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.2014年12月31日；9（12）：e116289。
doi:10.1371/journal.pone.0116289。 2014年电子收集。

四spanin CD9大胞外区的不同区域参与人类多核巨细胞形成的控制

瑞秋·S·休姆 1, 阿德里安·希金波顿 2, 帕尔莫 1, 林达J鹧鸪 1, 彼得·蒙克 3
附属公司

四跨肽CD9细胞外大结构域的不同区域参与控制人类多核巨细胞的形成

瑞秋·S·休姆等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

由单核细胞/巨噬细胞融合形成的多核巨细胞是与感染或异物持续存在相关的慢性肉芽肿性炎症的特征。四spanins CD9和CD81调节多核巨细胞形成：与人而非小鼠CD9的大细胞外结构域（EC2）相对应的可溶性重组蛋白可以抑制多核巨星形成，而人CD81 EC2可以拮抗这种作用。四spanin EC2都可能有一个保守的三螺旋亚结构域和一个不太保守或高度可变的亚结构域，由短螺旋和由两个或多个二硫键稳定的互连环形成。利用CD9/CD81 EC2嵌合体和点突变体，我们绘制了参与多核巨细胞形成的CD9 EC2的特定区域。这些主要位于两个螺旋中，每个子域一个。参与CD9 EC2中二硫键形成的半胱氨酸残基对抑制活性都是必需的，但四span定义的“CCG”基序中的保守甘氨酸残基则不是。发现在人和小鼠CD9 EC2之间不保守的一个活性区中的酪氨酸残基（预测为溶剂暴露）仅在外周参与该活性。我们在CD9 EC2上定义了抑制活性所需的两个空间方向的位点。针对这些位点的药物可能在多核巨细胞起致病作用的疾病中具有治疗应用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。CD9和CD81序列和结构的比较。
图1A：使用JalView中的ClustalW对人类CD9和CD81以及小鼠CD9的大细胞外结构域（EC2）进行序列比对。保存的残渣根据物理化学性质着色(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/help/faq.html#24). 星号表示突变的残基，灰色/黑色线条表示交换形成嵌合EC2融合蛋白的区域。图1B，C：CD9（使用I-TASSER[51]以CD81 EC2（PDB IV5）为模型）和CD81（来自PDB文件1V5[18]）的结构，显示了在产生交替的黑色和灰色嵌合体时交换的区域，如图1A所示。使用UCSF Chimera软件包可视化的结构，该软件包由旧金山加利福尼亚大学生物计算、可视化和信息学资源开发，由美国国立卫生研究院国家研究资源中心资助（2P41RR001081）和国家普通医学科学研究所（9P41GM103311）。
图2
图2。500 nM EC2结构域对多核巨细胞形成的影响。
图2 A、B分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。单核细胞单独用Con A或Con A和200 nM脂多糖、500 nM GST或所示的EC2 GST融合蛋白中的重组四spanin处理，但数据表明单核细胞分别用Con B和250 nM各自的EC2蛋白处理的情况除外。数据是至少6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05之间。除非另有说明，否则将显示与Con A控件（透明条）差异的重要性。
图3
图3。500 nM CD9/CD81嵌合EC2结构域对多核巨细胞形成的影响。
图3 A、B分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和500 nM GST或500 nM所示的重组嵌合EC2 GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD81序列替换相关的CD9序列。图3 C、D分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和500 nM GST或500 nM所示的重组嵌合EC2 GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD9序列替换相关的CD81序列。数据为6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05之间。除非另有说明，否则显示与仅GST控制（透明条）的差异的重要性。
图4
图4。5 nM CD9/CD81嵌合EC2结构域对多核巨细胞形成的影响。
图4A、B分别显示了人CD9 EC2 GST融合蛋白浓度增加对融合指数和每个巨细胞平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。数据是2个实验±SEM的平均值。图4 C、D分别显示了对融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和5 nM GST或5 nM所示的重组嵌合EC2 GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD81序列替换相关的CD9序列。图4E，F分别显示了对融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和5 nM GST或5 nM所示的重组嵌合EC2 GST融合蛋白处理单核细胞，其中使用不同的CD9序列替换相关的CD81序列。图4C–F中的数据是6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05之间。除非另有说明，否则显示与仅GST控制（透明条）的差异的重要性。
图5
图5。点突变对CD9-EC2抑制多核巨细胞形成能力的影响。
图5 A、B分别显示了融合指数和每个巨细胞的平均细胞核数（每个细胞>5个细胞核）的影响。用Con A和500 nM GST或500 nM所示重组突变CD9 EC2 GST融合蛋白处理单核细胞。数据是至少6个实验±SEM的平均值。显著性使用Bonferroni后验的单向方差分析计算；p值***：<0.0001；**：<0.01; *: <0.05之间。除非另有说明，否则显示与仅GST控制（透明条）的差异的重要性。图5C显示了CD9 EC2蛋白模型上选定突变的位置，重要的T175-V178区域以红色突出显示。
图6
图6。描述CD9 EC2参与抑制多核巨细胞形成的区域。
CD9的结构（使用I-TASSER[51]在CD81 EC2（PDB IV5）上建模），表面极性从低（红色）到高（蓝色）。与抑制作用有关的残基（F186，Y148）或第二（B）螺旋（D135）的N末端残基之间的距离以Ω表示，由主链酰胺N原子测量。利用加州大学旧金山分校生物计算、可视化和信息学资源开发的UCSF Chimera软件包可视化结构，该软件由美国国立卫生研究院国家研究资源中心（2P41RR001081）资助和国家普通医学科学研究所（9P41GM103311）。
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赠款和资金

本研究得到了人道研究信托基金项目经理LJP的支持(http://www.humaneresearch.org.uk)，生物技术和生物科学研究委员会学生奖学金BB/F016832/1 LJP(http://www.bbsrc.ac.uk/home/home.as)，英国心脏基金会PG/98163 PM(http://www.bhf.org.uk/#&panel1-1). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。