四spanin CD9胞外大结构域的不同区域参与人类多核巨细胞形成的控制

摘要

介绍

四spanins是一个跨膜糖蛋白家族，在哺乳动物中鉴定出33个成员[1]四spanins的特征是有四个跨膜结构域，通常是短的细胞内N端和C端，一个小的细胞外结构域和一个大的细胞外区域（EC2），其中含有2对、3对或4对半胱氨酸残基，其中一对位于高度保守的“CCG”基序中。四spanins似乎在细胞生物学的许多领域都有作用，从细胞运动、胞外体形成和功能到细胞融合（综述于[2]–[4])也可以形成多种病原体入侵细胞的通道（在[5],[6]). 四Spanins被描述为“分子促进剂”，能够影响许多膜蛋白的位置和功能，包括免疫球蛋白超家族蛋白、蛋白多糖、整合素、补体调节蛋白、蛋白酶、钙粘蛋白和G蛋白偶联受体[7]四spanins和伙伴蛋白形成富含四spanin的微域（TEM）[8]通过蛋白质相互作用的层次结构，四spanins能够以同源和异源二聚体的形式存在，也能够与伙伴蛋白阵列结合。TEM的存在是从抗四氮杂蛋白抗体的实验中推断出来的[9]、洗涤剂提取[10]，重组四spanin片段[11]，Förster共振能量转移[12]以及单分子荧光显微镜[13],[14]此外，对两种高度专业化的四spanins，uroplakins 1a和1b进行冷冻电子显微镜检查，这两种蛋白在尿路上皮组织中发挥积极作用[15]，帮助定义了TEM的可能结构[11],[13].

EC2结构域已被证明对许多与伙伴蛋白的相互作用至关重要[16]–[18]一种四spanin（CD81）的EC2的晶体结构表明，它被组织成一个球状“头”的“柄”。茎和头部的一部分由CD81 EC2结构中的螺旋A、B、E形成，其氨基酸序列在四spanin家族成员之间相对高度保守。该亚结构域被认为包含四spanin-四spanin相互作用的位点，而第二个亚结构域（CD81 EC2中的螺旋C、D）在序列和家族成员之间具有更大的异质性，可能具有更特定的功能作用[19],[20]正是这第二个“高变”区域包含了四spanin CD81上丙型肝炎病毒糖蛋白E2的结合位点[21]和B细胞标记CD19[22]CD9 EC2四spanin的C端半，包含这个高变区，对与免疫球蛋白超家族成员EWI-2的相互作用也很重要[23]映射到此亚结构域的另一种相互作用是小鼠CD9和妊娠特异性糖蛋白PSG17之间的相互作用[24]CD9（S173-F-Q）的相同残基对受精过程中配子的融合也至关重要，参与二硫键形成的半胱氨酸残基也是如此[24]–[26].

据报道，四联蛋白参与了许多细胞融合过程，如精子与卵子融合、肌肉细胞融合和病毒诱导的同步形成[27]–[29]与本文详述的工作最相关的是最近关于四spanins在多核巨细胞（MGC）形成中的作用的报道[30],[31]MGC是巨噬细胞融合的结果，由于一个细胞中存在大量细胞核，因此常被称为“巨大”细胞。巨噬细胞的多核化使其具有更强的破坏能力，并且由于其尺寸的增加，使其能够分解单个细胞无法内化的较大成分[32]MGC常见于以慢性炎症为特征的肉芽肿中，其平均细胞核数通常为～20个[33]一个特别有文献记载的病理学是关于细菌的结核分枝杆菌 [34]在麻风和血吸虫病等感染中也观察到肉芽肿中存在MGC[35],[36]以及结节病和巨细胞动脉炎等炎症性疾病[37],[38]据报道，针对四跨肽CD9和CD81而不是CD63的单克隆抗体增强了Con A诱导的人单核细胞前体以及人和鼠肺泡巨噬细胞的MGC形成。相反，发现GST-CD9 EC2融合蛋白以剂量依赖的方式抑制MGC的形成[30].我们实验室最近的工作[31]除了我们还确定了四spanin CD63的积极调节作用外，我们同意这些发现，因为一组抗CD63抗体抑制了MGC的形成。与CD9和CD63相对应的重组EC2蛋白也具有抑制作用，而CD81 EC2没有[31]有趣的是，尽管序列高度相似，但小鼠CD9 EC2对人类单核细胞形成MGC没有影响[30],[31].

CD9和CD81 EC2预期具有类似的结构，因为它们的长度相似，半胱氨酸残基的数量相同[16]而且两者都缺乏翻译后修饰。它们对MGC形成的不同影响提供了通过生成一系列嵌合结构来绘制参与此过程的CD9 EC2上的一个或多个位点的机会。对构建物进行功能获得（包含CD9片段的CD81嵌合体）或功能丧失（包含CD81片段的CD9嵌合体）评估。CD9 EC2不同亚结构域中的两个区域被证明是抑制作用的重要组成部分。点突变是根据人和小鼠CD9 EC2之间的序列差异或已知的CD9相互作用位点设计的，用于进一步表征这些位点。

材料和方法

结果

嵌合和突变EC2蛋白的设计与表达

人CD9和CD81 EC2的序列如所示图1A以及两种蛋白质之间交换的区域（浅灰色线和深灰色线）。CD81 EC2的晶体结构[16]CD9的假定结构（以CD81 EC2为模型）如所示图1B嵌合体被设计用来交换两个螺旋柄螺旋（嵌合体D1，D5）和头部子域（D2，D3，D4）中的三个螺旋。最后，嵌合体D6同时交换了两个较小的螺旋（D3、D4）(图1B). 交换机的确切位置如S1表所示S1文件表达GST与EC2构建物的融合蛋白，并按所述进行亲和纯化。SDS-PAGE分析显示了每种制剂在预期表观分子量下的比例（S1图S1文件). 以前曾报道过点突变（除了Y148A、Y148M和G154A）[25].

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图1

CD9和CD81序列和结构的比较。

图1A：人类CD9和CD81以及小鼠CD9的大细胞外结构域（EC2）的序列，使用ClustalW校准[49]在JalView中[50].保存的残渣根据物理化学性质着色(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/help/faq.html#24). 星号显示突变的残基，灰/黑线表示交换形成嵌合EC2融合蛋白的区域。图1B、C：CD9的结构（使用I-TASSER在CD81 EC2（PDB IV5）上建模[51])和CD81（来自PDB文件1V5[18])图1A中，黑色和灰色交替显示嵌合体生成过程中交换的区域。使用UCSF Chimera软件包可视化的结构，该软件包由旧金山加利福尼亚大学生物计算、可视化和信息学资源开发，由美国国立卫生研究院国家研究资源中心资助（2P41RR001081）和国家普通医学科学研究所（9P41GM103311）[52].

四spanin EC2蛋白对MGC形成的影响

在Con A的存在下，单核细胞融合成为MGC，CD9和CD81 EC2结构域中的GST-tetraspan对这一现象的影响以前已经发表过[30],[31]；此处显示的数据用于比较。融合指数为81–89%，巨细胞中存在的细胞核数量为2至27个，平均22个(图2A、B). 与GST单独相比，人CD9 EC2（而不是小鼠CD9或人CD81 EC2）可抑制融合约40%(图2A、B). 细菌内毒素（LPS）的存在是因为大肠杆菌系统用于表达GST融合蛋白，测试对MGC形成的任何影响。未观察到对融合指数或巨细胞内平均细胞核数的影响。CD9和CD81 EC2蛋白在每种蛋白250 nM或500 nM的共注入量下，相对于CD9 EC2单独的抑制作用显著降低(图2A、B)，表明CD81 EC2不是无活性的，但实际上可以拮抗CD9 EC2对单核细胞融合的作用。

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图2

500 nM EC2结构域对多核巨细胞形成的影响。

图2 A、B分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。单核细胞单独用Con A或Con A和200 nM脂多糖、500 nM GST或所示的EC2 GST融合蛋白中的重组四spanin处理，但数据表明单核细胞分别用Con B和250 nM各自的EC2蛋白处理的情况除外。数据是至少6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05. 除非另有说明，否则将显示与Con A控件（透明条）差异的重要性。

嵌合四spanin EC2蛋白对MGC形成的影响

CD9/CD81 EC2结构域的12个嵌合构建体与对照（单独的GST、野生型CD9和CD81 EC2蛋白）一起在500nM下进行评估，该剂量的人CD9 EC2先前显示可抑制MGC的形成[31]在CD9 EC2中插入CD81位点时，评估嵌合体的抑制作用丧失，在CD9位点插入CD81 EC2时，评估其抑制作用增强。图3A–D说明嵌合结构对融合指数和巨细胞大小的影响。CD9 EC2上的两个位点似乎对融合至关重要：当D2或D4被CD81 EC2的相应区域取代时，CD9 EC1的抑制作用消失(图3A、C). 在互惠嵌合体中，当插入CD81 EC2时，这些区域也显著增强了生物活性(图3B、D). CD81 D1替代CD9 EC2对活性影响较小，与野生型CD9 EC1有显著差异；相反，含有CD9 D1的CD81 EC2嵌合体显著抑制融合和MGC大小(图3A–D). 含有CD9 D5的CD81嵌合体略微抑制融合指数，但这与野生型CD81 EC2相比并不显著，并且对MGC大小没有影响。相应的CD9嵌合体（包含CD81 D5）与野生型CD9 EC2一样活跃。出乎意料的是，含有CD81 D6区域的CD9嵌合体抑制融合，而相反的CD81嵌合体（含有CD9 D6）是不活跃的，尽管CD81 D5含有CD9 D 4环，当CD81中存在时，该环被证明具有活性。为了帮助确定CD9 EC2的“柄”区域D1和D5（在CD81嵌合体中显示出微弱的抑制活性）是否需要抑制MGC的形成，在较低浓度的重组蛋白下重复检测。剂量-反应曲线表明，5 nM CD9 EC2将提供亚最大效应(图4A、B). 在5 nM下，将CD81的D2或D4替换为CD9 EC2完全消除抑制活性，而D1和D5没有影响(图4C–F). 在互惠嵌合体中，D2和D4导致CD81 EC2功能增强，而D1和D5没有影响。从这些实验中，我们可以得出结论，D2（N末端柄的顶部和头部亚结构域的第一螺旋）和D4（头部螺旋的第三螺旋）对CD9 EC2抑制MGC形成的活性至关重要。D1（N端茎螺旋的主要部分）可能起次要作用，而D3（第二头螺旋）和D5（C端茎螺旋）则不涉及。

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图3

500 nM CD9/CD81嵌合EC2结构域对多核巨细胞形成的影响。

图3 A、B分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和500 nM GST或500 nM所示的重组嵌合EC2 GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD81序列替换相关的CD9序列。图3 C、D分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和500nM GST或500nM所示的重组嵌合EC2-GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD9序列来取代相关的CD81序列。数据为6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05. 除非另有说明，否则显示与仅GST控制（透明条）的差异的重要性。

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图4

5 nM CD9/CD81嵌合EC2结构域对多核巨细胞形成的影响。

图4 A、B显示了人类CD9 EC2 GST融合蛋白浓度增加对融合指数和每个巨细胞平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。数据是2个实验±SEM的平均值。图4 C、D分别显示了对融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和5 nM GST或5 nM所示的重组嵌合EC2 GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD81序列替换相关的CD9序列。图4 E、F分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和5nM GST或5nM所示的重组嵌合EC2-GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD9序列来取代相关的CD81序列。图4C–F中的数据是6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05. 除非另有说明，否则显示与仅GST控制（透明条）的差异的重要性。

D2和D4点突变对CD9-EC2抑制活性的影响

由于小鼠CD9 EC2在MGC形成试验中处于非活性状态，因此对小鼠CD9和人类CD9 EC2D2和D4区域的序列进行了比较(图1A). 在人CD9的D2位点，小鼠CD9中有五个残基不同，在Y148只有一个显著的侧链差异，即小鼠CD9 EC2中的M。该残留物对应于人CD81中的E150，预计在CD9 EC2模型中暴露为溶剂(图5C)so被选择进行突变。在D2中，突变体Y148A对相对于野生型人类CD9 EC2的融合指数影响较小，对巨细胞大小没有影响，而Y148M与野生型相同(图5A、B)这表明，这种驻留并不直接参与抑制活性。在人类CD9的D4位点上，发现了五种残留差异，尽管没有显示电荷或大小的重大变化。然而，该区域的残留物先前已被证明在精子/卵子融合中很重要[25],[26]因此，对点突变株进行了测试（T175A至K179A）。在500 nM下测定点突变对MGC融合率和大小的影响(图5A、B). K179A突变不影响人类CD9 EC2对MGC形成或大小的抑制，而D4交换区内的其他突变完全消除了抑制。

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图5

点突变对CD9 EC2抑制多核巨细胞形成能力的影响。

图5 A、B分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和500 nM GST或500 nM所示重组突变CD9 EC2 GST融合蛋白处理单核细胞。数据是至少6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05. 除非另有说明，否则显示了与仅GST对照（清除条）的差异的显著性。图5C显示了CD9 EC2蛋白模型上选定突变的位置，重要的T175-V178区域以红色突出显示。

讨论

与之前的研究结果一致，GST-CD9 EC2显著抑制MGC的大小和融合率（此处和[30],[31]). 虽然我们还没有尝试在这里研究这种活性的机制，但它可能与四spanin EC2蛋白在白细胞附着到内皮细胞上的作用类似。EC2蛋白通过减少粘附分子（如VCAM-1和ICAM-1）的聚集来抑制这种活性[11]人CD81 EC2和小鼠CD9 EC2均未抑制MGC的形成，表明序列特异性对该活性很重要。人CD9 EC2与小鼠CD9 EC1的序列同源性为77%，与人CD81 EC2的序列同源度为～23%。CD81 EC2的抑制活性缺失不能归因于错误的折叠，因为这已通过Western印迹和免疫沉淀中的构象敏感抗体进行了评估[31]在本实验室中产生的GST-CD81 EC2的功能活性也已在其他生物系统中得到证实，在这些生物系统中已证明其抑制HCV与肝细胞的结合[21]和巨噬细胞感染HIV-1[39]有趣的是，CD81 EC2不仅没有活性，而且能够拮抗CD9 EC2的活性。这一现象的分子基础尚不清楚，但表明不同的四跨蛋白与融合的正负调控因子相互作用。这一观点得到抗四氮杂蛋白抗体对MGC形成的活性的支持：抗CD63抗体可以阻断融合，而抗CD9和抗CD81抗体可以促进融合[30],[31]。两种交换中D6区（CD9 EC2中包含一个能够抑制融合的“活性”区域）缺乏活性也可能表明四spanins对MGC形成的控制不是固定的属性。这意味着四spanin对融合的控制可能可以通过EC2区域构象的改变来切换，正如之前在四spanin CD63对肥大细胞脱颗粒的控制中所观察到的那样。因此，CD81的高变D3和D4区域可能具有抑制某些构象融合的潜力，例如当受到CD9支架的限制时。

利用CD9/CD81 EC2嵌合体，我们鉴定了CD9 EC2的两个不同区域，它们对抑制MGC的形成至关重要(图6). 这些区域包括CCG基序之前相对保守的B螺旋，以及将其连接到“柄”螺旋A（嵌合体D2）的环，以及“高变”区域内包含螺旋C的第一个子环（嵌合体D4）[20]。这些区域中的关键残基尚未进行系统研究，因此我们不知道这些区域是否形成一个扩展的相互作用位点或两个（或更多）单独的位点。螺旋B的C端和N端的Y148和D135距离F176的胺N原子约为～15º和～26º，这是活性所需的残基(图6). 由这些残基定义的潜在结合面由疏水“补丁”和沿螺旋B的更极性区域组成。CD81 EC2的保守头部结构域包含一个对疟原虫肝细胞感染，映射到连接螺旋体A和B的环中的酸性残基（与CD9 EC2的D135位置相同，位于D2交换区），以及在CD81 EC2螺旋体B的外表面对齐的许多残基（T149、F150、T153、L154）（CD9 EC2中Y148的侧翼）[41]一个来自日本血吸虫sjc23能够在CCG基序之前的一个单一位点结合人类IgG，并且发现含有KIQTSFHCC序列的合成肽（大多数螺旋B）可以阻断结合[42]在高变区，也有几个结合位点的例子。人CD9 EC2第二亚环内的T175、F176或V178突变（类似于小鼠CD9中的S173-Q175）阻止GST-CD9 EC1抑制精子/卵母细胞融合[25],[26]人CD9 EC2的L173-K192也被证明形成纤维连接蛋白的结合位点[43]人CD81 EC2同一区域的F186对丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2的结合至关重要，可能形成涉及I181、I182和L185的疏水性斑块的一部分[21].CD151可能在EC2中有一个额外的二硫键桥，可以提供更复杂的子环结构。残基186–217，包括QRD序列，形成α3β1整合素的结合位点，促进对大多数洗涤剂耐药的相互作用[44],[45]与迄今为止定义的四跨肽的其他活性不同，MGC形成的抑制需要CD9 EC2上广泛分布的一个或多个位点，这表明可溶性EC2与两种或多种蛋白质相互作用，可能起到将它们从TEM中去除或将它们保持在不利的方向的作用。固定在TEM中的天然CD9可能与相同的蛋白质相互作用，因此如几项研究报告所述，它起到了融合的负调节器的作用[29],[30],[46],[47]相反，CD9在精子与卵子融合中起着允许的作用（参见[48])这表明不同细胞类型使用的融合机制不同。

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图6

描述CD9 EC2参与抑制多核巨细胞形成的区域。

CD9的结构（使用I-TASSER在CD81 EC2（PDB IV5）上建模[51])，表面极性从低（红色）到高（蓝色）。与抑制作用有关的残基（F186，Y148）或第二（B）螺旋（D135）的N末端残基之间的距离以Ω表示，由主链酰胺N原子测量。利用加州大学旧金山分校生物计算、可视化和信息学资源开发的UCSF Chimera软件包可视化结构，该软件由美国国立卫生研究院国家研究资源中心（2P41RR001081）资助和国家普通医学科学研究所（9P41GM103311）[52].

CD9 EC2的D2和D4位点中的一些残基的突变导致抑制活性在不同程度上丧失。CD9的D4区的残基以前曾被认为与精子与卵子融合有关[25],[26]在本研究中，此处的突变（K179A除外）导致抑制作用丧失，这表明精子/卵子融合所需的CD9 EC2位点也参与MGC的形成。值得注意的是，重组CD9 EC2的K179不参与精子/卵子融合，但需要抑制精子的粘附，尽管CD9与卵子细胞表面的分子相互作用尚不清楚。CD9 EC2半胱氨酸残基的突变表明，对MGC形成的抑制作用需要完整的二硫键，这表明正确的折叠是必要的。我们还观察到精子/卵子融合以及通过构象敏感抗体识别EC2[21],[25]小鼠CD9 EC2缺乏抑制作用，不能用小鼠蛋白中Y148处的蛋氨酸替代来解释，尽管丙氨酸耐受性不好。这表明包含两个螺旋和一个环的D2区域的整体结构可能很重要。类似地，CD9 D6（包含D3和D4环）无法将抑制活性转移到CD81，而D4单独具有强烈活性，这也表明D3对抑制D4活性的重要结构贡献。

结论

人类CD9 EC2上抑制MGC形成所需的功能位点被映射到两个独立的区域，这两个区域都是活动所需的。干扰这些位点活性的化合物可能是有用的治疗剂，可以阻止巨细胞动脉炎等病理条件下MGC的形成。

支持信息

资金筹措表

这项研究得到了人道研究信托基金PM LJP的支持(http://www.humaneresearch.org.uk)，生物技术和生物科学研究委员会学生奖学金BB/F016832/1 LJP(http://www.bbsrc.ac.uk/home/home.as)，英国心脏基金会PG/98163 PM(http://www.bhf.org.uk/#&panel1-1). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，没有任何限制。所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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