肿瘤起始细胞和化疗耐受性：靶向结肠癌干细胞的最佳策略是什么？

摘要

1.简介

结直肠癌（CRC）是西方世界第三常见的癌症类型，也是肿瘤相关死亡的第二大原因[1]。尽管众所周知的基因突变推动了从健康结肠上皮细胞向发育不良腺瘤转变，最终转变为结肠腺癌，但目前的抗癌治疗往往能够根除这种疾病。事实上，目前系统治疗的反应率为∼50%，但几乎所有患者都会产生耐药性[2]。

对转移至肝脏的CRC患者的常规一线治疗包括联合使用5-氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂（FOLFOX）以及联合使用5-氟脲嘧啶、亚叶酸和伊立替康（FOLFIRI）。FOLFOX和FOLFIRI在III期试验中表现出良好的疗效，并实际用于年轻的转移性CRC患者[三]。此外，新辅助化疗已与抗血管生成药物相结合，尤其是与贝伐单抗（Avastin）（靶向血管内皮生长因子（VEGF））和西妥昔单抗（Erbitux）（抑制表皮生长因子受体（EGFR））相结合[4,5]。尽管这些类型的联合治疗提高了CRC患者的无病生存率和总体生存率，但大多数转移性疾病患者并未治愈。

因此，更好地了解耐药机制是开发预防或逆转转移性大肠癌系统治疗患者化疗耐药方法的第一步。有新的证据表明，对化疗耐药的肿瘤细胞代表了原始肿瘤中在分子和表型上不同的细胞亚群。这些细胞被称为肿瘤起始干细胞或肿瘤干细胞（CSC）。目前，人们认为只有这一小部分癌细胞能够驱动肿瘤的发生、增殖和扩散[6]。在包括结肠癌在内的大多数实体肿瘤中，都发现了生物学上不同的CSC群体[7,8]。

CSC具有三个独特的特性：自我更新的能力，重建亲代肿瘤全部癌细胞的能力，以及一组独特的表面生物标志物的表达[9]。

CSC可以分裂产生一个分化程度更高的细胞和一个与亲本细胞保持相同属性的子细胞。这种自我更新的能力使肿瘤干细胞能够使肿瘤永久存在[6]。事实上，尽管CSC有自我更新的能力，但它们相对平静；也就是说，它们的增殖率很低，通常不循环。事实上，它们的细胞周期明显长于增殖的非干细胞。这可能是由于CSC在G0样细胞周期阶段或检查点被阻止所致[10]。

CSC也可从与癌干相关的一个或多个细胞表面标记物的表达中鉴定出来，如CD133[7,8,11]，CD44[12–14]，CD24[15]，CD166[14]和Lgr5[16]。更多功能标记，如Wnt活性[14]和ALDH1活性[17]已被用于鉴定结肠CSC。然而，用于分离各种癌组织中干细胞的标记物中没有一种仅由干细胞部分表达。事实上，大多数用于结肠CSC分离的标记物之所以被选择，要么是因为它们在正常干细胞中表达，要么是由于它们被发现用于识别其他恶性肿瘤中的CSC。

癌症干细胞理论具有深刻的转化意义。不以CSC为靶点的抗肿瘤治疗可能会减少肿瘤质量，但不会使肿瘤消退。事实上，治疗通常基于影响快速分裂细胞的药物，而CSC显示出低增殖潜能[18]。此外，CSC对细胞毒性全身治疗相对耐药[2]。事实上，由于存在细胞保护特性（包括端粒酶激活和抗凋亡因子的高表达），CSC表现出DNA修复的改变，并表达高水平的ABC膜转运蛋白家族蛋白，参与化疗耐药性[19]。因此，许多肿瘤可能会进展，因为CSC对治疗不敏感。

应开发针对CSC的新疗法[19]。这些包括诱导CSC分化或靶向控制CSC自我更新和化疗耐药性的基因。

2.针对CSC的分化治疗

诱导分化是消除或功能拮抗CSC的治疗方案之一。这种治疗策略包括迫使CSC转变为终末上皮表型，失去自我更新能力，因此易受常规治疗的影响。即使这种方法不能直接杀死CSC，也可以提高传统疗法根除肿瘤的效率。全反式维甲酸联合化疗治疗急性早幼粒细胞白血病是一个公认的分化治疗实例[20]。

最近，骨形态发生蛋白4（BMP4）被提议用于诱导结肠CSC分化[21]。事实上，BMP4能够激活分化程序并刺激结肠CSC的凋亡，减少β-通过抑制PI3K/AKT通路和上调Wnt-负调控因子激活连环蛋白[21]。

骨形态发生蛋白在正常肠道的分化过程中起着重要作用。这些细胞因子通过定义从肠腔向肠腔的递减梯度发挥作用，抵消肠腔外干细胞的扩张，并促进肠上皮细胞的分化[22,23]。这些稳态机制的丧失可能有助于肿瘤的发生[23]。

在最近的研究中，伦巴多及其同事[24]已证明BMP4的表达仅限于构成肿瘤主要群体的CRC上皮细胞的分化后代。相反，BMP4在结肠CSCs组分中未检测到。

作者已经表明，暴露于BMP4可以激活BMP经典信号通路，促进结肠CSCs的快速和大规模的末端分化、凋亡和化学增敏。事实上，向患有肿瘤的免疫功能低下小鼠（来源于结肠CSC）外源性给予BMP4，增加了5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的抗肿瘤作用，证实BMP4可能是一种治疗晚期结直肠癌干细胞的药物[24]。尽管这种组合的临床应用需要改善BMP4的递送和优化治疗计划，但在小鼠异种移植物中获得的治疗反应的显著增强，即使在长期实验中，也支持对分化治疗在CRC中的应用进行进一步研究。

最近，有报道称，BMP信号可以抑制Wnt活性，Wnt活性在小鼠模型中起到指示结肠CSC的作用，从而抑制隐窝形成和减少息肉生长[25]。此外，最近越来越多的研究表明，microRNA是与化疗耐药过程相关的功能[26,27]。

微RNA是内源性转录后调节剂，其失调在包括结直肠癌在内的许多恶性肿瘤的发生和发展中起着重要作用。尤其是于和同事们[28]已经证明，microRNA-21（miR-21）的表达在化疗耐药的结肠肿瘤中显著增加，在结肠CSC中也高度升高。作者假设miR-21在调节结肠CSC分化中起关键作用。事实上，他们报告称，通过转染反义miR-21，miR-21在结肠癌细胞系（HCT-116或HT-29）中的下调可诱导分化，胃肠道分化标记细胞角蛋白-20（CK-20）的表达增加就是证明[29]碱性磷酸酶活性增加[30]。这些变化还伴随着结肠CSCs标志物CD44的表达水平显著降低[31]和表皮生长因子受体（EGFR），结肠球形成减少，促凋亡基因表达增加[28]。此外，最近的研究表明，miR-21的下调使结肠CSC极易受到常规或非常规化疗药物的影响，如5-氟尿嘧啶+奥沙利铂（FUOX）、二氟姜黄素（CDF）以及CDF和FUOX的联合用药[28]。

总的来说，这些结果说明了建立控制CSC致瘤性的信号通路路线图的可能性，从而可以确定未来结肠癌治疗的特定分子靶点。

3.阻止上皮细胞向间充质细胞过渡

上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）是上皮细胞摆脱其上皮特性并获得迁移性间充质样细胞特性的转分化过程。几个关键的信号通路有助于这一过程，如转化生长因子-β（转化生长因子-β)和Wnt，其活性在恶性肿瘤进展过程中失调。因此，癌细胞中EMT的诱导导致侵袭性和转移性的获得[32,33]。此外，EMT使治疗方法复杂化，因为它参与获得新发耐药性和获得性耐药性[34]。事实上，EMT可以触发CSC样表型的逆转，从而在EMT、CSC和耐药性之间建立联系[35]。针对EMT通路和CSC维持可能是一种有前途的治疗策略。

Qi及其同事已经证明Dickkopf-1（Dkk1）是一种有效的Wnt信号抑制剂，能够逆转结肠癌的EMT[36]。作者分析了217例结肠癌患者，发现Dkk1的表达与肿瘤分期、转移和复发呈负相关。特别是，他们观察到，与Dkk1阴性样本相比，Dkk1-阳性样本的上皮标记物E-cadherin的表达水平较高，间充质标记物波形蛋白的表达和b-catenin的细胞质分布降低，提示结肠癌中Dkk1的缺失可能有助于结肠癌的进展，并且可能与EMT过程的逆转有关[36]。此外，HCT-116结肠癌细胞系中Dkk1的过度表达导致上皮表型的恢复，蜗牛和Twist的表达降低，这两种转录因子被认为是EMT的关键调节因子[37]结肠CSCs标记物（如CD133和亮氨酸-富重复G蛋白偶联受体5（Lgr5））的表达降低。功能分析表明，上调Dkk1可降低裸鼠的肿瘤启动能力并抑制结肠癌生长，表明Dkkl可能通过抑制EMT抑制结肠癌的进展，因此可以作为肿瘤治疗的靶点[36]。

这些发现可能对未来研究结肠癌进展机制和通过Dkk1有效靶向EMT具有重要意义，这可能为抗癌治疗提供新的希望。

一些研究也表明TGF的小分子抑制剂-β可能是治疗转移性结肠癌的有用治疗工具[38]。

的确，TGF-β是EMT的有效诱导剂，直接激活转录因子的表达，如SNAI1/2、Twist和ZEB1/2，这些转录因子是EMT程序的关键调节器[39]。因此，内源性TGFβ信号转导与结肠癌的不良转移结果和TGF的非调节相关β信号传导与肿瘤的发展和转移相关。

最近的研究表明，被称为P17和P144的合成肽以前被表征为转化生长因子的抑制剂-β1 [40]，可能是一种新的可能的治疗结肠癌肝转移的方法[41,42]。特别是结合免疫治疗策略和TGF肽抑制剂-β能够增强免疫治疗的疗效，这表明这些化合物可能有助于未来癌症免疫治疗的临床应用[41]。

最近，Zubeldia及其同事证明，注射表达荧光素酶的结肠腺癌细胞，经TGF预处理后-β（Mc38-luc TGF-β1） ，进入小鼠脾脏，增加原发性肿瘤生长和肝转移。另一方面，用P17或P144对小鼠进行系统治疗可显著降低肿瘤负担(P（P）< 0.01) [43]。作者观察到在转移性结节中，TGF诱导的有丝分裂/凋亡比率、间充质性状和血管生成-β注射肽后持续减少。体外实验显示TGF的直接作用-β在Mc38细胞中，导致Smad2、Smad3和Smad1/5/8活化，增加侵袭和内皮细胞迁移，而TGF被阻断β-信令恢复了这些特征。最后，作者证明了TGF-β处理后的细胞显示出更大的肿瘤球形成能力，其中也富含CD44和SOX2。P17的存在显著降低了这种能力，为临床前评估P17和P144作为转移性CRC治疗的潜在治疗方案提供了理论基础[43]。

4.目标特定CSCs途径

高通量技术和生物信息学的进展将允许开发专门针对CSC信号通路的其他化合物。目前，此类治疗有两个既定靶点：EGFR，它属于酪氨酸激酶受体ErbB家族，在许多肿瘤中异常激活[44]以及VEGF，已知其通过诱导内皮细胞的生长和分化来促进新血管的形成[45,46]。几项临床试验表明，采用抗EGFR（西妥昔单抗）和VEGF（贝伐单抗）单克隆抗体以及5-FU的靶向治疗，可显著提高晚期疾病患者的生存率[47]。

CSC的另一个目标包括阻断各种自我更新途径，包括Wnt、Notch、PTEN和Hedgehog[48]。抑制Wnt途径和γ-抑制Notch通路的分泌酶最近被认为是CRC的新途径[49]。Wnt公司/β-连环蛋白途径与肠隐窝干细胞表型的维持以及通过APC功能丧失或致癌导致Wnt信号失调有关β-catenin突变已被证明会导致大多数散发性癌症病例[50]。Tcf中断/β-由选定的小分子拮抗剂组成的连环蛋白复合物已被证明可以对抗β-catenin及其对结肠癌细胞增殖的抑制作用[51]。同样，据报道，Notch信号通路在结肠CSC中过度表达，在结肠CSCs的生存能力、致瘤性和自我更新中发挥作用[52,53]。van Es及其同事已经证明，用γ分泌酶抑制剂阻断Notch级联反应，可以在携带Apc抑癌基因突变的小鼠中诱导腺瘤中的杯状细胞分化，并随后阻止肿瘤生长[54]。此外，Hoey等人证明，通过在结肠癌异种移植物中使用人单克隆抗体21M18抑制Notch通路的重要组成部分delta-like 4配体（DLL4），与对照组相比，肿瘤生长和CSC频率降低。有趣的是，尽管用伊立替康（一种常用于结肠癌的化疗药物）治疗异种移植物减缓了肿瘤生长，但克隆原性增加了。伊立替康与抗hDLL4联合治疗再次降低肿瘤生长和干细胞频率，其水平甚至高于单独抗DLL4治疗[55]。这表明抑制Notch信号降低CSC频率并使肿瘤细胞对伊立替康治疗敏感。

最近发现，CD133+大肠CSC中使用抗IL-4抗体或IL-4受体拮抗剂抑制IL-4通路可增强常规化疗的抗肿瘤作用[56,57]。事实上，结肠癌产生的IL-4以自分泌的方式发挥作用，促进这些肿瘤中的抗凋亡途径。通过阻断抗体抑制IL-4使细胞敏感，从而被5-FU和奥沙利铂IL-4杀死[56,57]。

5.代谢目标策略

最近对驾驶员突变的聚类分析表明，其中一些突变集中在代谢途径上[58–62]揭示了癌症特征确实会影响癌症的新陈代谢。事实上，关于CSC人群的新陈代谢还知之甚少，在代谢组学这一新兴领域的曙光中留下了一条尚未研究的令人兴奋的道路。

Akao及其同事最近的一项研究通过在人类结直肠癌DLD-1 5-FU耐药细胞中显示代谢“主调节器”Sirt1（沉默交配型信息调节1）的显著过度表达，为耐药细胞群的代谢变化提供了初步证据[63]。Sirt1在各种细胞过程中起着关键作用，包括衰老和细胞在基因毒性和氧化应激下的存活[64,65]。此外，Sirt1与促进肿瘤发生和耐药性发展有关。作者已经证明，沉默Sirt1可以显著消除5-FU耐药细胞中对5-FU的耐药性，这表明靶向Sirt1基因可以负向调节（至少部分）人类结直肠癌中对5-FU的耐药性[63]。

Warburg效应，也称为有氧糖酵解，是癌症生物学的另一个重要方面，可以利用它来创造新型广谱抗癌药物[66–68]。Warburg效应被定义为癌细胞在有氧的情况下摄取高水平葡萄糖和分泌乳酸的倾向，并与致癌转化有关，这种转化通常意味着代谢检查点的失活，例如能量变阻器AMP-活化蛋白激酶（AMPK）[69]。

最近，二甲双胍通过抑制AMPK而成为抗癌药物[70]。流行病学、临床前和临床证据支持二甲双胍作为癌症治疗药物的使用。特别是，一些研究已经证明二甲双胍治疗与高胰岛素血症相关的癌症的能力，如乳腺癌和结肠癌[71–73]。

有趣的是，二甲双胍可能选择性地杀死癌干细胞，因为增加对Warburg-like需氧糖酵解（高糖酵酵解表型）的依赖对维持CSC的干细胞和永生至关重要。Hirsch等人进行的一项有趣的研究表明二甲双胍对乳腺CSC的影响[74]。发现二甲双胍治疗可特异性消除CD44⁺/CD24型^−/低CSCs和阿霉素具有协同作用，可降低肿瘤负担并延迟肿瘤复发[74]。此外，二甲双胍联合阿霉素/顺铂或紫杉醇比单独使用这两种药物更能延缓肿瘤复发。令人惊讶的是，这种联合疗法的疗效是阿霉素低剂量的四倍，从而降低了化疗的毒性并提高了疗效。此外，在高转移性基底样MDA-MB-231乳腺癌细胞中，二甲双胍治疗动态抑制CD44⁺/CD24型^−/低CSCs表型通过包括转化生长因子在内的EMT机制的转录抑制-β1、ZEB、Twist和SLUG（蜗牛2）[75]。

在最近的一项研究中，梅内德斯及其同事假设外源性微环境因素（如缺氧、氧化应激、细胞外基质脱落和营养缺乏）和内在遗传决定因素（如致癌基因、抑癌基因和表观遗传学）可以聚合以协调确定肿瘤组织中Warburg表型的激活。在这种状态下，肿瘤细胞可能适应Warburg表型，CSC细胞状态应具有强大的生长和生存优势。作者提出，Warburg效应可以使来源的肿瘤细胞重新编程，从而获得CSC的细胞状态，允许非CSC转化为CSC[76]。

CSCs表型的这种固有可塑性意味着，仅消除CSCs可能无法有效治愈肿瘤，因为它们可以从非CSCs再生，因此需要双重靶向治疗方案。确定CSC的代谢基础结构和代谢功能可能是新的治疗方法的基础。

6.结论

总之，这些数据说明了癌症干细胞概念的治疗效用，为发现癌症治疗耐药性的新机制提供了工具。生存途径抑制剂、分化剂和细胞毒药物可能联合用于治疗转移性结肠癌患者。有趣的是，针对CSC代谢基础设施的机会和挑战可能会很快实现，因为现有的代谢药物可能很容易从临床前阶段重新定位到临床方法。

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