使用基于细胞的分析区分聚集物形成和聚集物清除

AlfyC（而非HspB7）刺激预成型骨料的清除

尽管HspB7和AlfyC影响SDS不溶性polyQ内含物的量，但潜在修饰物与易聚集蛋白的共转染使其难以确定修饰物何时作用于其靶标。例如，作为一种伴侣蛋白，HspB7可能通过保持膨胀的polyQ蛋白的溶解度来干扰聚集物的形成，也可能通过增加其降解来降低polyQ低聚物或聚集物的水平。为了进一步研究HspB7和AlfyC如何影响不溶性polyQ蛋白，我们使用稳定表达17aaHtt103Q–mCFP的四环素（tet）可调节细胞系或具有65个polyQ残基（17aaHtt 65Q–mCFR）的类似结构(图S1) (山本等人，2006年). 与疾病情况类似，这些细胞系在保持“tet-on”状态时表现出稳定的预成型内含物水平，其中30%至40%的细胞聚集呈阳性。为了消除表达，细胞暴露于强力霉素（doxycycline，dox）中，由此可以清除聚集物。因此，在这些实验中，在没有dox的情况下持续维持表达多聚Q的细胞，以保持预成型聚集体的存在。首先，我们在这些细胞系中过度表达AlfyC。与瞬时表达条件类似，在稳定polyQ表达条件下，72小时的AlfyC过度表达降低了不溶性polyQ蛋白的数量(图2Ai，ii）。SDS可溶性17aaHtt65Q的水平不受AlfyC过表达的影响，这与Alfy是聚集蛋白的衔接子一致(图2Aiii，iv）。

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图2。

AlfyC而非HspB7的过度表达导致稳定表达的polyQ细胞系中预制17aaHtt65Q聚集体的数量减少。（A） 将AlfyC转染到表达17aaHtt65Q–mCFP的稳定细胞系中。稳定的细胞系在没有dox的情况下保持不变，因此持续表达。在转染后72小时制备FTA（i，ii）和western blotting（iii，iv）样品(n个=3). AlfyC减少洗涤剂不溶性聚集蛋白的数量[F类_{(1, 4)}=55.902; *P（P）=0.0017]（i，ii）；但对SDS可溶性17aaHtt65Q无影响[F类_{(1 ,4)}=0.063;P（P）=0.8137]（iii，iv）。（B） 在与A相同的条件下转染HspB7，24天后制备FTA（i，ii）样品(n个=4), 48 (n个=4）或72(n个=转染后3小时，24小时后进行western blot分析（iii，iv）(n个=3), 48 (n个=3）或72(n个=转染后2）小时。两者都表明HspB7对SDS不溶物的量没有影响[F类_{(1, 16)}=0.539;P（P）=0.4734]或SDS可溶[F类_(1,10)=0.670;P（P）=0.4321]17aaHtt65Q–mCFP蛋白质。Western blotting也显示HspB7蛋白在转染后72小时内水平下降。（v，vi）基于图像的分析还表明，HspB7不影响含有17aaHtt103Q–mCFP聚集体的细胞百分比（绿色）[F类_{(1, 6)}=0.366;P（P）=0.5672]. 细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。每个实验复制计数100个细胞(n个=2). 数据表示为上述独立实验数量的平均值+s.d。比例尺：10μm。进行双尾方差分析以确定统计显著性。Ctrl，空向量。

接下来，我们确定HspB7在这些条件下是否可以降低不溶性polyQ蛋白的水平(图2B） ●●●●。尽管我们在图1A、 HspB7的过度表达对稳定表达17aaHtt65Q–mCFP的细胞中SDS可溶性或不溶性polyQ蛋白库均无影响(图2Bi–iv）或17aaHtt103Q–mCFP(图S1). 为了证实我们的发现，我们还计算了每个细胞CFP阳性内含物的数量，这也表明HspB7和对照转染之间没有差异(图2Bv，vi；图S1C). 这些数据表明，与AlfyC不同，HspB7不能消除预先形成的polyQ内含物，这表明这两种蛋白质以不同的途径作用，影响细胞中的聚集负荷。

表达HaloTag-fuse polyQ的诱导细胞株中积累蛋白的清除

我们的发现体现在图1和​和22引发了这样一个问题：HspB7或Alfy何时对聚集产生影响？仅仅依靠单个荧光标记，我们就无法暂时区分细胞中发生的聚集事件。因此，为了研究polyQ随时间的聚集，我们建立了一个可诱导稳定的细胞系，表达Htt的外显子1片段，其中103个polyQ残基（外显子1Htt103Q）被HaloTag标记(图3). 卤代标签融合蛋白可以用荧光染料（如四甲基罗丹明（TMR）、俄勒冈州绿或香豆素）不可逆地标记，这些荧光染料与卤代烷组分共价连接(Los等人，2008年). 鉴于配体结合是不可逆的，可以使用不同的荧光配体来脉冲标记和研究随时间的聚集(图S2A). 为了提供进一步的实验灵活性，我们还使用了一种tet-regulatable设计(图S2B)允许与现有的单荧光细胞系进行比较，例如用于图2.

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图3。

诱导型Exon1Htt103Q–HaloTag细胞系在给予dox后表现出聚集清除。（A） EM48免疫荧光（绿色）证实TMR阳性聚集物（红色）代表聚集的外显子1Htt103Q–HaloTag。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。（B） 时间线概述了实验设计。稳定的细胞系保持在“开”状态。在时间0，将细胞暴露于0.5μM TMR 30分钟，然后暴露于多西环素（dox）。在分析之前（0小时）以及24、48、72和96小时后，将细胞暴露于1.5 mM俄勒冈州绿（OG）中30分钟，以标记新形成的外显子1Htt103Q–HaloTag蛋白。（C，D）用1μg/ml dox治疗后第0、48和96小时的代表性图像（C）和量化（D）。检查TMR（红色）和俄勒冈州绿（绿色）通道，发现没有可检测到的俄勒冈州绿染色。对两个通道中检测到的所有聚集物进行定量分析表明，当表达被取消时，72小时后聚集物不再被检测到。几乎没有发现可检测到的Oregon-Green阳性结构，TMR阳性聚集物基本被清除。数据表示为平均值+标准差n个=4个独立实验。每个时间点平均计数1000个细胞。比例尺：10μm。

我们之前发现，在稳定表达17aaHttpolyQ–mCFP的tet可调节细胞中，使用dox关闭基因表达会导致3至5天内的聚集清除(图S1) (山本等人，2006年). 为了确保HaloTag标签不会影响聚集或清除，我们检测了外显子1Htt103Q–HaloTag细胞中的tet-regulable聚集清除率(图3). 首先，为了确保HaloTag不会影响聚集，细胞在几代中保持基因开启状态（即无dox），然后暴露于TMR。我们发现TMR阳性聚集体被EM48抗体识别，表明它们对外显子1Htt103Q蛋白具有特异性(图3A） 。接下来，我们使用HaloTag检测了TMR和Oregon Green的总清除率，以标记外显子1Htt103Q的不同群体(图3B） ●●●●。最初，在dox给药之前，添加TMR以标记所有存在的外显子1Htt103Q，然后关闭基因表达。接下来，给dox阻断外显子1Htt103Q的表达。在0到96小时后，在固定之前，使用Oregon Green标记任何可能在dox治疗后新表达的外显子1Htt103Q。因此，Oregon-Green阳性蛋白表明tet-regulation存在任何明显的泄漏。

时间0 h的基于图像的分析表明，TMR能有效标记聚集样结构(图3B、 C）。在稳定状态下，40-50%的细胞含有TMR阳性聚集体，但没有一个细胞对俄勒冈州绿呈阳性(图3C、 D），表明所使用的TMR浓度完全占据了可用的HaloTag结合位点。TMR或俄勒冈州绿染色的进一步分析表明，与17aaHttpolyQ–mCFP细胞系类似，随着时间的推移，暴露于dox导致聚集的细胞数量减少。72小时后，所有TMR阳性聚集物均被清除，尽管在48小时内出现了显著下降(图3C、 D）。在检测俄勒冈州绿染色时，没有俄勒冈州绿阳性聚集物，这表明在dox处理后，没有检测到外显子1Htt103Q–HaloTag表达的泄漏(图3C、 D）。

FTA和针对HaloTag标签的免疫印迹分析也表明，在类似条件下，分别在48小时和24小时后，SDS不溶性和可溶性外显子1Htt103Q–HaloTag蛋白的检测水平不再存在(图4A） 。使用10μM氯喹（Chlor）抑制溶酶体显著阻碍了不溶性polyQ的清除，但不阻碍可溶性polyQ蛋白的清除(图4B） 这表明只有聚集物被宏自噬降解，这与从mCFP标记细胞系收集的数据一致(山本等人，2006年;Filimonenko等人，2010年). 为了确定外显子1Htt103Q–HaloTag是否与自噬体共定位，我们接下来检查了小鼠产生的初级皮层神经元，这些神经元表达GFP标记形式的Atg8、MAP1轻链3B（LC3，也称为MAP1LC3B）哺乳动物同源物(水岛等人，2004年)，一种自噬体标记物(Kabeya等人，2000年). 将外显子1Htt103Q–HaloTag瞬时转染初级皮层神经元，然后暴露于TMR。共聚焦显微镜显示TMR阳性结构与GFP–LC3阳性结构共定位(图4C） ●●●●。总之，这些数据表明，外显子1Htt103Q–HaloTag可用于监测聚集polyQ蛋白的形成和清除。

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图4。

外显子1HTT103Q–HaloTag聚集体以溶酶体依赖的方式清除。（A） FTA（i，ii）和western blotting（iii，iv）用于研究外显子1Htt103Q–Halotag（103Q-HT或HT）蛋白的清除。用抗HaloTag抗体探测膜。（i，ii）洗涤剂不溶性外显子1Htt103Q–HaloTag蛋白在48小时后无法检测到。根据图3这表明基于图像的分析可能对该细胞系的清除率分析更为敏感。（iii，iv）Western blot分析表明，洗涤剂可溶性蛋白在24小时内被清除。（B）Exon1Htt103Q–HaloTag细胞暴露于1µg/ml dox中，不含或含有10µM溶酶体抑制剂氯喹（Chlor）48小时。样品通过FTA（i，ii）或Western blotting（iii）进行分析。氯的存在显著阻碍了洗涤剂不溶性蛋白质的清除[F类_{(2, 6)}=214.395, *P（P）=0.0015]. 溶酶体抑制不会延迟可溶性外显子1Htt103Q蛋白的清除[F类_{(2, 6)}=2578.875,P（P）=0.8616]. LC3 II（LC3的脂化形式）的积累意味着自噬体成熟减弱，证实溶酶体受到抑制。（C） Exon1Htt103Q–HaloTag与GFP–LC3在初级神经元中共定位。将GFP–LC3转基因小鼠产生的初级皮层神经元瞬时转染外显子1Htt103Q–HaloTag，24小时后暴露于TMR。数据表示为平均值+标准差n个=3个独立实验。比例尺：10μm。进行双尾方差分析以确定统计显著性。

HaloTag跟踪骨料的形成和清除

虽然在不同的系统中使用tet调节系统表明有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞具有消除蛋白质聚集的先天能力(Filimonenko等人，2010年;山本等人，2006年,2000)在连续表达的条件下，骨料间隙是否仍能发生尚不确定。这种明显的微妙性是相关的，因为它更准确地反映了聚集物清除发生的生理条件。在持续表达下，由于新形成的低聚物的不断添加，种子聚集物可能会继续进化。在这个模型中，增长的骨料可能没有适当的目标和/或贩运用于降解。此外，细胞质稀释和不对称分离会进一步混淆分裂细胞中聚集清除率的研究(Rujano等人，2006年). 虽然HaloTag不一定能消除稀释或分离的影响，但与使用单个荧光标记不同，尽管添加了新的蛋白质，但随着时间的推移，可以跟踪单个聚集体，从而减少因细胞分裂而产生的混淆。因此，我们接下来使用外显子1Htt103Q–HaloTag细胞系来确定聚集体在polyQ蛋白的组成性表达过程中是否降解(图5).

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图5。

Exon1Htt103Q–HaloTag细胞系可用于监测polyQ蛋白持续存在下的聚集物形成、生长和清除。（A） 实验设计示意图。将细胞暴露于0.5μM TMR（红色）中30 min。在所示时间采集之前，细胞也暴露于俄勒冈州绿（OG，绿色）中30分钟。白框中高亮显示的区域在相应图像下方以较高的放大倍数显示。细胞显示，在外显子1Htt103Q–HaloTag的持续表达过程中可能发生聚集清除。0小时时，所有聚集物均为TMR阳性，几乎没有检测到Oregon-Green阳性结构。随着时间的推移，有一个逐渐的转变，即96小时后，大多数TMR阳性聚集物被清除，并对俄勒冈州绿呈阳性。（E，F）在连续表达的条件下，两种不同的HaloTag配体的聚集体可以是阳性的。（E） 香豆素阳性聚集体的代表性图像，该聚集体继续生长以结合新的TMR阳性外显子1Htt103Q–HaloTag蛋白。香豆素24小时后，给予TMR标记该新表达蛋白。（F） 对D中表示的数据进行重新分析，以包括TMR-only、TMR和Oregon Green双阳性和Oregon-Green-only聚集体，结果表明，TMR-only-聚集体寿命很短，要么被清除，要么继续结合蛋白质。到96小时，大多数含TMR的聚集物都被清除，并且大多数只对俄勒冈州绿呈阳性。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。数据表示为平均值±标准差n个=4个独立实验。每个时间点平均计数1000个细胞。比例尺：10μm。

为了区别标记外显子1Htt103Q，在不同的时间使用TMR和Oregon Green。类似图3，使细胞在tet-on条件下达到稳定状态。在时间0时，细胞暴露于TMR以标记所有预先存在的蛋白质。接下来，为了标记随后形成的蛋白质和聚集体，细胞在0、24、48、72或96小时后用俄勒冈州绿标记，然后收集进行分析(图5A） 。首先，检测TMR阳性与Oregon-Green阳性染色。时间为0，与中类似图3D、 有许多TMR阳性结构，但不存在Oregon-Green-only聚集体(图5B） ●●●●。随着时间的推移，TMR阳性聚集体的数量随着俄勒冈州绿色阳性聚集体数量的增加而减少(图5C、 D）。这些数据表明，尽管外显子1Htt103Q–HaloTag持续表达，但仍会发生聚集清除，并且清除是在新聚集物形成的背景下发生的。此外，Oregon-Green阳性聚集物数量在24到48小时之间的增长率（从6±5%增长到40±13%）与TMR阳性聚集物的数量下降率（44±17%到28±9%；平均值±s.dn个=4个独立实验）表明，骨料形成的速度大于清除的速度。最后，即使在96小时后，TMR阳性聚集物的数量也没有完全下降，这表明尽管可以清除，但与聚集物形成后消除突变蛋白表达相比，突变蛋白组成表达下TMR阳性结构的持续时间更长。

迄今为止进行的分析分别对TMR染色和俄勒冈州绿染色进行了检查。如所示图5C、 TMR后添加俄勒冈州绿可导致形成对两种配体均呈阳性的聚集物。这种共定位表明新形成的Oregon-Green阳性蛋白并入预先存在的TMR阳性聚集体。共焦分析证实了这一点。当在另一个HaloTag-l和香豆素24小时后添加TMR时，香豆素阳性聚集体被TMR阳性聚集体包围(图5E） ●●●●。其他卤素标签与卤素标签组合的结果类似（数据未显示）。

接下来，我们重新分析了仅TMR、仅Oregon Green以及TMR和Oregon Green双阳性聚集体的数据。在dox存在的情况下，再分析几乎没有影响，因为没有新产生大量的突变蛋白(图S3A). 相反，在本构表达条件下，分离TMR和Oregon Green双阳性聚集体表明，仅TMR聚集体在72小时内被消除(图5F） ，这与在dox存在下观察到的速率相似(图3D） ●●●●。然而，与脱氧治疗不同，许多TMR-only结构进化为TMR和Oregon-Green双阳性聚集体，这表明新形成的Oregon-Green阳性蛋白添加到预先存在的TMR-阳性聚集体上，可以解释在图5D.在所有时间点上，TMR-only、TMR和Oregon Green双重阳性以及Oregon绿色聚集物的总和都是相同的，证实系统已达到稳定状态(图S3B). 这些数据表明，为了被降解，聚集体必须达到不再能够结合新合成的蛋白质的状态。对Oregon-Green-only结构的分析表明，聚集体可以形成从头开始在骨料清除和骨料增长的背景下；然而，在预成型包涵体存在的期间，新形成的蛋白质固结成预先存在的聚集体是形成新聚集体的主导因素。总之，我们的分析表明，通过使用HaloTag对聚集蛋白进行时间标记，我们可以区分聚集在细胞中的演变过程，以及这些结构最终在什么阶段被消除。

质粒

如前所述，创建了HspB7和AlfyC构造(Filimonenko等人，2010年;Vos等人，2010年). 带有交替CAGCAA重复序列的Exon1http103Q构建物来自Alexei Kazantsev（美国马萨诸塞州总医院神经退行性疾病总研究所）(Kazantsev等人，1999年). Exon1htt103Q–HaloTag结构是通过使用限制性内切酶NheI和BamHI将Exon1HT103Q亚克隆到pHT2（Promega）中而创建的。随后将其亚克隆到pBi4-TetO诱导载体中的NheI/NaeI位点(Baron等人，1995年).

细胞培养

HeLa细胞培养物保存在37°C和5%CO的高糖Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；Life Technologies）中，该培养基补充有10%的胎牛血清（FBS；Life Technologies）₂-包含大气。使用100μg/ml潮霉素（Life Technologies）和50μg ml潮霉素维持17aaHtt-polyQ–mCFP细胞系⁻¹如前所述，G418（生命技术）(山本等人，2006年). 使用氯喹（10μM，Sigma）实现溶酶体抑制。所有细胞系均经PCR证实为支原体阴性，并在没有青霉素和链霉素的情况下生长。

Western blotting和FTA

总计数

将准备好进行基于图像分析的细胞镀在玻璃盖玻片上，然后按照图图例所述进行处理。在规定的时间后，用含有100μM CaCl的PBS清洗盖玻片₂和1mM氯化镁₂然后用4%的多聚甲醛固定在PBS中。使用1μg/ml Hoechst 33342（Life Technologies）对Nuclei进行染色10分钟。使用PBS进行三个清洗步骤后，使用ProLong Antifade Gold（Life Technologies）安装盖玻片。使用徕卡SP5共焦显微镜采集图像（随机采集视野，通过Hoechst 33342成像确认足够的细胞数量），并使用图像J（NIH）进行聚集物计数。为了量化这些实验，每个实验每种条件下至少计算100个细胞。

我们要感谢坎平加和山本实验室对本手稿的帮助和批判性阅读。