eIF6通过结合翻译与转录来协调胰岛素敏感性和脂质代谢

eIF6自主刺激脂肪酸合成细胞

血胆固醇和ATP肝水平的变化提出了一个问题，即eIF6引起的代谢变化是细胞自主性的还是间接的系统性事件引起的，例如食物摄入/吸收减少或基础代谢率增加。我们分析了从小鼠分离的原代肝细胞的代谢参数(图2a). 与wt相比，eIF6 het肝细胞具有50%的eIF6蛋白(补充图2a)、和，与体内表型，它们不能增加胰岛素刺激后的蛋白质合成(补充图2b). eIF6 het细胞的葡萄糖摄取与wt相同，与观察到的正常GTT一致体内(补充图2c). eIF6缺失的3T3-L1细胞葡萄糖摄取也正常(补充图2d). 值得注意的是，与wt肝细胞相比，eIF6原代het肝细胞的从头开始脂肪生成(图2b). 胰岛素刺激糖酵解。我们发现原发性het肝细胞的糖酵解显著减少，这与乳酸分泌有关(图2c). 喂食条件下脂肪酸氧化(图2d)wt和het之间没有显著变化。eIF6 het小鼠肝细胞的ATP浓度也降低(图2e). 这些结果反映了肝脏状况，体内，如中所述图1为了研究eIF6是否能急性控制ATP水平，我们要么通过慢病毒介导的shRNA在wt肝细胞中沉默eIF6，要么通过慢毒介导的感染在het肝细胞重新表达eIF6。简言之，我们发现，在wt肝细胞中，eIF6急性耗竭降低了细胞内ATP(图2f)而eIF6在het中的过度表达增加了它(图2g). 我们询问eIF6是否可以控制已建立细胞系的代谢活性。AML12细胞来源于非肿瘤性小鼠肝细胞。在AML12细胞中，我们发现shRNA耗竭eIF6可减少糖酵解（以乳酸分泌量衡量）(图2h)，和ATP含量(图2i)。

在单独的窗口中打开

图2

eIF6活性细胞自主控制脂肪酸合成、糖酵解和ATP水平。

(一)分析大纲。按照规定分离和分析小鼠的原代肝细胞。对生物复制品进行的实验。所有数据均以对照组的百分比（wt）表示，并对同窝一对小鼠的原代细胞进行分析。(b条)从头开始脂肪生成，通过标记测量D类-【6】-¹⁴C] -eIF6 het小鼠细胞中的葡萄糖和随后的脂肪酸分析减少。细胞保存在100 nM胰岛素和20 mM葡萄糖中。N个=6 (c（c）)eIF6 het小鼠肝细胞中的乳酸分泌（糖酵解通量的指标）减少。基本值约为30μg⁻¹蛋白质每小时。N个=6. (d日)脂肪酸氧化不受显著影响（对照的基础值约为1000 c.p.mμg⁻¹蛋白质）。N个=4 (e（电子）——克)ATP内容取决于eIF6级别：(e（电子）)eIF6 het小鼠与wt小鼠相比，ATP降低。(（f）)eIF6的急性耗竭导致eIF6中ATP水平的降低^+/+细胞，而(克)eIF6水平的恢复导致eIF6中ATP的增加^+/负极细胞。(小时)乳酸分泌，如(（f）)AML12细胞中eIF6 shRNA之后。(我)ATP（如中所示）(d日)在AML12细胞中eIF6 shRNA之后。在所有面板中，数据均表示为平均值±标准差P（P）值通过双尾计算t吨-测试(*P（P）值≤0.05***P（P）≤0.001). (e（电子）——我),N个=3.

mTORc1途径参与对营养素和生长因子的反应。我们测试了eIF6是否作用于mTORc1激活的上游。eIF6水平的调节不影响mTORc1-S6K级联底物Ser235和mTORc1底物4E-BP1处rpS6的磷酸化(补充图2e). 综合数据表明，eIF6翻译活性以细胞自主方式引导细胞代谢。具体来说，eIF6诱导糖酵解和脂肪酸合成。

胰岛素-干扰素6调节脂肪生成因子的翻译

数据来自图1和​和22表明eIF6驱动调节脂肪转换的特定因子的翻译。我们分析了eIF6如何通过使用快速强力霉素诱导系统和多体微阵列来调节胰岛素刺激的翻译。强力霉素治疗48小时后，AML12细胞与诱导的eIF6 shRNA呈现eIF6减少(补充图3a)和对胰岛素刺激的蛋氨酸掺入的抵抗(补充图3b). 胰岛素刺激细胞的多聚体分析表明，eIF6下调降低了多聚体/80S比率，正如eIF6抗结合活性的丧失所预期的那样(图3a). 在非模拟条件下，eIF6缺乏不会影响多聚体峰(补充图3c)。

在单独的窗口中打开

图3

eIF6翻译活性控制脂肪生成转录因子的表达。

(一)eIF6抑制和胰岛素给药降低了整体启动，如多聚体/80S比率所示。数据表示为平均值±标准差。统计P（P）值通过双尾计算t吨-测试(n个=4***P（P）值≤0.001）。(b条)分析和定量结果概述：mRNA的一个子集与eIF6 shRNA多聚体差异性缺失（绿色）。通过分位数方法获得归一化比率。考虑到多胞体面积减少的校正表明，更多基因受到eIF6缺乏的影响。(c（c）)基因本体分析表明，从标准化比率库来看，eIF6受影响的基因中代谢占主导地位(P（P）值≤10⁻¹²). (d日)eIF6缺乏症影响基因的结构5′-UTR分析。eIF6缺失细胞的多聚体显示富含G/C的5′mRNA减少（绿色框）(e（电子）)eIF6 shRNA上的多聚体中缺乏与脂肪生成有关的转录因子。包括其5′UTR的结构特征。(（f）)C/EBPδ蛋白表达受eIF6调节。通过慢病毒给药，eIF6增加诱导C/EBPδ。慢病毒介导的shRNA导致eIF6缺失，从而降低C/EBPδ。对AML12肝细胞和重组间充质干细胞进行三次代表性实验(克)在eIF6缺失的细胞中，成脂转录因子C/EBPβ（LIP亚型）减少。左侧，C/EBPβ的mRNA结构通过差异翻译生成三种亚型（箭头：翻译起始位点）。带有蓝色箭头的蓝色小方框是C/EBP uORF。右面板显示LAP、LIP和C/EBPβ亚型的斑点：LIP亚型特异性下调。（代表性实验一式三份）。(小时)ATF4报告器翻译依赖于eIF6。利用天然ATF4 uORF下游克隆的荧光素酶（蓝盒）进行再激活的报告人试验。eIF6上调会增加ATF4翻译报告活性，eIF6下调会降低ATF4的翻译报告活性。数据会根据cap-dependent firefly控件的翻译进行标准化。黑色大箭头表示第二个uORF的终止密码子。小箭头是起始密码。蓝盒子是记者。统计学P（P）值通过双尾计算t吨-测试，如上所述(*P（P）值≤0.05**P（P）≤0.01; ***P（P）≤0.001).

接下来，我们通过微阵列分析来分析胰岛素刺激细胞的多聚体或亚多聚体的mRNA(n个=4；图3b；补充数据1). 分析表明，eIF6缺失导致1000多个mRNAs的多体占有率下降(图3b). 此外，在校正多糖体占位，即多糖体相关mRNA的绝对数量后，我们发现在AML12细胞中表达的多达1/3的基因被eIF6缺失抑制（5312/15405；图3b). 我们的结论是，在胰岛素刺激和eIF6耗竭的条件下，mRNA的大部分亚群≈1000受到强烈抑制。对这些mRNA进行了进一步分析。

对强抑制mRNA的基因本体分析表明，它们参与了代谢过程和翻译(图3c). 值得注意的是，甾醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）是一种控制葡萄糖代谢和脂肪酸产生的转录因子，由mTOR调节（参考文献。30)，未发现eIF6在多胞体水平调节(补充数据1). 序列分析表明，受eIF6缺失抑制的最受影响的mRNA在其5′UTR中含有富含G/C的区域(图3d). 一些参与脂质合成的转录因子在富含G/C的mRNA组中被eIF6缺失在多胞体水平下调(图3e). 相比之下，G/C含量较少的mRNA更容易与多聚体竞争(图3d)，在没有eIF6的情况下。接下来，我们通过量化一些脂肪生成转录因子在蛋白质水平上基于eIF6的调节来测试多体预测的相关性。C/EBPδ（参考。31)是一种脂肪生成转录因子32我们发现eIF6正向调节C/EBPδ蛋白，正如多胞体丰度预测的那样，即eIF6缺失降低C/EBPΔ蛋白，eIF6上调增加C/EBP△蛋白(图3f). 在相同条件下，eIF6缺失导致多聚体上C/EBPδmRNA下调(补充图3d). 对eIF6缺失导致多聚体上脂肪生成转录因子下调的序列分析也表明存在含uORF的mRNA。uORF抑制翻译，充当下游ORF的绝缘体，除非通过重新初始化或泄漏扫描释放。经典地，uORF与感知应激有关，包括氨基酸缺乏33,34我们的实验表明，含有uORF的转录因子也可能参与脂质生物合成。我们测试了两种包含已建立uORF序列的转录因子，C/EBPβ和ATF4。C/EBPβ调节脂肪生成35C/EBPβmRNA通过交替翻译产生三种亚型，即LAP*（C/EBP？）、LAP和LIP（参考文献。36). eIF6 shRNA下调C/EBPβmRNA多体占有率(补充图3e). 在相同条件下，我们观察到C/EBPβ的LIP翻译产物持续下调，而LAP没有下调(图3g和​和5e）。第五版). ATF4是一种经典的转录因子，其uORF通过再启动在翻译水平上进行调节。ATF4与UPR紧密相连37然而体内ATF4缺失表型与eIF6敲除表型相似，具有较低的胆固醇血症和对脂肪积累的抵抗力38然后，我们使用荧光素酶报告子上游含有ATF4 uORFs的mRNA，专门测量其在eIF6调制条件下的翻译效率。我们发现eIF6缺失会降低ATF4报告活性，而eIF6过度表达会增加ATF4的报告活性(图3h)。

在单独的窗口中打开

图5

Fasn水平由eIF6活性控制。

(一)肝细胞和原代干细胞的抢救策略。用eIF6 shRNA或wt eIF6转导细胞，检查eIF6蛋白水平并分析Fasn mRNA和蛋白。(b条)AML12肝细胞中诱导型shRNA对eIF6的下调导致Fasn mRNA的减少(c（c）——d日)eIF6对分化为脂肪细胞的间充质干细胞中Fasn mRNA水平有直接影响。wt或het干细胞要么用组成性eIF6 shRNA转导(c（c）)或wt eIF6(d日)并检测Fasn的表达。观察到eIF6水平和Fasn水平之间存在直接相关性。(e（电子）)Fasn蛋白受AML12和EMSC脂肪细胞中eIF6水平的控制。EMSC实验显示wt细胞中eIF6下调或het细胞上调。注意Fasn和LIP亚型的eIF6依赖水平。在所有面板中，数据均表示为平均值±标准差面板e（电子）显示了两个独立的eIF6 shRNA的作用，构成（右）或诱导。统计学P（P）值通过双尾计算t吨-测试(*P（P）值≤0.05**P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001). 对至少两个独立实验的生物三倍体进行实时实验和蛋白质印迹。实时显示一份一式三份。

总之，我们证明eIF6降低会阻碍特定mRNA调节代谢的胰岛素调节翻译。具体来说，我们发现参与脂肪生成的多个转录因子的翻译激活发生了强烈变化，这与图1和​和2，2，并预测进一步的基因表达调控。

eIF6轴引发翻译为转录程序

肝脏是一个主要的胰岛素反应器官，通过诱导蛋白质合成对高营养素和高胰岛素作出反应。由eIF6调节的观察结果驱动从头开始脂肪生成和（一些）脂肪生成转录因子的翻译，我们旨在确定影响下游的基因。我们同时评估了喂食条件下wt和het小鼠肝脏中稳态mRNA水平和多聚体相关mRNA(补充数据2). 为了清楚起见，我们只描述了其水平在稳定状态下发生变化的mRNA（总量）。在稳态mRNA水平上，eIF6缺失的基因表达特征与eIF6活性所掌握的代谢和快速翻译变化一致，并延伸了它们。简言之，eIF6缺失诱导了一种特殊的基因表达特征，其特征是编码调控细胞周期、DNA包装、胆固醇和脂质生物合成以及糖酵解的关键蛋白的mRNA下调(图4a、b；补充图4a). 脂质生物合成程序在肝脏和脂肪中受到影响，但在大脑中不受影响(图4b)。

在单独的窗口中打开

图4

eIF6缺失在胰岛素反应组织中诱导特异性转录标记。

(一)成人肝脏的微阵列分析显示eIF6 het小鼠的基因表达发生了广泛的重塑。eIF6 het肝脏中的协同转录变化在稳态水平上确定了一种深刻的代谢重编程，与脂质生物合成的减少一致，并对染色质重塑和细胞周期产生额外影响。(b条)多器官的微阵列分析。肝脏、脂肪和大脑的热图分析显示，脂肪和肝脏中的脂质生物合成过程受到抑制，但大脑中没有。该量表表示通过使用修改的Fisher精确检验（EASE得分）获得的基因本体术语丰富程度的统计显著性。这会产生一个P（P）值，然后使用FDR（Benjamini）对其进行多次测试校正。1.3=P（P）值≤0.05，2=P（P）值≤0.01，3=P（P）值≤0.001，5=P（P）值≤0.00001(c（c）)脂肪酸合成、糖酵解和胆固醇合成途径中受eIF6水平影响的基因概述。所有蓝色标记的基因在转录水平上下调。(d日)对选定靶点的实时分析验证了所有靶基因（肝组织）。这里，我们展示了在不同动物群上进行的具有代表性的生物三重实验，（五个用于eIF6和Fasn，两个用于其他动物）（数据显示为n个=3; 平均值±标准差）。(e（电子）)在蛋白质水平上也发现了一致的变化。Hmgcr、Fasn（在mRNA水平下调）和Pgc-1α（在mRNA水平上调）的代表性印迹，一式三份。另请参见补充图4. (n个=3).

基因本体分析表明，由于eIF6缺失，参与脂肪酸、甾醇合成和糖酵解的所有酶都显著减少了两倍以上(图4c). 其中，我们发现ATP环化酶、乙酰辅酶A羧化酶1和脂肪酸合成酶（Fasn）参与脂肪生成、长链脂肪酸家族成员6的伸长和硬脂酰辅酶A去饱和酶1催化脂肪酸伸长和去饱和步骤；Hmg-辅酶A合成酶和Hmg辅酶A还原酶（Hmgcr）参与胆固醇生物合成。胆固醇调节转录因子Srebp2在肝脏中下调(补充图4). 在eIF6缺失时发现两种主要的胰岛素调节转录因子上调：Foxo1，这表明胰岛素信号与eIF6驱动的代谢控制和Pgc1-α之间存在密切联系（参考文献。39)，是参与线粒体生物生成并在脂肪生成过程中下调的关键转录因子(补充图4c信使RNA在稳态水平上受到慢性eIF6耗竭的不同影响，体内，在多个样本和年龄上验证(图4d；补充图4b、c). 对于Fasn、Hmgcr、Pgc1-α和Foxo1，这些变化也在蛋白质水平上得到证实(图4e)。

接下来，我们询问eIF6诱导的变化是局限于肝脏还是也存在于其他胰岛素反应器官。白色脂肪组织由全身胰岛素控制。相反，由于血脑屏障，大脑对全身胰岛素无反应。eIF6缺乏导致脂肪和肝脏中基因表达的协同变化，但大脑中没有(图4b；补充数据3). 有趣的是，eIF6脂肪和肝脏共同下调调节脂质和胆固醇合成的途径(图4b、c). 肌肉也是主要的胰岛素反应器。对不同年龄段的肝脏、脂肪、肌肉和大脑的分析表明，慢性eIF6缺乏导致Fasn mRNA的协同下调和Pgc1-αmRNA的增加39在所有胰岛素反应组织中，但不在大脑中(补充图4c). 肌肉、脂肪和肝脏的总体趋势是一致的，但并非所有研究基因的大脑都有一致的趋势，但肝脏特异性的Zbtb16和肌肉中没有变化的Foxo1除外(补充图4c)。

总之，我们表明，由于eIF6缺失，翻译受损会导致胰岛素反应组织中代谢关键蛋白mRNA水平的基因表达发生稳定和协调的变化，从而导致脂肪生成减少。因此，eIF6是代谢的翻译调节因子，作用于转录的上游。

Fasn是eIF6激活的标志物

Fasn是脂肪酸合成的速率限制酶40主要由胰岛素诱导。我们证明，肝脏中的eIF6慢性耗竭降低了其水平(图4)eIF6诱导脂肪生成转录因子的翻译。因此，我们询问eIF6是否能快速诱导Fasn mRNA表达。我们在两个模型中解决了这个问题，即肝来源的AML12肝细胞和分化为脂肪细胞的间充质干细胞（EMSC）。我们在这些模型中重建或耗尽eIF6(图5a). 我们发现，通过使用AML12肝细胞中eIF6的诱导shRNA来耗尽eIF6，导致Fasn mRNA水平降低(图5b). eIF6缺失导致分化为脂肪细胞的wt-EMSC中Fasn mRNA的减少(图5c). 分化为脂肪细胞的Het EMSC表达的eIF6少于wt细胞。接下来，我们在分化为脂肪细胞的het EMSC中重新表达eIF6。eIF6在het-EMSC脂肪细胞中的再表达恢复了Fasn mRNA水平(图5d)。

三种替代机制可解释eIF6过度表达或缺失时Fasn mRNA的增加/减少。首先，Fasn mRNA稳定性的变化；第二，eIF6表达对调节Fasn mRNA转录的信号通路的影响，如mTOR通路；第三，形成脂肪酸合成的转录因子的翻译调控。为了评估Fasn mRNA的稳定性，我们在放线菌素D治疗eIF6耗尽的肝细胞和匹配的对照组后进行了一项时间过程实验。我们确定eIF6缺失不会降低Fasn mRNA的稳定性(补充图5a). mTOR控制翻译和脂肪生成途径。为了排除eIF6缺失损害mTOR或Akt途径的可能性，我们检查了mTORc1和mTORc 2底物的磷酸化状态（尽管eIF6不是mTOR激活的下游）。我们发现，eIF6缺失虽然会产生迟钝的胰岛素翻译反应，但不会引起脂肪生成途径（如mTORc1、mTORc2和ERK）磷酸化的改变(补充图5b). 在eIF6耗竭延长的het小鼠肝脏中，IRS1、Akt、ERK、S6和4E-BP1的磷酸化也没有改变，这与eIF6未改变的胰岛素信号一致(补充图5b)。

最后，与eIF6通过转录因子的翻译调节Fasn转录的假设相一致，eIF6的缺失或过度表达同时调节了Fasn蛋白和C/EBPβLIP亚型(图5e). 因此，在我们的系统中，Fasn表达可以作为模型mRNA来测试eIF6抑制的效果。

PCR分析

子代小鼠的基因分型如下。简而言之，PCR由AmpliTaq Gold（Roche）根据制造商的协议进行。在缺失区域的下游设计了一个共有引物编号3（5′-GTGAGTCTGTATGTG-3′）。该引物可与wt等位基因特异性引物2号（5′-CTATGTGCTGGTTCCAC-3′）配对，以扩增320 bp的PCR产物，或与新盒中的靶向等位基因特异性引物1号（5’-GCAGCCATCCTTCTATC-3′）配对以扩增突变等位基因的650 bp片段。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上溶解。

GTT–ITT和临床化学

对于GTT，随机雄性小鼠(n个=6）禁食16 h，然后腹腔注射2 g kg⁻¹体重葡萄糖。血糖值由自动血糖监测仪（Glucotrend 2，Roche）和Accu-Chek活性带（Roche56对禁食4小时的小鼠进行ITT，通过IP注射1 U kg的人胰岛素⁻¹在注射前（T0）以及注射后30、60和120分钟，按照上述方法监测血糖水平。血液通过逆行穿刺收集，5000离心克持续10分钟，并通过Olympus AU400化学分析仪使用血浆测量空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、非必需脂肪酸水平和肝功能标志物。

细胞培养

我们使用293T（ATCC CRL-3216）和AML12（ATCC CRL-2254）细胞。每月对细胞进行支原体检测，并在添加有10%胎牛血清、胰岛素、转铁蛋白和硒（Invitrogen）混合物的Dulbecco改良Eagle's培养基/火腿F-12（GIBCO）中生长，40μg ml⁻¹地塞米松和青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液（AML12）或如上所述完全补充但使用Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；293T）。shRNA-慢病毒载体感染后，选择5μg ml的细胞⁻¹用1 mg ml诱导嘌呤霉素和shRNA⁻¹强力霉素。对于mRNA稳定性实验，放线菌素D 5μg ml⁻¹向AML12细胞中添加4、8和24小时。对于药物治疗，在进行多糖体剖面分析之前，用环丙沙星15μM、曲古菌素A 100 nM、MS-275 10μM和嘌呤霉素7μM处理细胞30分钟，或用48小时进行基因表达分析。

慢病毒感染

用包装质粒VSV-G、PMDLg/pRRE、pREV和转移载体pCCL-PPT-hPGK感染293T细胞美国型培养物集落（ATCC）57在转移载体中克隆了全长wt或Ser235Ala突变体eIF6和GFP。用eIF6wt-pCCL、eIF6S235A-pCCL和GFP-pCCL感染原代肝细胞。确定感染的多重性，以通过至少三次感染实现eIF6的双重表达。在shRNA实验中，293T细胞被包装质粒ENV、pMDG、pΔ8.74和pGIPZ质粒感染，这些质粒携带干扰shRNA或两个eIF6特异性shRNA，这是在筛选了四个序列后定义的。对于eIF6的可诱导shRNA，使用托马斯·韦斯特布鲁克善意提供的pINDUCER11质粒58成熟的反义序列为：5′-AGCTTCCTACTAGCCACCTG-3′；5′-AGAAGTTCTCTGAGCCTCC-3′（开放生物系统）。

双重荧光素酶分析

采用磷酸钙法对AML12细胞进行质粒转染，转染率为50%。使用TK-ATF4-Luc融合质粒（由Ronald C.Wek善意提供）和作为内部对照的Renilla荧光素酶质粒（Promega）共转染50%融合AML12三次。转染后（40 h），AML12细胞用100 nM的thapsigargin处理6 h或无内质网（ER）应激。蛋白质定量后，根据Promega说明书进行双重荧光素酶分析。三个独立实验的平均值表示为萤火虫与肾小球荧光素酶单位（相对光单位）的比率。

耳间充质干细胞培养与脂肪生成

eIF6外耳间充质干细胞^+/+和eIF6^+/负极收集小鼠并用补充有4%胎牛血清、1.7μM胰岛素、1μM地塞米松和0.5 mM IBMX的DMEM-F12将其分化为成脂谱系59持续10天。将分化细胞固定在10%的福尔马林缓冲液中，并用油红O染色10分钟。用异丙醇洗脱细胞保留的染料，并通过在500 nm处测量吸光度进行量化。

肝细胞分离

通过腹腔注射阿维汀对3个月大的小鼠或4周大的幼鼠进行麻醉。肝脏灌注就地使用两种不同的灌注介质通过门静脉：T1溶液pH 7.4（0.9%NaCl、0.05%KCl、0.2%HEPES和0.08 mg ml⁻¹EGTA）和T2溶液pH 7.4（0.6%NaCl，0.05%KCl，1.2%HEPES，0.07%CaCl₂和3 g ml⁻¹胶原酶I型）。流速为5 ml min⁻¹胶原酶消化后，肝细胞通过70μm细胞过滤器过滤，并通过37.5%PERCOLL缓冲垫（Amersham）。将活细胞颗粒重新悬浮在DMEM-F12中，并在5%CO下回收₂开始实验程序前，37°C持续16小时60配对的室友总是被平行分析。

蛋白质合成测量³⁵S-蛋氨酸标记

原代肝细胞或AML12肝细胞用于翻译率分析。将细胞接种在六孔板中的亚汇合处，并在100 nM下进行胰岛素刺激30分钟。如前所述进行代谢标记22。

葡萄糖摄取

葡萄糖摄取量作为放射性标记的2-脱氧葡萄糖的掺入量进行测量61在肝细胞和3T3-L1分化的脂肪细胞中。简言之，2×10⁵在12孔板中培养每个孔的细胞，并将其缺血清16 h。然后用Krebs-Ringers Henseleit（KRH）缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，136 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.25 mM MgSO）清洗细胞两次₄和1.25 mM CaCl₂)含0.1%牛血清白蛋白（BSA），在0.45 ml KRH/BSA中孵育15分钟，然后添加0.1μM冷2-脱氧-D类-葡萄糖和0.5μCi 2-脱氧-D类-[^三H] -葡萄糖（Perkin-Elmer）培养4分钟。培养后，将细胞置于冰上，用冰镇PBS洗涤两次，并在0.5 ml 0.05%十二烷基硫酸钠（SDS）中溶解。使用Beckman LS6500闪烁计数器在5 ml闪烁液中对裂解液（0.4 ml）进行计数。在用细胞松弛素B（10μM，Sigma）预处理10分钟的样品中测定非特异性葡萄糖摄取率，并从总摄取量中减去。特定葡萄糖摄取量标准化为蛋白质含量。

乳酸分泌的测量

肝细胞在2×10的条件下培养⁵12孔培养皿中每孔细胞在高糖培养基中培养24小时（参考。62). 将细胞切换到无血清高糖培养基中培养4 h。使用乳酸检测试剂盒（Biovision）的荧光模式测量分泌到培养基中的乳酸。计算每个条件重复的平均荧光强度。将数值归一化为从相同的孔中获得的蛋白质含量30。

从头开始脂肪生成

肝细胞在2×10的条件下培养⁵在12孔培养皿中，在无血清、高糖培养基中培养20小时，每个孔的细胞数被切换到无血清、低葡萄糖（1 gr l⁻¹)介质加4μCi ml⁻¹ D类-[6-¹⁴C] -提取脂肪前，葡萄糖（Perkin-Elmer）持续4小时。作为背景对照，一个样品在提取前仅标记1分钟。细胞在0.5%Triton X-100中溶解之前，用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）清洗两次。通过旋涡连续添加氯仿和甲醇（2:1 v/v）提取脂质部分。用水清洗后，通过低速离心（1000转/分，15分钟）实现相分离。¹⁴在3ml闪烁液中计算C掺入低脂相的数量。每种情况都进行了三次分析。减去背景值后，将平均读数标准化为蛋白质含量30。

脂肪酸氧化

将肝脏在含有0.25M蔗糖、10mM Tris和1mM EDTA（或EGTA）的蔗糖Tris-EDTA（STE）缓冲液中匀浆。反应混合物（100 mM蔗糖、10 mM Tris-HCl、5 mM KH₂人事军官₄，0.2 mM EDTA，0.3%无脂肪酸BSA，80 mM KCl，1 mM MgCl₂，2毫米L（左）-肉碱、0.1 mM苹果酸、0.05 mM辅酶A、DTT、ATP和[¹⁴C] -棕榈酸酯）分配到每个样品中，并在37°C下培养60分钟。在孵育期结束时，将反应混合物转移到装有高氯酸和高碱性滤纸的小瓶中，并孵育1小时。然后，滤纸盘，指示CO的量₂通过脂肪酸氧化释放，转移到带有液体闪烁计数鸡尾酒的玻璃闪烁瓶中。在3分钟内测量每分钟平均计数（c.p.m）（参考。63)。

ATP含量

肝脏（200 mg）或AML12细胞在6%（v/v）冰镇HClO中均质₄.提取物在10000下离心克在4°C下保持10分钟。用KCO中和酸性上清液_三用于通过Lundin法测定ATP（ATP测定试剂盒，分子探针）64。

糖原测定

在6%高氯酸（500 ml/100 mg组织）中均匀化来自5 h龄小鼠的肝脏样品。将沉淀颗粒化并收集上清液。一卷H₂添加O，并使用10 N KOH将溶液调节至pH 6.5。然后将每个样品的一部分与五倍体积的淀粉葡萄糖苷酶（1 mg ml⁻¹然后使用Amplex红葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒（Invitrogen）测定葡萄糖浓度。在没有淀粉葡萄糖苷酶的情况下培养的样品用作基线对照62。

组织学染色

从eIF6中切除组织样本^+/+和eIF6^+/负极然后立即将其固定在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中的10%甲醛中。用苏木精和伊红染色对石蜡包埋肝脏的连续3μm切片进行形态学分析或PAS染色。简单地说，切片在0.5%的周期性酸溶液中水合和氧化5分钟。然后，将载玻片置于希夫试剂中15分钟。程序结束时，切片在自来水中清洗，并用苏木精复染1分钟min.在蔡司Axiophot显微镜中观察染色样品，并使用Scion Image Software获取图片。

多体轮廓

多晶体剖面图如下所示。简言之，AML12在30mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM NaCl、30mM MgCl中裂解₂，0.1%NP-40，10毫克毫升⁻¹环己酰亚胺和30 U ml⁻¹纳辛。在50 mM Tris-HCl、pH 7.8、240 mM KCl和10 mM MgSO中轻轻均质肝脏₄，5 mM DTT，250 mM蔗糖，2%Triton X-100，90μg ml⁻¹环己酰亚胺和30 U m⁻¹RNasin使用玻璃搅拌器。肝素（100μg ml⁻¹)添加到肝脏提取物中。在12000转/分、4°C下离心10分钟后，将等量RNA的细胞质提取物加载到15–50%蔗糖梯度上，并在4°C、SW41Ti Beckman转子、39000转/分中离心3小时30分钟。254 nm下的吸光度由BioLogic LP软件（BioRad）和十个组分（1.5分别收集ml）用于随后的蛋白质和RNA提取。

mRNA提取和实时RT-PCR

用TRIzol试剂（Invitrogen）提取来自组织和细胞的总RNA。对于从蔗糖梯度aliquotes中提取的总RNA、亚多体RNA和多体RNA，蔗糖部分被分为两部分。将提取的组分1-6和7-10用于亚多体和多体RNA。然后，将样品与蛋白酶K和1%SDS在37°C下孵育1小时。RNA采用苯酚/氯仿/异戊酸法提取。用RQ1 RNase-freed DNase（Promega）处理总RNA后，根据制造商的说明，用Moloney鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（Promeca）进行逆转录。用合适的引物扩增反向转录互补DNA（100 ng）。为了进行肝脏微阵列验证，使用了针对eIF6（Mm04208296_m1）、Fasn（Mm00662319_m1，Srebp1（Mm00550338_m1。syb-green特异探针：GcK（Fw 5′-ctggacagcagccagatg-3′；Rw 5′-agttgtcccagtct-3′）；Pklr（Fw 5′-ctgatggctgactgtat-3′；Rw；5′-ggcgtagcctcaaacac-3′）；硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Fw 5′-CTGACTGAAAGCCGAAGAGAGA-3′；Rw 5′-GCGTGAGCAGAGTA-3′）；Hmgcr（Fw 5′-TGTCACCGGCAACACAGAA-3′Rw 5′-CCGCGGTTATCAGAGAGA-3′）；Lxra（Fw 5′-GAAGGAGAGCCTTGCGTA-3′Rw 5′-ATTTGGTTGGGTCAAGG-3′）；使用Lxrb（Fw 5′-GTTCCAGGCAACAGAGTC-3′Rw 5′-CAGAGAACTGTGGGGAAG-3′）。在ABIPRISM 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）上，使用Taqman Universal PCR Master Mix（4304437；Life Technologies，Invitrogen）的ΔΔCt-method，以18S rRNA作为内部标准，通过定量反转录酶PCR（RT–PCR）对Srebp1、Srebp2、Chrebp靶mRNA进行定量。对于多体微阵列验证，使用了以下探针：Cebpd（Fw 5′-ATCGACTCGCCTACT-3′，Rv 5′-GCTTTTGTGGTGTGTGTTGAA-3′）；Cebpb（Fw 5′-CAAGCTGAGAGAGACGAGAGTACA-3′Rv 5′-AGCTGCTCCACCTTCTG-3′）。在ABIPRISM 7900HT序列检测系统（AppliedBiosystems）上，使用SYBR Green Master Mix（4344463，Life Technologies，Invitrogen），使用ΔΔCt-method，以18S rRNA作为内部标准，通过定量RT-PCR对靶mRNA进行量化。数据表示为目标基因相对数量的百分比。结果表示为三个独立实验的平均值+s.d。

微阵列杂交和生物信息分析

使用小鼠基因组430 2.0阵列（Affymetrix）对小鼠组织进行转录分析。根据标准Affymetrix协议（Affymetix基因芯片流体工作站）进行标记反应和杂交。使用稳健多阵列平均算法对原始微阵列数据进行标准化65.使用微阵列显著性分析检测差异表达基因66一种基于置换的方法，允许选择所需的错误发现率（FDR）。FDR<10%的差异表达基因被认为是显著的。差异表达基因列表已使用基于网络的应用程序DAVID进行功能注释67.A型P（P）计算每个基因本体术语的值或EASE得分（用改进的Fisher精确检验进行基因-术语富集的显著性）。采用Benjamini–Hochberg FDR多重测试校正，并选择FDR<10%的阈值来选择特定基因本体术语或《京都基因和基因组百科全书》路径的显著富集。

为了对AML12进行微阵列分析，根据制造商的协议，在安捷伦SurePrint G3小鼠GE 8x60K微阵列G4852A上杂交多体和亚多体RNA。实验以生物四份进行。用安捷伦DNA微阵列扫描仪G2505C以3μm分辨率和制造商软件（安捷伦扫描控制8.1.3）对杂交微阵列载玻片进行扫描。对扫描的TIFF图像进行数值分析，并根据安捷伦标准协议GE1_107_Sep09使用安捷伦特征提取软件10.7.7.1版对背景进行校正。使用R软件环境进行统计计算，分析特征提取的输出(http://www.r-project.org/)和生物统计软件包的生物导体库(http://www.bioconductor.org/). 低信号安捷伦特征通过在每个条件下大多数阵列上重复的“未检测”标志进行区分，从分析中过滤掉，留下18905个特征对应于14108个特征管理信息基因。用分位数方法对阵列间的信号强度进行了归一化。使用线性模型鉴定差异表达基因（DEG）的多体、亚多体和翻译效率，并对其进行调节t吨-在Bioconductor Limma和tRanslatome包装中进行的测试（Benjamini–Hochberg校正后使用0.05的阈值P（P）值）。翻译效率计算为多胞体和亚多胞体信号之间的比率。

除了标准程序外，对于AML12的数据，我们还包括差异分析。简单地说，我们模拟了一个校正滤波器，该滤波器考虑到eIF6 shRNA的多糖体和蛋氨酸掺入量低于对照细胞（蛋氨酸掺合量het/wt 0.75；多糖体面积het/wd 0.6）。我们将校正应用于选定数量的靶点，以预测其实际丰度，并通过数字RT-PCR进行验证。湿验证证实（相对）上调的mRNA具有类似（绝对）水平。然后，我们将此解释包括在计算书中。

UTR分析：从UCSC基因组浏览器下载5′UTR序列(http://genome.ucsc.edu/)，装配GRCm38/mm10。对于每个管理信息选择最长的转录变体基因作为该基因的代表。对DEGs列表中5′UTR区域的GC含量进行分布分析。将所有分布与对应于整组小鼠基因的背景分布进行比较，并通过Mann-Whitney检验确定显著变化。

连通图分析

为了检测与eIF6单倍体不足重叠的转录特征，将肝脏中差异表达的转录ID转换到Affymetrix U133A平台，根据统计显著性进行排序，并上传到连接图（Broad Institute）工具41将肝脏中上调和下调的基因与在体外用小生物活性分子处理细胞系。

计算机断层扫描法测定肝脏脂肪含量

通过镇静小鼠（持续吸入2–2.5%异氟醚）肝脏的计算机断层扫描（CT）图像（La Theta；Aloka Ltd.，Tokyo，Japan）中的X射线衰减，非侵入性测定肝脏脂肪含量。使用矢状面预扫描确定固定的解剖标志，以确定从第十一胸椎近端到第三腰椎远端的区域。肝脏腹侧感兴趣的多边形区域在三个连续切片中定义，并使用La Theta 2.10软件进行分析。这些感兴趣区域的计算机断层扫描值的平均值用于确定肝脏衰减，以估计肝脏脂肪含量。

HOMA-IR分析

一个先前发表的独立数据集用于证实eIF6表达与胰岛素敏感性之间的临床联系({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE27949”，“term_id”：“27949”}}7949英镑). 该数据集定义了33名糖耐量不等的健康受试者皮下脂肪组织的基本转录状态。他们的平均日龄、体重指数和最大摄氧量分别为52.5（11.7）岁、31.4（7.3）kg m⁻²和45.5（13.7）ml O₂每公斤每分钟。将空腹血糖与空腹胰岛素相乘，除以22.5，计算每位参与者的HOMA-IR。HOMA-IR被对数转换为近似正态，用于回归分析。删除了两个CEL文件，因为基于使用affyPLM Bioconductor软件包的质量诊断，它们似乎存在技术问题：{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM691122”，“term_id”：“691122“}}GSM691122型和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM691134”，“term_id”：“691134“}}GSM691134型然后使用affy包执行基于RMA的规范化68,69所有分析均使用R中的Bioconductor进行69。

蛋白质印迹和抗体

对在放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA）中均质的肝脏或肝细胞蛋白质提取物（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，1%脱氧胆酸钠，1%Triton X-100，0.1%SDS，150 mM NaCl和1 mM EDTA，pH 8.0）进行SDS-PAGE。使用以下抗体：兔抗eIF6多克隆抗体（1:3000）（参考文献。70). 来自细胞信号技术的抗体针对：Fasn（1:1000；#3180）；乙酰-雌酮H3（Lys9）（1:1000；#8173）；组蛋白3（1:1000；#4620）；Foxo1（1:1000；L29）（#9454）；磷酸（Ser636/639）-IRS1（1:1000#2388）；磷酸（Ser473）-AKT（1:1000；#4060）；AKT（1:1000；#9272）；磷（Ser235/236）-S6（1:1000；#4858）；S6（1:1000；#2217）；4E-BP1（1:1000；#9644）；磷（Thr202/Tyr204）-ERK（1:1000；#4370）；ERK（1:1000；#9102）；和磷酸-（Thr638/641）-PKC-β（1:1000；#9375）。来自其他供应商：PKC beta（1:1000；C-18）sc-210 Santa Cruz Biotechnology；Cebpδ（1:500；M-17）sc-636 Santa Cruz Biotechnology；Pgc1α（1:500；H300）sc-13067 Santa Cruz生物技术；层粘连蛋白B（1:1000；M-20）sc-6217 Santa Cruz Biotechnology；Hmgcr（1:500；ABS229）默克Millipore；C/EBPβ（1:500；1η7）626002生物传奇；β-肌动蛋白（1:10.000；AC-15）A5441西格玛；拉明B（1:1000；M-20）sc-6217圣克鲁斯生物技术公司。

通过平行通道进行重复，对样品进行定量。首先将每条车道归一化为β-actin，然后将其归一化成对照样本。使用ImageJ软件通过密度测定获得相对表达率。western blots膜的未截取图像如所示补充图7。

本研究由AICR UK 13-0045、AIRC IG 2014、Telethon GGP00012、ERC“翻译”给S.B.、德国联邦教育和研究部给GMC的资助（NGFN-Plus赠款编号01GS0850；01GS0851；Infrontier赠款01KX1012）、BBSRC博士培训赠款BB/GO18049/1（K.C.）、，部分由欧洲委员会FP7/2007-2013计划SYNERGY-COPD项目（编号270086）支持，特伦托CIBIO大学启动资金（G.V.）。我们感谢F.Larizza和A.Beugnet的早期实验。我们感谢对S.Abrigani和S.Gallo的批评性阅读。