人类多能干细胞（HPSC）的定向分化有可能产生用于移植到糖尿病患者体内的β细胞。但是在体外分化只产生“β样”细胞。除非将这些“类β”细胞移植到小鼠体内并允许其进一步分化数周，否则这些细胞无法进行成熟β细胞中的精确葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）1在正常发育过程中，小鼠胚胎第13.5天左右或人类受孕后第8-9周左右出现胰岛素表达的β细胞2,三但受监管的GSIS仅在出生几天后观察到。在出生后发育期间或移植后，控制β细胞成熟的信号和机制尚不清楚。
我们的目的是基于GSIS参数定义功能性β-细胞成熟，并识别功能性成熟β-细胞的标记物，这些标记物可用于培养功能性HPSC衍生β-细胞。
传统上，GSIS是通过低（2.8–5mM）和高（>10mM）葡萄糖浓度之间胰岛素分泌的倍数变化来测量的4在本试验中，新生儿β细胞在低葡萄糖浓度下表现出高基础胰岛素分泌，高浓度葡萄糖刺激导致胰岛素分泌小幅增加。如果新生儿β细胞在低葡萄糖浓度下有不可控的胰岛素“泄漏”，或者如果它们分泌胰岛素的葡萄糖浓度阈值较低，则可以解释这些数据。为了区分这两个假设，我们对新生（P1）和老年（P15）小鼠胰岛进行了动态GSIS，使用非常低的基线血糖水平0.5mM。数据显示，新生儿P1胰岛在低（2.8mM）葡萄糖浓度下执行完整的GSIS反应（第一和第二阶段胰岛素分泌），而P15胰岛在该浓度下无反应（无胰岛素分泌）(). 这些结果表明，未成熟的β细胞不是“漏的”，而是GSIS阈值降低，与成熟β细胞相比，在较低的葡萄糖浓度下分泌胰岛素。
β细胞成熟由GSIS对低血糖水平敏感性的降低和Ucn3的表达来定义（A）在动态GSIS分析中，分别用基础（0.5mM，灰色）、低（2.8mM，蓝色）或高（16.7mM，红色）葡萄糖灌流来自P1或P15小鼠的三组独立的50个胰岛。箭头表示更改解决方案的时间点。P1胰岛在低血糖状态下表现出完整的GSIS第一期和第二期，而P15胰岛在此葡萄糖浓度下不分泌胰岛素。（B）用低血糖（2.8 mM）和高糖（16.7 mM）对10个从P1到成人的胰岛的三酸盐进行GSIS检测。根据刺激指数（GSIS中的倍数变化）可以区分两个年龄组。***，P<5×10−5.（C）分别用低血糖（2.8mM，蓝色）、高糖（16.7mM，红色）、20mM精氨酸（灰色）或30mM KCl（绿色）对来自P1、P9或P21的三组独立的10个胰岛进行GSIS检测。成熟和不成熟胰岛分泌的胰岛素量的差异是葡萄糖特有的，P<0.05；**，P<0.001；NS，不显著）。（D）血糖和（E）未成熟（P1，蓝色）和成熟（P14，红色）小鼠幼崽的胰岛素水平。虽然幼犬的血糖水平较低，但幼犬的胰岛素水平高于成熟犬。（F）不同年龄β细胞中胰岛素囊泡的电子显微照片。比例尺=2μm。（G）F所示数据中胰岛素囊泡数量与β细胞面积的定量。（H）一种表示微阵列方法的方案。选择两个成熟年龄组与两个不成熟年龄组（I和II）差异表达的基因作为候选标记。（一）微阵列的代表性散点图。注意高度相似性（R2)在成熟（P10）和未成熟（P1）样品之间的基因表达。（J）大多数β细胞标记物的表达水平在GSIS成熟期间没有变化。FACS分类的未成熟（P1）和成熟（P10）β细胞上微阵列的全局基因表达散点图。红线标志着两倍的表达差异，除MafB外，这些阶段的基因表达没有显著差异。（K）微阵列检测到不同年龄段Ucn3 mRNA的表达。（L）E18.5和成年小鼠胰腺上的Ucn3（绿色）和胰岛素（红色）免疫染色。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺=50μm（百万）在E18.5胚胎中未检测到Ucn3。在高水平检测到Ucn3，并与成人β细胞共定位。
为了确定β细胞何时获得成熟的GSIS能力，我们测试了从P1分离到成年的小鼠胰岛对低（2.8mM）和高（16.7mM）葡萄糖浓度的反应。P1和P2岁新生小鼠的胰岛在高糖下分泌的胰岛素是低糖下的2.6±0.5倍，而从P9到成人的胰岛，在高糖时分泌的胰岛素平均是低糖时的60.9±10.7倍(). 因此，在P2和P9之间发生了表征β细胞成熟的低血糖和高糖之间GSIS反应的显著变化。年龄小于P2的小鼠胰岛表现出“不成熟”反应，而年龄大于P9的鼠胰岛表现为“成熟”β细胞。在P3到P8之间，观察到混合（中间）GSIS表型。
成熟和不成熟β细胞之间胰岛素分泌的差异是葡萄糖特有的。P1和P9胰岛对30mM KCl的反应分泌的胰岛素量分别为11.9±3.5ng和10.3±1.1ng。对20mM精氨酸的反应，P1和P21胰岛分泌的胰岛素量分别为9.17±1.4ng和5.66±0.9ng。这些差异在统计上并不显著(). 相比之下，P1小鼠胰岛在0.5ml高糖（17.7mM）中75分钟内仅分泌6.2±0.6ng胰岛素，而相同数量的P9或P21小鼠胰岛分别分泌23.7±5.7ng和19.7±3.2ng胰岛素（P<0.001）。在低血糖水平下，观察到相反的趋势：P1胰岛在2.8mM葡萄糖下分泌1.8±0.5ng胰岛素，而P9和P21胰岛分别只分泌0.4±0.3ng和0.3±0.1ng胰岛素（P<0.05）().
我们检查了生理后果体内观察到的差异在体外成熟和不成熟β细胞对葡萄糖的反应。与以前的报告一致4，P1幼崽的血糖水平显著低于P14幼崽。P1的平均血糖浓度为3mM，而P14的平均血糖为6.2mM（P<0.05×10−24) (). 值得注意的是，P1幼崽的平均血糖水平高于导致胰岛素分泌的葡萄糖浓度在体外在P1胰岛中。如果在体外未成熟β细胞在低血糖水平下分泌胰岛素的观察()保持正确体内新生儿血液中的胰岛素水平应较高。与此预测一致，P1幼崽血液中的胰岛素水平几乎是P14动物的两倍()尽管我们注意到非禁食动物的血胰岛素具有高度的变异性。我们还使用电子显微镜检查了每个阶段β细胞中的胰岛素颗粒(). 与P10β细胞相比，P1β细胞含有的胰岛素颗粒大约少2倍，表明胰岛素分泌的机制不同。
为了找到表达模式与β细胞成熟相关的分子标记，用FACS对P1或P10动物表达Pdx1-EGFP的β细胞进行分类，并用转录阵列比较其全局基因表达模式。使用Pdx1-EGFP菌株代替胰岛素-EGFP菌株，因为在后一种动物中观察到轻度糖尿病表型。我们还分析了E18.5胚胎和成年小鼠的β细胞()进一步减少其转录差异与GSIS成熟无关的基因数量。值得注意的是，通过这种方法测试的功能成熟和不成熟β细胞的基因表达谱非常相似().
已提出各种分子机制来解释与成人β细胞相比，胎儿和新生儿β细胞中观察到的GSIS无效。这些包括ATP-调节K的不敏感性+通道5,6，葡萄糖转运蛋白表达减少6，葡萄糖激酶活性低7或低水平的β细胞选择性缝隙连接蛋白连接蛋白368最近，成年小鼠β细胞中转录因子NeuroD1的基因消融9或合并删除Foxa1和Foxa210产生具有未成熟GSIS表型的β细胞。因此，我们首先评估了已知的β细胞基因，其表达水平可以解释成熟和不成熟β细胞之间的功能差异。我们检测了β细胞转录因子（Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD1、Foxa1、Foxa2、MafA、MafB和Hnf4a）、参与葡萄糖传感和胰岛素分泌的关键蛋白（葡萄糖激酶、谷氨酸、Cav6.1、Kir6.1、Sur1、Pcsk1和Pcsk2）、β细胞选择性缝隙连接基因Connexin36以及胰岛素1和胰岛素2基因的表达水平。我们还观察了组织特异性葡萄糖转运蛋白（谷氨酸1、3和4）和己糖激酶（己糖激酶1、2和3）(). 大多数基因的RNA表达水平在未成熟细胞和成熟细胞之间没有显著变化（或表达变化不到两倍，使其不适合对成熟β细胞进行开/关检测）。一个例外是转录因子MafB，它在未成熟β细胞中的表达水平是以前的2.5倍11.
接下来，我们检查了所有在未成熟细胞和成熟细胞之间表达变化超过两倍的基因。我们排除了在E18.5和P1或P10与成人之间表达也发生显著变化的基因，从而将重点放在了在β细胞成熟的时间窗内特异性改变表达的基因（I组和II组). 我们发现71个基因（81个探针）在β细胞成熟过程中上调，66个基因（72个探针）下调(补充表1). 在前一组中，36个基因是腺泡相关基因（在补充表1)这最好解释为外分泌组织在此阶段迅速扩张，从而增加了在FACS分选过程中小腺泡细胞污染的可能性，并导致腺泡基因上调的误导性指示。我们选择了16个基因（在补充表1)其中β细胞的表达先前已有报道，并用western-blotting和免疫组织化学方法分析其蛋白表达水平。从所有这些分析中，一个强有力的候选基因出现了：Urocortin 3（Ucn3）基因。
Ucn3 mRNA水平在未成熟和成熟β细胞之间增加了7倍以上，在E18.5和成人之间增加了近10倍(和补充表1). 免疫荧光染色显示，Ucn3在所有成人β细胞中高度表达，但在E18.5胚胎的胰岛中未检测到(). 与胰岛素一样，成人胰岛中Ucn3蛋白的信号强度因细胞而异。这种变化与胰岛素强度的变化无关，因为显示胰岛素高染色强度的细胞同时显示Ucn3高和低染色强度，反之亦然。未观察到Ucn3与胰高血糖素、生长抑素或胰多肽共定位(补充图1).
Ucn3是一种在大脑和胰腺区域表达的分泌蛋白，据报道仅由胰岛中的β细胞表达，而不由其他内分泌细胞表达12.李等.12,13发现成年小鼠的β细胞分泌Ucn3是由高糖诱导的，并且该基因在高糖浓度下对GSIS有积极影响。我们试图使胎儿β细胞成熟在体外在重组Ucn3蛋白存在下培养数天，但未观察到重组蛋白对细胞GSIS图谱的任何影响，表明Ucn3本身不能诱导β细胞成熟（数据未显示）。Ucn3基因敲除小鼠是否存在β细胞成熟缺陷尚待确定。
接下来，我们研究了β细胞成熟期额外时间点的Ucn3表达模式。在P1幼崽的任何胰岛中均未检测到Ucn3蛋白(). 在P6，Ucn3主要在大胰岛中表达，而不是在小β细胞聚集物中(). 通过P22，在所有β细胞中强烈检测到Ucn3蛋白(). 使用抗Ucn3和胰岛素抗体进行细胞内FACS分析，以量化β细胞中Ucn3表达的百分比和水平。在E18.5，90.2±1.7%的β细胞单独表达胰岛素，9.8±1.7%也对Ucn3染色较弱(). 在这个年龄段，FACS检测到的小群体中Ucn3的低表达水平可能太低，无法通过组织切片上的常规免疫荧光检测到。在P6，55.1±1.6%的β细胞对Ucn3呈阴性或表达低水平的蛋白质，而44.9±1.6%β细胞表达高水平的Ucn3和胰岛素(). 到P13时，在成熟窗口结束时，93.5±1.5%的β细胞表达高水平的Ucn3，只有6.5±1.5%表达胰岛素(). 成熟过程中β-细胞中Ucn3的增加是渐进的，正如平均Ucn3信号强度的变化所示(补充图2A). 胰岛素的信号强度不变，表明胰岛素蛋白的表达在这段时间内保持不变(补充图2B). 这种Ucn3的混合表达模式可以解释为什么在P2和P9之间观察到“边缘成熟”表型。
Ucn3的表达在小鼠β细胞成熟过程中逐渐增加体内分化成熟后在HESC衍生的β样细胞中表达体内，但分化后不会体外试验。（A–C）P1、P6和P22小鼠胰腺上Ucn3（绿色）和胰岛素（红色）的免疫染色。（D–F）放大插图分别显示在A–C中。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺=50μm。（A、D）即使在大的胰岛中，P1也未检测到Ucn3。（B、E）在P6，一些大胰岛表达Ucn3，但小聚集体不表达肽（箭头）。（D、F）在P22，Ucn3在所有胰岛中高度表达。（G–I）E18.5、P6和P13的胰岛素和Ucn3的细胞内FACS分析。上象限中的数字表示所有胰岛素表达细胞（上两个象限）中仅胰岛素（左）或胰岛素和Ucn3共表达细胞（右）的百分比，计算为每个年龄组三个独立生物重复序列（三个独立窝）的平均±sem。（J）HESC分化实验方法概述。Oct4标记的HESC（ES，红色）被区分在体外进入以Sox17标记的最终内胚层（DE，黄色），然后进入以Pdx1和NKX6.1表达标记的胰腺祖细胞（PP，绿色）。将细胞移植到SCID-米色小鼠中以完成成熟体内. (K,L（左）)上的Ucn3（绿色）和胰岛素（红色）免疫染色在体外分化细胞在两倍放大镜下显示（K，低倍；L，高倍）。体内分化（移植）细胞如图所示(M（M）). 细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺=50μm。Ucn3表示为体内成熟细胞，但不在在体外分化的胰岛素阳性β样细胞。
最后，我们希望确定Ucn3是否可以作为来自人类多能干细胞（HPSCs）的功能成熟β细胞的标记物。在成人供体胰腺切片上用抗Ucn3抗体进行免疫分析，结果表明该基因由所有胰岛素阳性β细胞表达，并被排除在胰高血糖素表达α细胞之外。一小部分生长抑素和PPT表达细胞也表达Ucn3(补充图3). 为了观察移植后人类ESC衍生β细胞成熟过程中是否诱导Ucn3，采用4步方案将人类胚胎干细胞分化为Pdx1和NKX6.1阳性胰腺祖细胞14。然后将这些细胞分化在体外再持续3天，变成胰岛素阳性的β样细胞（参见和补充材料和方法详细信息）。分别将含有少量胰岛素阳性β样细胞的4期Pdx+Nkx6.1+胰腺祖细胞簇移植到SCID-米色小鼠的肾包膜，在那里进一步分化成熟体内(). 对移植动物进行的葡萄糖耐量测试显示，移植后12周，空腹人类C肽水平高于背景水平(补充图4). 尽管移植小鼠之间禁食人类C肽的差异很大，但除一只动物（6/7）外，所有动物的血液人类C肽都增加了1.7倍至7.6倍（平均2.8±0.9倍），这表明移植的人类胚胎干细胞（HESC）衍生的细胞成熟为葡萄糖反应性β细胞。免疫染色显示在体外分化的β样细胞表达胰岛素，Ucn3染色阴性(). 相反体内成熟细胞胰岛素和Ucn3蛋白染色阳性(). 移植中人类Ucn3的这种表达仅限于β细胞；在任何胰高血糖素、生长抑素或PPY表达细胞中均未检测到Ucn3蛋白(补充图5).
总之，我们提出了一个成熟β细胞的操作定义，该定义基于在发育过程中改变GSIS反应的葡萄糖阈值。我们还鉴定了一种分子标记物，Ucn3，用于区分成熟和未成熟的β细胞。值得注意的是，我们发现Ucn3在HESC衍生的β-细胞成熟后被诱导体内高通量筛选现在可以利用GSIS和Ucn3表达的差异作为研究基准，以寻找诱导功能性β细胞成熟的条件在体外.
