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摩尔神经变性剂。2014; 9: 19.
2014年5月26日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1750-1326-9-19
预防性维修识别码：项目经理4049387
PMID：24885504

执行CLARITY成像的简化方法

叶卡捷琳娜·波古兹卡娅,#1,2 德米特里·阿塔莫诺夫,#1,2 阿纳斯塔西亚·博尔沙科娃,1,2 奥尔加·弗拉索娃,1,2和伊利亚·贝兹普鲁兹凡尼通讯作者1,2,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

成像方法被广泛用于了解大脑和其他生物物体的结构。然而，由于组织的光散射，光学显微镜对样品的穿透受到限制。最近已经开发了许多方法来解决这个问题。在一种方法（SeeDB）中，描述了用于澄清脑部样本以进行成像的简单程序。然而，这种方法与免疫染色方法不兼容，因为SeeDB预处理组织对抗体不具有渗透性。另一种用于清除脑组织的技术（CLARITY）针对免疫化学进行了优化，但该方法在技术上比SeeDB要求更高。

结果

在这里，我们报告了脑样本成像的优化方案（CLARITY2）。我们简化并缩短了原始协议。水凝胶固定后，我们将脑组织切割成1–1.5 mm厚的冠状切片。与原始方案相比，这一额外步骤使我们能够加快并简化清除、染色和成像步骤。我们在M Thy1-GFP系小鼠大脑成像实验和抗突触后蛋白PSD-95和纹状体特异性蛋白DARPP32抗体免疫染色实验中验证了改进方案。

结论

对原始CLARITY协议进行了优化和简化。修改后的CLARITY2协议的应用可能对从事神经生物学和发育生物学的广泛科学家有用。

关键词：清晰度，查看大脑深层，神经结构，3D脑组织重建，神经成像，共焦，双光子

背景

理解大脑的结构组织对现代神经科学研究至关重要。许多先进的成像方法已被开发用于大脑结构的研究。然而，由于光散射，光对脑组织的穿透是有限的。共焦显微镜的成像深度限制在30微米，双光子显微镜的成像厚度不超过600–800微米[1]. 在这样的深度成像还需要使用强大的激励功率，导致样品局部过热。为了缓解光散射的问题，最近开发了几种程序，用于获取光学透明的大脑样本进行成像。最初发布了一种简单快速的协议，称为“看深脑”（SeeDB）方法[2]. SeeDB程序只需1周，只需最少的试剂和工作量，并且不会改变样品。制备的SeeDB样品对可见光透明，但对大分子或抗体不渗透。因此，SeeDB程序与免疫染色不兼容。据报道，其他方法使用具有高折射率的化学溶剂来减少光散射[三-5]. 与SeeDB类似，这些方法与免疫染色应用程序不兼容。

最新开发的方法是CLARITY[6]. 该方法基于将完整的脑组织转化为由亲水性聚合物交联三维网络形成的纳米多孔水凝胶。大脑的脂质相在洗涤剂中溶解并通过电泳去除。因此，可以获得光学透明的大脑样本用于成像研究。纳米多孔水凝胶对抗体和其他大分子具有渗透性，这使得CLARITY与免疫染色应用兼容。然而，公开的CLARITY协议的几个步骤[6]在技术上很困难。特别是，样品的电泳清除是澄清程序中一个耗时且具有挑战性的步骤。

新方法

这里我们描述了CLARITY过程的简化版本（CLARITY2）。初始水凝胶固定程序与原始方案相同[6]. 在水凝胶固定后，我们使用振动器将脑组织切成1–1.5 mm厚的冠状切片。与原始方案相比，这一额外步骤使我们能够加快并简化清除、染色和成像步骤。使用CLARITY2程序，我们能够获得Thy1-GFP转基因小鼠神经元结构的高质量共焦和双光子图像[7]以及随后用抗突触蛋白PSD-95和纹状体特异性蛋白DARRP-32的抗体对脑样品进行免疫染色。

结果和讨论

采用成年野生型小鼠（FVB株）制定方案。按照之前描述的方案获得小鼠大脑并将其嵌入水凝胶中[6]没有任何修改（有关详细信息，请参见方法）。已公布方案的下一步是清除脂质/洗涤剂胶束。原始程序[6]需要使用电泳清除室（ETC）来清除样品。这一步在技术上很困难，自首次出版以来，ETC室设计的许多变化都已被描述(http://forum.claritytechniques.org). 然而，根据我们自己的经验和其他实验室的经验(http://forum.claritytechniques.org)清理步骤仍然具有挑战性，需要大量的时间和精力。我们推断，清除整个大脑是一个复杂而缓慢的过程，但对于大多数应用程序来说，并没有必要保持整个大脑的完整。使用震动仪（世界精密仪器公司），我们将氢燃料固定的小鼠大脑切割成1–1.5毫米厚的冠状切片（图1A） ●●●●。将这些切片放入50 ml锥形管中，其中充满10 ml清洁溶液，持续7天（37°C，以21 rpm的速度摇晃，新鲜溶液每3天更换一次）。我们发现，这个简单的步骤可以有效地清除切片（图1A） ●●●●。为了加快清理程序，也可以使用标准蛋白质电泳室（例如来自BioRad）。如果使用电泳室，那么切片清理过程需要2–3天，而被动清理需要7天。被动方法和基于电泳的方法获得的图像质量相似，我们在本文中呈现了被动清理样品的图像。

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简化了清晰度清除程序。（A）被动清除术前（底部）和后（顶部）的水凝胶包埋冠状切片。（B）显微镜盖玻片上的冠状切片，用于成像。（C）纹状体区域的共焦图像与DARPP32（绿色）和PSD-95（红色）抗体共同染色。（D）用PSD-95抗体染色的海马区共焦图像（红色）。面板上的比例尺为150微米C类-D类.

在我们的初步实验中，用鼠抗突触后密度蛋白PSD-95单克隆抗体和兔抗纹状体特异性蛋白DARPP32单克隆抗体对清除的切片进行免疫染色。最初的CLARITY程序需要与一级和二级抗体孵育2周，以使抗体充分渗透到样品中[6]. 我们实验中的冠状切片在与初级抗体孵育2天后和与次级抗体孵养过夜后可以有效染色。用Alexa-488结合的抗兔和Alexa-594结合的抗鼠二级抗体观察染色结构。为了进行成像实验，将冠状切片放置在PBST溶液中的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖（图1B） ●●●●。平切片成像（图1B） 不需要使用深度超过2mm的图像重建所需的FocusClear解决方案[6]. 使用配备20倍奥林巴斯物镜的共焦显微镜（Thorlabs），我们能够轻松地观察到DARRP-32阳性和PSD-95阳性（图1B） 大脑样本中的结构。PSD-95（红色）和DARPP-32（绿色）的纹状体区域共染示例如图所示1C.PSD-95染色的海马区（红色）如图所示1D.我们试图将获得的图像质量与原始图像进行比较[6]和修改的程序，但在使用原始协议（未显示数据）时，ETC清除步骤遇到技术困难。因此，我们无法使用原始程序获得清除的大脑样本。

为了证明改良方法的多功能性，我们还处理了从Thy-GFP小鼠（M系）大脑中获得的切片[7]. 在这些实验中，如上所述，被动地澄清了来自M系小鼠的1–1.5 mm厚的冠状切片。使用配备20x共焦显微镜采集GFP阳性海马神经元的图像（图2A） 或60x（图2B） 奥林巴斯的目标。在接下来的一系列实验中，我们使用抗PSD95小鼠单克隆抗体和Alexa-594结合的抗小鼠二级抗体对M线大脑的冠状切片进行染色。获得的共焦图像用于神经元结构的三维重建（图三A和B）。在这些图像中，单个GFP阳性神经元（绿色）被PSD-95阳性突触结构（红色）包围。

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M系Thy1-GFP小鼠海马神经元的共焦图像。（A）海马神经结构，20倍物镜。比例尺为300微米。（B）单个GFP阳性神经元的三维重建，60倍物镜。

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M Thy1-GFP系小鼠纹状体和海马神经元的共焦图像。（A、B）显示GFP阳性神经元（绿色）和PSD95染色（红色）的三维重建。使用20倍物镜。面板上显示了不同的大脑区域（A）和（B）面板上的比例尺为100微米A类和B类.

结果如图所示1,​,22和​和3三验证共焦成像和免疫染色实验的改进程序。使用20倍物镜，我们能够使用共焦显微镜成像250微米的深度（图1,​,22和​和3）。三). 当使用双光子显微镜（Thorlabs，20倍奥林巴斯物镜）对样品进行成像时，穿透深度增加至1–1.5 mm，即覆盖整个薄片厚度。基于双光子成像数据的神经元形状的三维重建如图M线GFP阳性神经元所示4和其他文件1.

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M Thy1-GFP系小鼠海马神经元的双光子成像。三维神经元图像重建的单帧（附加文件1). 使用20x物镜。比例尺为150微米。

总之，这里我们描述了CLARITY协议（CLARITY2）的修改和简化版本。将脑样本嵌入水凝胶后，用振动仪将其切成1–1.5 mm厚的冠状切片。因此，清除、免疫染色和成像程序得到了加速和简化。清除可以通过在清除溶液中被动培养切片1周来完成，不需要特殊的ETC室。也可以使用标准蛋白电泳室对脑片进行主动清除，以将清除过程缩短至2-3天。与原始方案相比，抗体染色和成像步骤也得到了简化和加速。我们使用共焦显微镜对切片厚度进行了250微米的穿透，并使用双光子显微镜对切片的整个厚度（1.5毫米）进行了成像。平片成像可以在显微镜载玻片上进行，不需要使用2 mm以上深度的图像重建所需的昂贵FocusClear解决方案[6]. 我们希望所描述的CLARITY2程序将有助于绘制小鼠大脑中的神经元回路，并对死后的人脑样本进行成像。与原始CLARITY程序相比[6]对使用CLARITY2程序获得的图像进行分析可能需要对相邻冠状断面的图像进行数字“拼接”，但在必要时，使用图像分析软件可以相对容易地完成这项工作。

方法

老鼠

野生型FVB/NJ（库存编号：001800）或M系小鼠Tg（Thy1-EGFP）MJrs/J（库存数量：007788）[7]使用了。这两个品系都是从杰克逊实验室获得的，繁殖群体是在圣彼得堡州立理工大学分子神经变性实验室的动物设施中建立的。所有小鼠实验都是按照当地动物管理部门批准的程序进行的。

水凝胶和清洁溶液

两种溶液都是按照原始文章中描述的协议制备的[6]. 简单地说，为了制备水凝胶溶液，将40 ml丙烯酰胺（40%）、10 ml双丙烯酰胺（2%）、1 g VA-044引发剂（10%wt）、40 ml 310 PBS、100 ml 16%PFA和210 ml dH2O混合。水凝胶溶液储存在-20°C下，所有水凝胶操作均在冰上进行。对于清洁溶液，混合123.66 g硼酸、400 g十二烷基硫酸钠和9 l dH2O。添加dH2O至10 l，并添加NaOH，直到pH值达到8.5。该溶液可在室温（20°C）下制备、储存和使用。为了避免皮肤接触或吸入，在准备两种溶液时，请戴上手套，在通风橱中准备溶液。

小鼠灌流

在室温下解冻40 ml水凝胶。轻轻混合内容物，避免产生气泡。将装有水凝胶的试管放在冰上。提供动物麻醉-在我们的实验中，用300 ul氨基甲酸乙酯（250 mg/ml）麻醉小鼠。用20ml冰镇水凝胶溶液经心灌注小鼠，灌注速率为每分钟10ml。快速提取大脑，并将其置于含有剩余20毫升水凝胶的锥形管中。如果样品中含有荧光物质（如GFP），请用铝箔包裹试管，以避免光漂白。将试管置于冰箱（4°C）中1-2天，以确保水凝胶完全渗透样品。

水凝胶组织包埋

根据原始文章中描述的方案进行组织包埋[6]. 简单地说，将装有水凝胶浸泡过的脑样本的50 mL锥形管放置在通风柜中的干燥室中。干燥室充满来自储罐的氮气。将干燥室阀从氮气流切换到真空泵。保持真空10分钟，然后关闭真空，用氮气慢慢填充干燥室。打开干燥室并紧紧关闭样品管顶部。由于氧气阻碍水凝胶的形成，尽量减少样品暴露在空气中。将试管浸入旋转器上的37°C培养箱中。培养3小时或直到溶液聚合。在通风橱中，从凝胶中提取水凝胶包埋的脑样本。

组织清除

使用世界精密仪器振动仪（NVSLM1 Motorized Advance Vibroslice）从水凝胶包埋的大脑中切下冠状切片（厚度1-1.5 mm）。将切片编号，放置在50 ml塑料管中，在37℃、摇晃21 rpm的温度下，在10 ml清洁溶液中培养7–10天。每3天更换一次新鲜清洁溶液。通过肉眼评估组织的清除情况。在大多数实验中，7天足以完全清除，但对于某些样品，需要额外3天清除。可使用标准的Western blotting生物试剂盒（Mini-Protean Tetra Cell系统#165–8000），在需要时将清除速度加快至2–3天。如果使用电泳清洗，将试验箱置于37°C的恒温器中，电压设置为12 V。在被动（7天）或电泳（2-3天）清洗后，从PBST（PBS中0.1%Triton X-100）的清洗液中清洗切片2天。切片现在已澄清。

免疫化学

将清除的脑片置于PBST中。以1:1000的稀释度加入一级抗体，持续2天，然后用PBST清洗脑片5次，持续30分钟。二级抗体以1:1000的比例加入PBST过夜，切片在PBST中洗涤30分钟。我们实验中使用的抗体为：小鼠单克隆抗PSD-95（Pierce，MA1-045）、兔单克隆抗DARPP32（Cell Signaling 19A3）、Alexa Fluoro488山羊抗兔（Life Technologies，A-11008）、，Alexa Fluor594山羊抗鼠（Life Technologies，A-11005）。

成像

将切片从PBST中取出，放在玻璃载玻片上。切片上覆盖有盖玻片，盖玻片用塑料线粘合到玻璃载玻片上（图1B） ●●●●。将冠状切片放在显微镜载玻片上的小液滴（PBST）中，以避免干燥并防止气泡的形成。塑料线安装在样品周围，并用盖玻片覆盖样品。小心避免气泡被困。我们在成像实验中使用了配备20×和60×奥林巴斯物镜（w.d.2.0 mm）的共焦和双光子成像系统（ThorLabs）。使用Imaris v7.4.2分析获得的图像。软件。

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

EP和DA进行了实验。EP、DA、AB分析数据。EP、DA、OV和IB设计的研究。EP、DA、AB、OV、IB撰写了论文，并准备了发表的数字。所有作者阅读并批准了最终手稿。

作者信息

叶卡捷琳娜·波古兹卡娅（Ekaterina Poguzhelskaya）poguzzelskaya@mail.ru是本文所述程序的技术问题联系人。

补充材料

附加文件1：

基于双光子成像数据的M Thy1-GFP系小鼠海马神经元三维重建（20倍物镜）.

单击此处获取文件（180万，每加仑4英里）

致谢

我们要感谢圣彼得堡州立理工大学分子神经变性实验室的成员在这些研究过程中给予的帮助和支持。这项工作得到了与俄罗斯科学部11.G34.31.0056（I.B）签订的合同的支持，NIH拨款R01NS074376和R01NS080152（I.B.）。

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