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试；n=每组8个。(C、 D类)姜黄素治疗（120 mg/kg，i.p）对SNI小鼠机械或冷刺激反应的影响。重复治疗7天后停止给药载体或姜黄素*与DMSO组相比，p<0.05和**p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组8个。Cur=姜黄素。所有数据均显示为平均值±标准误差（SEM）。

我们还评估了停止重复姜黄素治疗对痛阈的影响。如所示图1C、D当姜黄素在治疗7天后停止给药时，抗伤害性作用至少再维持两天，但随后SNI小鼠的机械性和冷性异常性疼痛复发。

总的来说，这些数据表明，反复姜黄素治疗可以减轻SNI诱导的神经病理性疼痛后的机械性和冷性超敏反应。

姜黄素反复治疗对SNI小鼠脊髓Pro-IL-1β生成和IL-1β成熟的影响

新的证据表明，神经损伤引起的脊髓神经炎症和免疫反应导致促炎细胞因子上调，从而导致神经性疼痛的发生¹⁴许多研究报告称，关键的脊髓前炎症细胞因子IL-1β有助于神经病理性疼痛的发生和维持¹⁵为了评估姜黄素对神经病理性疼痛引起的脊髓IL-1β生成的影响，我们在对SNI小鼠重复姜黄素（静脉注射，120 mg/kg，术后第1天至第7天每天两次）治疗后的第7天，研究了IL-1β的表达。Western blotting显示脊髓Pro-IL-1β上调（单向方差分析，F_3,12 = 4.86，p<0.05）和成熟IL-1β（mIL-1β）（单向方差分析，F_3,12 = SNI后7天，与DMSO处理的小鼠相比，姜黄素处理的小鼠中5.56，p<0.05）显著减少(图2A、B). 免疫荧光结果还显示，与Sham+DMSO组相比，IL-1β免疫反应性（IR）和GFAP-IR的强度以及IL-1β的数量⁺/GFAP公司⁺SNI小鼠脊髓中的细胞显著增加，而姜黄素治疗显著抑制了这些上调(图2C-E). 这些结果表明，反复姜黄素治疗降低了脊髓Pro-IL-1β的可用性和IL-1β的成熟度。

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图2

反复姜黄素（120 mg/kg，i.p）治疗对SNI小鼠脊髓IL-1β表达的影响。

(A类)Western blot显示SNI或假手术后第7天重复DMSO或姜黄素治疗小鼠脊髓中Pro-IL-1β和成熟IL-1β（mIL-1β）的表达。图中使用了裁剪凝胶/印迹，免疫印迹是从在相同实验条件下运行的微凝胶中获得的。(B类)Pro-IL-1β和mIL-1β带的定量**与假手术+DMSO组相比p＜0.01；^#与SNI+DMSO组相比，p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组4个。(C类)假手术和SNI手术后第7天，重复DMSO和姜黄素处理的小鼠脊髓背角IL-1β和GFAP双重染色。箭头指示双标签单元格。(D类)浅背角（I–III层）IL-1β和GFAP染色强度*与Sham+DMSO组相比，p<0.05；_#与SNI+DMSO组相比p<0.05；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。(F类)IL-1β的数量⁺/GFAP公司⁺浅背角（第一层至第三层）的双标记细胞*与Sham+DMSO组相比，p<0.05；^#与SNI+DMSO组相比p<0.05；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。比例尺=50μm。

脊髓NALP1在SNI诱导的神经病理性疼痛和IL-1β成熟中的作用

为了进一步研究NALP1炎性体在疼痛调节中的潜在作用，我们研究了脊髓NALP1（NALP1炎症体的支架蛋白）在SNI诱导的神经病理性疼痛中的作用。与打乱的对照siRNA相比，从第3天到第7天在SNI小鼠脊髓内注射靶向NALP1的小干扰RNA（siRNA）显著降低了NALP1蛋白水平（学生t吨-经检验，t=4.11，p<0.01；图3A). 与打乱siRNA处理的小鼠相比，NALP1 siRNA处理小鼠的Von Frey试验中的爪子撤退阈值显著增加，丙酮试验中爪子抬起/舔的持续时间显著缩短(图3B，C). 然而，以NALP1为靶点的siRNA对Von Frey和丙酮试验中假小鼠的基础反应没有影响（p>0.05，图3B，C). Western blotting显示，与打乱siRNA组相比，NALP1 siRNA处理的SNI小鼠的成熟IL-1β水平也显著降低（单向方差分析，F_3,12 = 4.69，p<0.05，图3D，E). 因此，内源性脊髓NALP1可能通过加速IL-1β成熟和伤害性传递，促进对神经病理性疼痛的反应。

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图3

脊髓NALP1在SNI诱导的神经病理性疼痛中的作用。

(A类)免疫印迹显示，针对NALP1的小干扰RNA（siRNA）（5μg），而非干扰对照（scrambled），降低了行为分析后第7天SNI小鼠脊髓中的NALP1蛋白水平。图中使用了裁剪凝胶/印迹，免疫印迹是从在相同实验条件下运行的微凝胶中获得的**p<0.01；学生t检验；n=每组4个。(B、 C)NALP1 siRNA对SNI诱导的机械性和冷性痛觉超敏反应影响的时间进程。在SNI后的第3天到第7天，反复鞘内注射靶向NALP1（5μg）的siRNA，但不刺激siRNA，有助于从SNI诱导的机械性和冷性痛觉超敏中恢复。siRNA给药对假小鼠的机械阈值和提升潜伏期基线没有影响*与SNI+加扰组相比，p<0.05和**p<0.01；双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试；n=每组8个。(D类)5μg NALP1 siRNA（而非干扰siRNA）可显著逆转SNI诱导的成熟IL-1β的上调，这一上调通过western blotting检测得出。图中使用了裁剪凝胶/印迹，免疫印迹是从在相同实验条件下运行的微凝胶中获得的**p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组4个。所有数据均显示为平均值±SEM。

姜黄素对SNI诱导的脊髓NALP1炎性体聚集的影响

为了评估NALP1炎症小体胱天蛋白酶1平台是否参与姜黄素对IL-1β成熟的抑制，我们观察了姜黄素治疗后NALP1炎症小体成分的变化：支架蛋白NALP1、衔接蛋白ASC和效应蛋白胱天蛋白酶1。反复服用120 mg/kg姜黄素的SNI小鼠显示上调的NALP1减少（单向方差分析，F_3,12 = 5.10，p<0.05），Pro-caspase-1（单向方差分析，F_3,12=6.98，p<0.05），成熟caspase-1（单向方差分析，F_3,12 = 4.85，p<0.05）。相反，这些小鼠的ASC蛋白水平保持不变（单向方差分析，F_3,12 = 3.02，p>0.05）(图4A-D). 在IP实验中，120 mg/kg姜黄素反复治疗逆转了ASC、NALP1和caspase-1在NALP1炎性体复合体内的聚集增加(图4E). 此外，增强的NALP1-IR(图5)和胱天蛋白酶1-IR(图6)SNI后第7天在同侧脊髓背角观察到，而在假小鼠中仅观察到微弱的NALP1和caspase-1蛋白水平。此外，几乎所有NALP1阳性细胞都与GFAP共表达(图5)并且大部分caspase-1阳性细胞也会表现出IL-1β的表达(图6). 姜黄素处理的小鼠NALP1-IR较少(图5)和胱天蛋白酶1-IR(图6)脊髓中的DMSO含量高于DMSO处理组。所有这些数据表明，姜黄素抑制SNI诱导的NALP1炎性体的激活。

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图4

反复姜黄素治疗对SNI小鼠脊髓NALP1炎性体激活的影响。

(A–D)SNI损伤导致SNI后第7天脊髓中NALP1、ASC、Pro-和成熟型半胱氨酸蛋白酶-1的表达增加。反复姜黄素治疗后，SNI诱导的NALP1、Pro-和成熟e-aspase-1表达升高显著降低*p<0.05和**p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组4个。所有数据均显示为平均值±SEM(E类)ASC免疫沉淀来自SNI或假处理小鼠的裂解物，这些小鼠接受姜黄素（120 mg/kg）或二甲基亚砜的重复治疗。姜黄素逆转了SNI诱导的NALP1炎性体蛋白的聚集。图中使用了裁剪凝胶/印迹，免疫印迹是从在相同实验条件下运行的微凝胶中获得的。

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图5

假手术或SNI手术后第7天，DMSO或姜黄素（120 mg/kg）慢性治疗的小鼠脊髓背角NALP1和GFAP双重染色。

假手术在同侧脊髓后角诱导弱NALP1-IR(A、 B类). 腹腔注射姜黄素后，假手术组未观察到NALP1-IR的变化(A、 B类). SNI手术后，脊髓背角病变同侧NALP1-IR和GFAP-IR升高，大部分NALP1-IRs与GFAP-IR共标记，表明SNI术后第7天NALP1在脊髓星形胶质细胞中积聚(C、 C类’). 腹腔注射姜黄素抑制SNI后同侧脊髓背角NALP1-IR的表达(D类). (E类)浅背角（第一层至第三层）NALP1染色强度*与Sham+DMSO组相比，p<0.05；^#与SNI+DMSO组相比p<0.05；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。(F类)NALP1数量⁺/GFAP公司⁺浅背角（第一层至第三层）的双标记细胞*与Sham+DMSO组相比，p<0.05；^#与SNI+DMSO组相比p<0.05；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。比例尺=50μm。

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图6

假手术或SNI手术后第7天，用DMSO或姜黄素（120 mg/kg）慢性治疗的小鼠脊髓背角的Caspase-1和IL-1β双重染色。

假手术在同侧脊髓背角诱导弱caspase-1-IR(A、 B类). 反复腹腔注射姜黄素（120 mg/kg）后，假手术组未观察到caspase-1-IR的变化(A、 B类). SNI手术后，在脊髓背角病变的同侧检测到caspase-1-IR增加，许多IL-1β-IR与caspase-1-IR共同标记(C、 C’). 腹腔注射姜黄素抑制SNI后同侧脊髓背角caspase-1-IR的表达(D类). (E类)背角浅层（I–III层）caspase-1染色强度**与Sham+DMSO组相比，p<0.01；^#与SNI+DMSO组相比p<0.05；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。(F类)IL-1β的数量⁺/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1⁺背角浅层的双重标记细胞（I–III层）**与Sham+DMSO组相比，p<0.01；^##与SNI+DMSO组相比，p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。比例尺=50μm。

姜黄素对SNI小鼠脊髓JAK2-STAT3级联介导的Pro-IL-1β合成的影响

接下来，我们探讨了姜黄素抑制脊髓Pro-IL-1β合成的机制。如所示图2C姜黄素不仅抑制IL-1β，而且降低脊髓背角GFAP的表达。脊髓星形胶质细胞JAK2-STAT3级联反应已被证明在维持神经病理性疼痛期间减弱星形胶质细胞的增殖和功能¹⁶此外，激活的JAK2-STAT3级联在IL-1βmRNA表达中起着重要作用¹⁷^,18因此，我们研究了脊髓JAK2-STAT3级联是否参与姜黄素介导的IL-1β合成抑制。神经损伤小鼠在SNI后第3天到第7天接受了AG490（5μg，鞘内注射）（JAK2-STAT3级联的部分抑制剂）治疗，显示出爪子撤回阈值显著增加，爪子抬起/舔舔持续时间缩短(图7A、B). 实时PCR显示，与载体组相比，接受AG490治疗的SNI小鼠的脊髓IL-1βmRNA表达也显著降低（单向方差分析，F_3,12 = 6.102，p<0.01，图7C). 这些结果表明，脊髓星形胶质细胞JAK2-STAT3级联可能有助于SNI后IL-1βmRNA的合成。

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图7

姜黄素对SNI小鼠脊髓JAK2-STAT3级联反应的影响。

(A、 B类)周围神经损伤的小鼠在第3-7天每天鞘内注射AG490（5μg）或载体（1%二甲基亚砜，5μl）一次。在外周神经损伤后的开始（第0天）和第1、3、4、5、6和7天，测量Von Frey细丝机械刺激引起的爪子退缩阈值以及丙酮冷刺激后爪子抬起/舔的持续时间*与SNI+DMSO组相比，p<0.05和**p<0.01；双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试；n=每组6个。(C类)术后第7天通过实时PCR评估AG490对脊髓IL-1βmRNA表达的影响*p<0.05和**p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组4个。(D、 E类)SNI后第7天，脊髓中pJAK2和pSTAT3的表达增加。反复腹腔注射姜黄素（120 mg/kg）后，小鼠脊髓中SNI诱导的pJAK2和pSTAT3升高显著逆转。图中使用了裁剪凝胶/印迹，免疫印迹是从在相同实验条件下运行的微凝胶中获得的*p<0.05和**p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组4个。所有数据均显示为平均值±SEM。

SNI后第7天，western blotting显示，与假对照组相比，脊髓活化JAK2和STAT3的蛋白表达显著增加，而姜黄素反复治疗显著减弱了这种上调（单向方差分析，F_3,12 = 4.89，p<0.05，图7D、E). 此外，双重染色显示SNI后第7天pSTAT3-IR和IL-1β-IR的表达和共同定位增加(图8). 同样，注射姜黄素后，这种上调作用显著降低(图8). 总的来说，这些数据表明姜黄素可能通过抑制脊髓星形胶质细胞JAK2-STAT3级联的激活来减少SNI后Pro-IL-1β的合成。

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图8

假手术或SNI手术后第7天，DMSO或姜黄素（120 mg/kg）慢性治疗的小鼠脊髓后角pSTAT3和IL-1β双重染色。

假手术在同侧脊髓后角诱导弱pSTAT3-IR(A、 B类). 腹腔注射姜黄素后，假手术组未观察到pSTAT3-IR的变化(A、 B类). SNI手术后，在脊髓背角病变的同侧检测到pSTAT3-IR和GFAP-IR升高，许多IL-1β-IR与pSTAT3-IR共同标记，表明SNI术后第7天，pSTAT3在脊髓星形胶质细胞中积聚(C、 C类’). 姜黄素腹腔注射抑制SNI后同侧脊髓背角pSTAT3-IR的表达(D类). (E类)浅层背角（I–III层）STAT3染色强度**与Sham+DMSO组相比，p<0.01；^#与SNI+DMSO组相比p<0.05；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。(F类)IL-1β的数量⁺/STAT3（状态3）⁺浅背角（第一层至第三层）的双标记细胞***与Sham+DMSO组相比，p<0.001；^##与SNI+DMSO组相比，p<0.01；Bonferroni之后的单向方差分析事后（post-hoc）测试；n=每组3-4人。比例尺=50μm。

讨论

姜黄素因其多种生物活性而备受关注¹⁹^,20姜黄素具有多种外周药理活性，尤其是抗炎作用，这一点已得到充分证实¹在本研究中，我们重点研究了姜黄素反复治疗对SNI诱导的神经病理性疼痛的影响，并进一步研究了其与脊髓中产生生物活性成熟IL-1β有关的作用机制。本研究表明，姜黄素可减轻神经病理性疼痛，下调脊髓中成熟IL-1β的生成，并抑制NALP1炎性体和星形胶质细胞JAK2-STAT3通路的激活。

先前的研究表明，姜黄素和姜黄素负载的PLGA纳米粒被很好地吸收，具有良好的组织渗透性，并且容易越过血脑屏障²¹最近，有令人信服的证据表明姜黄素在中枢神经系统中具有活性。在临床上，姜黄素已被用于治疗阿尔茨海默病患者，剂量为4克/天，持续24周²²对于肥胖者的焦虑和抑郁，每天服用1克，持续30天²³在动物模型中，姜黄素被证明参与神经保护，显示抗抑郁和抗伤害作用，并逆转认知受损和神经元可塑性²⁴^,25^,26此外，姜黄素以45 mg/kg和60 mg/kg的剂量（连续治疗3至4周，每天两次）用于治疗小鼠慢性结构损伤和糖尿病引起的神经病理性疼痛^三^,27一直以来，在本研究中，连续7天重复腹腔注射60和120 mg/kg姜黄素可显著减轻SNI诱导的机械性痛觉超敏反应。然而，30 mg/kg姜黄素的治疗没有显示出明显的镇痛效果，这与之前的研究结果一致，即²⁸25mg/kg姜黄素不能改善福尔马林引起的口面部疼痛。

研究表明姜黄素可以改善致癌作用²⁹，结肠炎³⁰和银屑病样炎症³¹通过下调IL-1β。作为一种重要的促炎细胞因子，脊髓IL-1β已被证明参与神经病理性疼痛的发生¹⁵在目前的研究中，反复姜黄素治疗显著抑制了SNI诱导的星形胶质细胞脊髓IL-1β的表达。与这些结果一致，其他证据表明，促炎细胞因子IL-1β主要在脊髓星形胶质细胞中表达³²^,33姜黄素显著降低培养脊髓原代星形胶质细胞中IL-1β的表达²这些研究表明，姜黄素对脊髓IL-1β的下调可能是其抗异常性疼痛作用的原因。除了抑制脊髓IL-1β的产生外，还提出了其他几种可能的机制来解释姜黄素的抗伤害作用。这些包括TRPV1的对抗性³⁴，抑制TNF-α/NO释放³⁵，以及涉及下降单胺系统和阿片受体的机制^三.

我们的研究表明，SNI诱导了NALP1、caspase-1和适配器蛋白ASC的显著聚集，这表明NALP1炎性体在神经病理性疼痛期间被激活。除我们之前的研究外，其他一些研究报告称鞘内或外周注射caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK可显著减轻CCI诱导的热痛觉过敏¹¹和创伤后局部伤害敏感性³⁶分别表明中枢和外周NALP1炎性体可能有助于疼痛敏化。一直以来，在本研究中，鞘内注射NALP1 siRNA不仅显著降低IL-1β成熟度，而且还减轻神经病理性疼痛，这进一步表明激活的脊髓NALP1炎性体有助于SNI诱导的神经病理性痛。此外，最近的研究报告称，外周NLRC4炎性体成分NLRC4和ASC参与caspase-1的激活和IL-1β的成熟，并有助于急性炎症疼痛³⁷中枢NLRC4炎性体是否参与神经病理性疼痛期间IL-1β的成熟仍需进一步研究。

先前的研究报告称，在小鼠巨噬细胞中，NALP1炎性体可被炭疽致死毒素激活，炭疽毒素是迄今为止唯一能激活NALP1的毒素³⁸然而，激活脊髓星形胶质细胞中NALP1炎性体的特异性SNI诱导刺激尚不清楚。研究表明，细胞内钾水平降低⁺导致培养的原代星形胶质细胞和神经元中caspase-1的激活和IL-1β的释放³⁹然而，无论K⁺介导SNI诱导的NALP1激活需要进一步研究。姜黄素已被证明可以通过抑制内质网应激相关TXNIP/NLRP3炎症小体的激活来预防缺血性脑损伤⁴⁰然而，姜黄素抑制NALP1炎性体聚集的机制仍需研究。此外，我们目前的数据表明，姜黄素治疗抑制了SNI小鼠脊髓中NALP1和caspase-1的表达，但不抑制ASC的表达。姜黄素的这些不同调节可能是由于NALP1、caspase-1和ASC表达的不同调节机制所致。总的来说，这些结果表明姜黄素可能抑制脊髓NALP1炎性体的聚集，从而抑制IL-1β成熟和神经病理性疼痛。

先前的研究报道JAK2-STAT3信号的激活介导IL-1βmRNA的表达在体外在用蓝绿色素刺激的胰腺腺泡AR42J细胞中体内蓝斑诱导的胰腺炎大鼠¹⁷此外，鞘内注射AG490（一种JAK2-STAT3级联抑制剂）可显著降低外周炎症诱导的脊髓IL-1βmRNA的表达⁴¹一致地，我们发现鞘内注射JAK2-STAT3级联抑制剂不仅可以改善神经病理性疼痛，还可以降低脊髓IL-1βmRNA的上调。

据报道，JAK2-STAT3信号通路主要负责抗高尿酸血症⁴²，保护心脏⁴³和肾保护性能⁴²姜黄素。据报道，姜黄素可抑制JAK-STAT信号传导并减弱脑胶质细胞的炎症反应⁴⁴此外，姜黄素的两种小分子衍生物FLL32和FLLL62通过选择性结合JAK2和STAT3 Src同源-2结构域，被证明可有效治疗多种不同类型的癌症，包括肾癌、黑素瘤、胰腺癌和乳腺癌，在STAT3二聚化和信号转导中起关键作用⁴⁵与这些研究一致，我们发现姜黄素通过抑制脊髓JAK2-STAT3级联来减轻神经病理性疼痛。综上所述，这些结果表明姜黄素通过抑制脊髓JAK2-STAT3级联抑制Pro-IL-1β的合成。

最近，141名患有神经性疼痛的患者接受了一种含有姜黄素的配方食品的治疗，该配方食品是姜黄素的主要成分之一，以测试姜黄素在神经性疼痛治疗中的安全性和有效性⁴⁶因此，在姜黄素用于治疗神经性疼痛之前，迫切需要更好地了解其作用机制。本研究首次表明，在小鼠神经性疼痛诱导后，姜黄素诱导的抗伤害性过程中，脊髓IL-1β的可用性和成熟度受到不同的调节。其潜在机制可能涉及逆转脊髓NALP1炎性体聚集和抑制脊髓JAK2-STAT3级联激活。

方法

动物

所有动物实验均在6-8周龄、体重20-25 g的成年雄性BALB/c小鼠上进行。这些小鼠由上海中国科学院实验动物中心提供。在进行实验操作之前，让小鼠在受控条件下（22±1°C，上午6点至下午6点交替的光暗周期），以食物和水，每笼四只小鼠为一组，适应一周随意所有实验均经复旦大学基础医学院动物研究福利委员会批准（20140226–086），并严格按照国家卫生研究所《实验动物护理和使用指南》和国际疼痛研究协会的指南进行⁴⁷.尽一切努力减少使用动物的数量及其痛苦。

外科手术

如前所述，BALB/c小鼠受到备用神经损伤引起的周围神经病变¹²^,48简言之，在通过鼻锥输送的异氟烷麻醉（2%异氟烷，氧气为载气）下暴露股二头肌。通过股二头肌切开，用6.0丝将腓总神经和胫总神经紧紧结扎，并在结扎远端切开，切除远端神经残端2-4mm。在假手术中，如上所述暴露坐骨神经，但未与神经接触。在后掌外侧足底表面测试机械阈值和冷敏感性。

行为测试

机械刺激

通过测量同侧爪子对Von Frey hairs（美国伊利诺伊州Wood Dale Stoelting）机械刺激的反应，对损伤部位的拔出阈值来评估机械敏感性。这些动物被放在一个塑料笼子里，有一个铁丝网地板，并在测试开始前10至15分钟进行习惯化。这些动物也在连续2-3天的时间内习惯化，在此期间记录了一系列基线测量值。如前所述，将一系列八根校准的Von Frey毛发（0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0和1.4g）施加到后爪的足底表面¹²每根冯·弗雷的头发保持大约1至2秒，每次使用间隔为5分钟。试验开始时使用0.16克冯·弗雷头发。阳性反应定义为刺激后迅速收回后爪。当对给定头发出现阳性反应时，使用下一个较低的冯·弗雷头发；当出现负面反应时，使用高一点的头发。在第一次反应发生变化后，该测试包括五个额外的刺激，并且前文所述的Dixon上下范式的改编将爪子撤退阈值转换为触觉反应阈值⁴⁹.

冷刺激

为了评估冷敏性，如前所述使用丙酮试验¹³^,48在冯·弗雷试验大约30分钟后，对小鼠进行了冷刺激后爪子缩回反应的测试。该测试使用一个装有钝针的注射器，将50μl丙酮滴在受伤部位同侧后爪足底表面中心，避免用注射器对爪子进行机械刺激。记录舔/咬同侧后爪的总时间，任意最大截止时间为60 s。在测试之前，动物在连续2-3天的时间内习惯，在此期间记录一系列基线测量值。

鞘内给药

如前所述，通过腰椎穿刺进行鞘内注射⁵⁰简单地说，用异氟醚麻醉小鼠。然后，用5μl注射器（Hamilton，33 gauge针头）将药物（体积为5μl）注入腰椎L5和L6的蛛网膜下腔。甩尾表明针头刺穿了硬脑膜。

药物

姜黄素购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。AG490购自Calbiochem（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。姜黄素和AG490溶解在20%二甲基亚砜中，并在生理盐水中稀释。NALP1 siRNA（sc-63287）和阴性对照（加扰siRNA，sc-390133）购自Santa Cruz Biotechnology。为了降低转染毒性并有效地将siRNA递送到脊髓，根据制造商的说明将siRNA与聚乙烯亚胺（PEI，Fermentas）混合。

药物治疗

对于反复姜黄素治疗，从术后第1天到第7天（SNI或假手术）每天两次给予姜黄素或载体（20%DMSO）。将新鲜姜黄素溶解在20%二甲基亚砜中，并在实验当天稀释至所需浓度。

术后第3天至第7天每天鞘内注射AG490一次。

对于NALP1或对照siRNA处理，将siRNA以1μg/μl的浓度溶解在无RNase水中作为储备溶液，并在注射前10分钟与聚乙烯亚胺（PEI，发酵剂）混合，以增加细胞膜渗透性并减少降解。将PEI溶解在5%葡萄糖中，并将1μg siRNA与0.18μl PEI混合。术后第3天至第7天鞘内注射5μl siRNA（5μg），每天一次，以抑制NALP1的表达。通过NALP1表达的western blotting证实脊髓中的基因敲除。

免疫组织化学

用3%异氟醚对小鼠进行深度麻醉，然后用生理盐水和4%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）中进行心内灌注。取L4-L5脊髓节段，固定后冷冻，在30μm厚的冷冻切片机（德国莱卡2000）上切片，并进行免疫组织化学处理，如前所述⁴⁸.将切片清洗三次，用4%的驴血清在0.3%Triton X-100中在37°C下封闭1小时，然后在含有20%正常驴血清、0.3%Trito X-100和两种初级抗体混合物的PBS中在4°C下培养过夜。主要抗体混合如下：山羊抗IL-1β（1:200；AF-401-NA；美国研发部）与小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（抗GFAP，星形胶质细胞标记物；1:2000；MA5-12023；Thermo，美国）、兔抗pSTAT3（1:200，#9145；Cell Signaling Technology，美国）或兔抗caspase-1（1:200、ab17820；Abcam，Cambridge，MA）混合；将兔抗NALP1（1:200；ab98181；Abcam，Cambridge，MA，USA）与鼠抗GFAP（1:2000；Thermo）混合。在0.01 M PBS中冲洗三次15分钟后，用Alexa 594-和Alexa 488-结合二级抗体的混合物（1:1000；Invitrogen，Carlsbad，California，USA）在37°C下孵育切片1小时，并在PBS中清洗。所有切片都用0.01的80%甘油混合物盖上盖子M PBS，并使用多光子激光点扫描共焦显微镜系统（日本Olympus Fluoview FV1000；德国徕卡TCS SP5）捕获图像。

蛋白质印迹分析

如前所述，将脊髓L4-L5段均质化并进行SDS-PAGE⁴⁸。在4时将膜与以下一级抗体孵育°C过夜：山羊抗IL-1β（1:500；研发）、兔抗半胱氨酸-1（1:500；Abcam）、兔抗NALP1（1:500；Abcam）、兔抗ASC（1:500；sc-22514-R；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）、山羊抗mIL-1β（1:500；sc-23460；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）、兔抗pSTAT3（1:500；细胞信号技术），兔抗STAT3（1:1000；79D7；Cell Signaling Technology，USA）、兔抗pJAK2（1:500；3771；Cell信令技术，USA。然后在TBST中清洗印迹，并在室温下在适当的二级抗体中培养1小时。二级抗体为驴抗羊lgG-HRP（1:10000；sc-2020；Santa Cruz Biotechnology，CA，USA）、驴抗鼠lgG-HRP（1:5000；sc-2314；Santa Cruz Bietechnologies，CA，US）或HRP Affinipure goat anti-Rabbit lgG（H+L）（1:10000，E030120-01；ErthOx，CA，美国）。western blot图像在ImageQuant LAS4000微型图像分析仪（英国白金汉郡GE Healthcare）上采集，并使用image J软件1.42q版量化带水平。

免疫沉淀

为了确定炎症小体中蛋白质的组成和联系，如前所述，从同侧脊髓的L4-L5段提取总蛋白裂解物¹¹将脊髓裂解物（500μg）与1μg抗ASC抗体（美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司）在4°C下孵育过夜。然后，向混合物中添加50μl蛋白A琼脂糖珠，将混合物在4°C下孵育4 h，并在12000×g下离心60 s。将颗粒珠在裂解缓冲液中洗涤五次，再悬浮在2×负载缓冲液中，并在100°C下加热10分钟。使用以下抗体通过免疫印迹法分析免疫沉淀蛋白：兔抗ASC、兔抗NALP1和兔抗caspase-1。使用制备用于免疫沉淀的全组织裂解液（50μg）作为输入，使用相同同型的非免疫血清作为阴性对照。

实时PCR

解剖小鼠的L4–L6脊髓节段，将其冷冻在液氮中，并储存在−70°C。根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。用分光光度计测量RNA的量。使用M-MLV逆转录酶（Promega）和寡核苷酸（dT）引物将两微克总RNA逆转录成cDNA。使用以下IL-1β的寡核苷酸引物进行PCR反应(NM_008361.3号)：上游引物，5-actcattgtggtggaga-3；下游引物5-ttgttcatctctggagcctgt-3。实时逆转录PCR在IQ5多色实时PCR检测系统上运行（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。使用参考基因β-肌动蛋白将IL-1β的表达标准化为每个样品的RNA负载量(NM_007393号; 上游引物5-cctctatgccaacacagtgc-3；以及下游引物5-cctgcttgctgatcacatc-3）作为内部标准。数据表示为平均值±SEM。

统计分析

数据表示为平均值±标准误差（SEM）。所有统计分析均使用SPSS 19.0统计软件（SPSS Inc.，伊利诺伊州芝加哥）进行。行为数据通过双向ANOVA（时间×治疗）进行分析，然后由Bonferroni进行分析事后（post-hoc）测试。Western Blot和Real-Time PCR数据通过单向方差分析和Bonferroni分析事后（post-hoc）测试。在比较两个治疗组时，采用Student t检验。用计算机辅助成像分析系统（Image J，NIH）测量Western blot凝胶特异条带的密度。为了量化脊髓中的免疫反应细胞，从L4–L5脊髓节段中随机选择三个或四个非相邻脊髓节段。用图像J测量浅背角（I–III层）IL-1β、GFAP、NALP1、caspase-1和pSTAT3染色的强度⁺/GFAP公司⁺，NALP1⁺/GFAP公司⁺，IL-1β⁺/GFAP公司⁺和IL-1β⁺/pSTAT3型⁺背角（I–III层）中的双重标记细胞也通过图像J进行计数。在所有的统计分析中，p<0.05被认为是显著性的标准。

其他信息

如何引用这篇文章：刘，S。等姜黄素通过抑制星形胶质细胞NALP1炎性体和JAK2-STAT3信号，下调脊髓IL-1β，从而改善神经病理性疼痛。科学。代表。 6, 28956; doi:10.1038/srep28956（2016）。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（81473749、81371247、31421091）、上海市国家自然科学研究基金（15ZR1402800）、国家重点基础研究计划（2013CB531906）、上海针刺机理与穴位功能重点实验室（14DZ2260500）的资助上海市高峰学科发展项目——综合医学。

脚注

作者贡献S.L.和Q.L.进行了动物模型、行为测试、实时PCR、Western Blot、免疫沉淀和免疫组织化学实验。S.L.还分析了数据并起草了手稿。M.-T.Z.参加了行为测试。L.-Y.H.参与免疫组织化学实验。Q.-L.M.-Y.和G.-C.W.参与了实验的设计。Y.-Q.W.和W.-L.M.构思了这个项目，协调和监督了实验，并修改了手稿。所有作者都审阅了最后的手稿。

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