跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
干细胞。作者手稿；PMC 2015年1月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
干细胞。2014年1月；32(1): 191–203.
数字对象标识：10.1002/第1536项
预防性维修识别码：项目经理3908821
NIHMSID公司：NIHMS531205标准
PMID：24022884

Podocalyxin的表达分离小鼠ES细胞源性中胚层的造血和血管潜能

张海兰，1,4 约翰·尼维斯，1,4 斯图亚特·弗雷泽，1,4,5,# 琼·伊塞恩，1,4, 杜瓦拉斯泛神经炎，1,4 德米特里·帕帕琴科，2,5 苏尼塔·德苏扎，2,5 伊霍尔·勒米什卡，2,4,5 迈克尔·A·戴尔，6和玛格丽特·巴伦1,2,三，4,5,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

在小鼠胚胎和分化的胚胎干细胞中，造血、内皮和心肌细胞谱系来源于Flk1+中胚层祖细胞。在这里，我们报告称，作为唾液幻觉CD34家族成员的Podocalyxin（Podxl）的表面表达可用于将4.75天分化类胚体的Flk1+细胞细分为发育为不同中胚层谱系的群体。最终造血潜能仅限于Flk1+Podxl+人群，而Flk1-阴性Podxl+人群仅显示原始红系潜能。Flk1+Podxl阴性人群包含内皮细胞和心肌细胞潜能。Podxl的表达区分了7.5、8.5和9.5天小鼠胚胎中的Flk1+中胚层群体，是祖细胞期原始红细胞的标记。这些发现确定Podxl是分离不同中胚层谱系的有用工具。

关键词：小鼠胚胎干细胞，多能干细胞，中胚层诱导，原肠胚形成，造血，内皮细胞，血管发育，Flk1，波多黎各霉素

介绍

原肠胚形成期间，外胚层的外胚层细胞通过原始条纹进入，形成中胚层[1–4]. 退出后部和中部原始条纹的中胚层细胞，包括胚外、造血、血管和心脏中胚层，表达血管内皮生长因子（VEGF）受体Flk1（也称为Kdr或Vegfr2），表明这些中胚层谱系源自Flk1+祖细胞[5–7]. 由于原肠胚形成期哺乳动物胚胎的可及性有限且体积较小，控制Flk1+祖细胞向不同中胚层谱系分化的机制尚不清楚。胚胎干细胞（ES）的体外分化是发育中胚胎的有用替代物，因为它们相对忠实地再现了早期胚胎发育过程，具有大量生长的能力，并且易于进行基因操作[8，9]. 使用Brachyury公司-GFP转基因报告鼠系跟随新生中胚层[10]在含有不同中胚层前体的分化类胚体（EB）中观察到两个Flk1表达的连续波。早期（第3.25天）人群发育为造血细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的潜能增强，而晚期（第4.25天）群体具有心血管潜能[6，11]. 其他标记物也已用于表征分化EB中的Flk1+中胚层祖细胞。表达血小板衍生生长因子受体a（PDGFR-a）和Flk1的ES-derived cells代表早期（“原始”）中胚层谱系，从中衍生出具有造血和内皮潜能的Flk1+PDGFRa阴性谱系[12–14]. 同时表达Flk1和Endoglin（Eng）（转化生长因子β超家族的受体）的分化EB细胞比单独表达Flk1的细胞更富含成血管细胞活性[15]. 在本文报道的工作中，我们询问Flk1+中胚层群体的不同潜能是否由其他不同的表面蛋白谱反映出来。

同源盒转录因子基因的条件诱导（强力霉素，DOX）混合物1在里面i-混合1ES细胞加速了中胚层发育程序，增加了血管母细胞和造血祖细胞的数量[16]. Mixl1激活肠系膜标志基因Gsc公司通过与启动子直接结合[17]从而控制ES细胞向中胚层谱系分化的承诺。在诱导与未诱导分化期间表达的基因的微阵列分析中i-混合EB，我们发现细胞标志蛋白(Podxl或Pclp1）是上调最强烈的基因。Podxl是一种与CD34和内多糖密切相关的跨膜糖蛋白（参考文献[18]). 最初在成人肾脏上发现，它调节足细胞发育[19]在小鼠早期胚胎的细胞上也发现了[20]随后，在血管母细胞、造血干细胞和祖细胞、内皮细胞和循环胚胎红细胞上[20–24]。

检测到Podxl公司诱导的i-混合EBs，其中中胚层的形成被加速和扩展[16]，我们系统地检测了Podx1在ES细胞分化过程中的表达，并询问它是否可以用作分离中胚层祖细胞的标记。我们发现Podxl蛋白在分化EB细胞和小鼠胚胎中的表达先于Flk1，然后与Flkl重叠。此外，Podxl表达可用于将Flk1+中胚层细分为两个具有部分重叠但不同发育潜力的种群（Flk1+Podxl-阴性和Flk1-+Podxl+）。虽然Flk1+Podxl+人群的造血潜能丰富，但Flk1+Podxl阴性人群主要包含内皮和心脏潜能。Podxl+Flk1阴性人群显示出异常高的原始红细胞潜能。此外，Podxl在原始红系细胞上的表达比先前认为的要早得多，这不仅标志着胚胎第10-12天的循环红细胞，也标志着其E7.5-8.5的祖细胞。这些结果表明，Podxl的表达是分离具有不同发育潜能的Flk1+中胚层细胞的有用标记。

材料和方法

小鼠ES细胞系和转基因小鼠

E14 ES细胞通过类胚体（EB）的形成分化[25]，稍作修改。将ES细胞以20000个细胞/ml的速度接种在含有15%胎牛血清（FBS；CellGro）、2 mM谷氨酰胺（Gibco）、50 mg/ml抗坏血酸（Sigma）、5%无蛋白杂交瘤培养基II（PFHM-II；Gibco−4M单硫代甘油（MTG；Sigma）。EB的分化进行长达8d，并且在不同的时间点收获EB用于流式细胞术分析或FACS分选。为了测试发育潜力，将分选的细胞在分化培养基中重新聚集20小时[10]在24孔低簇板（Costar）中或在IV型胶原涂层的6孔板上再培养2-3天[26]在含有VEGF（5 ng/ml；R&D Systems）和/或造血细胞因子促红细胞生成素（EPO；2单位/ml；Amgen）、白细胞介素3（IL-3；100 ng/ml，R&D System）和干细胞因子（SCF；100 ng/ml；R&D-Systems）的分化培养基中。

对于胚胎研究电子球蛋白-在人类控制下表达组蛋白H2B-GFP融合蛋白的H2B-EGFP转基因小鼠系电子球蛋白启动子、3′-UTR和mLCR增强子[27–29]已使用。

分化i-Mixl ES细胞的微阵列分析

分化过程中基因表达的变化i-混合1在有或无DOX（0.1μg/ml，分化后24小时添加）的情况下培养的ES细胞[16]，每个处理/时间点重复3次）。从第2天、第3天和第4天采集的EB中分离出总RNA（ES细胞电镀后第1天加入DOX）。对RNA（1μg）进行一轮线性扩增（RiboAmp系统）以产生10μg RNA。使用氨基烯丙基-dUTP间接标记RNA[30]然后与Cy3或Cy5共轭。用标记的RNA筛选15K小鼠发育cDNA微阵列[31]. 对每天采集的样本进行有或无DOX培养的EB杂交结果的配对分析。使用Spotfire®软件进行数据管理和筛选。筛选数据后，对基因表达率进行标准化，以去除低强度和低质量的斑点。重复样本获得的数据在统计学上非常一致（低调整p值）。对数据进行RNA标记、微阵列杂交和初步筛选。阵列分析生成的数据文件已经提交给Gene Expression Omnibus（GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE40703标准)在加入代码GSE40703标准.

流式细胞术

使用非渗出细胞分离缓冲液（Gibco）将EB分散到单个细胞。将细胞重新悬浮在含有10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并与抗体孵育(表S1)在冰上放置15分钟。然后用含有10%FBS的PBS清洗细胞一次，并用别藻蓝蛋白（APC）-共轭链霉亲和素（eBioscience）在冰上培养15分钟。用含有10%的FBS的PBS清洗后，细胞再悬浮在含有3%FBS和3 mM 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS中并使用FACSAria III或FACS流入仪器（BD）进行分类。为了分析额外的表面标记物，将分离的EB细胞或再培养细胞与抗Flk1和-Podxl抗体以及CD144（VE-cadherin）、CD117（c-Kit）、CD31（Pecam1）和CD41抗体一起在冰上培养15分钟(表S1). 用含有10%FBS的PBS清洗细胞一次，并用APC-结合（eBioscience）、FITC-结合（BioLegend）或PE/Cy7-结合（BD-Pharmingen）链霉亲和素在冰上培养15分钟。然后用含有10%FBS的PBS清洗细胞，并将其重新悬浮在含有3%FBS和3 mM DAPI的PBS中，以使用BD-LSRII系统进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件（v8.8.6；TreeStar）分析数据。

定量实时RT-PCR（QRT-PCR）

按照制造商的说明，使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒（Qiangen）从ES细胞、EB和分选细胞中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用Superscript III第一链合成系统（Invitrogen）或iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）合成cDNA，在20ml反应中使用1mg总RNA模板。TaqMan方案、引物和探针如前所述[16]. SYBR Green方法的引物序列如所示表S2对于SYBR Green QRT-PCR，20 ml反应包含1 ml cDNA、每个引物5 mM和10 ml SYBR Green-PCR主混合液（Applied Biosystems）或iQ SYBR Greene Supermix（Bio-Rad）。反应在7900HT快速实时PCR仪器（Applied Biosystems）中进行，程序如下：95°C，2分钟。；40次循环：95°C，15秒。；55°C，15秒。；72°C，30秒。；95°C，15秒。；和60°C，15秒Gapdh公司基因作为内部控制，每个基因的相对表达水平由基因的Ct值归一化为盖普，如前所述[29]. 公式中的任意值设置为100000。

造血祖细胞分析

对于原始红细胞集落形成细胞（EryP-CFC）分析，将分选的细胞与甲基纤维素混合物结合用于EryP集落[32，33]20000个细胞/ml，37°C孵育，4d后对EryP菌落进行评分。对于多血统造血祖细胞集落分析，将分选的细胞与甲基纤维素混合物（10000或25000个细胞/ml）结合，用于多血统的造血集落，修改自参考文献[25]通过抗坏血酸的增加和转铁蛋白的缺失[1%甲基纤维素（w/v）、15%血浆衍生血清、10%PFHMII、2 mM谷氨酰胺、VEGF（10 ng/ml）、bFGF（10 ng/ml）、hSCF（100 ng/ml。细胞因子购自R&D Systems；PFMII来自GIBCO®/Invitrogen。根据谱系，在第5-10天对造血集落进行评分。

心脏电位测定

已排序的单元格（105细胞/ml）在补充有2 mM谷氨酰胺、转铁蛋白（200 mg/ml）、0.5 mM抗坏血酸和4.5×10−4M MTG在超低附着24孔板（Costar）中放置24小时，基本如所述[34]. 将含有VEGF（5 ng/ml）、bFGF（30 ng/ml。

免疫荧光分析

在有或无VEGF（5 ng/ml）的分化培养基中，以每室30000个细胞的速度将分选的细胞重新培养在IV型胶原涂层的8腔载玻片（Millipore）上2-3d。按照说明进行免疫荧光分析[35]。

DiI-Ac-LDL摄取

将分选好的细胞重新培养在含有VEGF（5 ng/ml）的分化培养基中，每室30000个细胞，用IV型胶原涂层的8腔载玻片培养3d。然后用标记有1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚-碳菁高氯酸盐（DiI-Ac-LDL；生物医学技术）的乙酰化低密度脂蛋白培养细胞4小时，然后按照制造商的说明固定和安装。

免疫荧光分析

通过在PBS中3%（v/v）甲醛中孵育，然后在PBS内用含有5%马血清的封闭缓冲液孵育来固定细胞。然后在4°C下用大鼠抗鼠CD31（Southern Biotech）孵育细胞过夜。然后用0.5%（v/v）Triton X-100在PBS中清洗细胞，并在室温下用AlexaFluor 568山羊抗鼠IgG（H+L）（Invitrogen，A-11077）以1:1000的稀释度孵育1小时。在用PBS中的0.5%（v/v）Triton X-100洗涤后，用具有DAPI（Vector Laboratories）的VECTASHIELD HardSet安装介质安装细胞，并使用Axioplan 2荧光显微镜（Carl Zeiss）观察。

血管生成/试管形成分析

将120000个细胞重悬于浓度为600000个细胞/mL的培养基（90%DEM、10%FBS、50ng/mL VEGF和2.5ng/mL bFGF）中，并在室温下在预涂有基质胶（BD）的48孔板上培养1小时。每1小时目视评估一次试管形成情况，最多持续6小时。使用安装在Ziess AxioVert25上的佳能EOS Rebel T2i相机，使用Plan-NEOFLUAR 5X/NA0.15物镜获取相位对照图像。

结果

Podocalyxin的表达区分了EB分化过程中Flk1+中胚层的种群

检查转录变化，以应对混合物1，我们筛选了一个15K小鼠发育cDNA微阵列[31]使用从未诱导和DOX诱导中分离的RNAi-混合1EB（电子制动系统）[16]分化开始后的不同时间（d2、3或4）（如前所述，在d1上添加DOX[16]). 聚类分析显示DOX治疗EB中基因表达的动态变化(图S1). 许多发育调控基因的基因表达发生了显著变化，包括转录因子、信号通路调节因子、生长因子和细胞粘附分子。早在第2天，参与中胚层形成、造血、血管和心脏发育的基因转录就被激活(表S3和图S1)上调最强烈的基因（约12倍）是Podxl公司.Flk1是已知的最早的新生中胚层表面标记[5]. 我们假设d3-4 EB（中胚层诱导峰值）中的Flk1+群体是异质和多能的。因此，应该可以使用额外的标记物将Flk1+细胞细分为潜力更有限的不同亚群。

我们使用流式细胞术检测未分化和分化小鼠ES细胞上Podxl的表达模式(图1A). Podxl在未分化的小鼠ESC上不表达，但在分化过程中上调，在Flk1蛋白和RNA表达之前(图1A，S2和S3)，并将Flk1+群体分为两个不同的Flk1+亚群(图1，装箱）。到第4.75天，共鉴定出四个不同的群体（Flk1-SP，Flk1-单阳性；Podxl-SP，Podxx-单阳性；DP，Flk 1和Podxl双阳性；DN，双阴性）。因此，我们将重点放在这个时间点上进行后续研究。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms531205f1.jpg
Podxl在EB分化过程中分离Flk1+中胚层种群的表达

E14 ES细胞被诱导分化为EB，并在指定日期收获。为了分类，EB分散到单个细胞中，并用抗Flk1和抗Podxl抗体染色。（A） 流式细胞术分析显示基于Podxl表达的Flk1+分化ES细胞的细分。方框突出显示了Flk1-SP和DP种群在d4.75的明显分离。（B） 重新聚集和培养后分类人群的代表性流式细胞术分析。在指定时间采集分化EB，分离并进行抗体染色和FACS。对分类群体（DN、Flk1-SP、Podxl1-SP和DP）进行重新聚集和培养20小时，然后使用流式细胞仪进行分析。在再培养过程中形成的新细胞群被装箱。d3.5 DP群体太小，无法进行分析，因此未在本图中显示。该实验重复了三次，结果具有可比性。

鉴于Podxl SP细胞在分化EB中的早期出现，我们询问它们是否可以产生Flk1+细胞，从而代表一个新的中胚层祖细胞群体。使用荧光激活细胞分选（FACS）在d3.5、4.0和4.75从EB中分离出不同的群体，允许其重新聚集20小时[10]，然后分析Flk1和Podxl的表面表达。分选后立即通过流式细胞术确认分选群体的纯度(图S4). 代表性实验（共3个）如所示图1B新的Flk1+细胞数量最多来自于重新聚集的DN细胞（高达约40%）。由重新聚集的Flk1-SP细胞形成的新Flk1+细胞数量只有约一半（约22%），而DP和Podxl-SP细胞数量则更少（分别约15%和12%）。

相反，新的Podxl+细胞主要来自重新聚集的Flk1-SP（高达约71%），其次是DN（约42%）和DP（26%）细胞(图1B). 重新聚集的Podxl-SP细胞几乎只产生Flk1+细胞，在d4.75时也是最小的群体(图1A). 重新聚集的Podxl-SP未产生任何新的DP细胞。重新聚集后，只有DN和Flk1-SP细胞产生了所有四个亚群。总之，这些发现表明来自d4.75 EB的四个亚群具有不同的发育潜力。

分类细胞群的中胚层特征

为了评估从d4.75 EB中分离的细胞群体的中胚层特征，进行了QRT-PCR分析。这些群体都没有表达多能性标记Sox2系统和纳米(图2A). The highest levels of expression ofBrachyury（T）公司在DN、Flk1-SP和Podxl-SP群体中检测到原始条纹和新生中胚层的标记，在DP群体中表达量很低(图2B). 相反，在Flk1-SP群体中，原始条纹、中胚层和肠系膜的标记(T、 混合物1和Gsc公司，图2B)在显著水平上表达。Flk1-SP群体也转录了侧板标记(扭曲)，近轴(Pdgfra公司和Tbx6型)和心脏病前期(Gata4公司)但不是轴向(福克斯2)中胚层(图2C). 总之，这些结果表明，Flk1-SP群体包含早期Flk1+Pdgfra+中胚层祖细胞和/或其衍生的近轴、心脏前和血管中胚层细胞[14]. DP群体的表达谱最像侧板中胚层(扭曲，图2C). 这些结果表明，通过Podxl表达分离的Flk1-SP和DP群体代表不同的中胚层群体。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms531205f2.jpg
分类细胞群的中胚层特征

分离EB，用Flk1和Podxl抗体染色，并对FACS进行分类，以分离四个群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）中的每一个。分离总RNA，并用QRT-PCR分析标记基因的表达。每个基因的表达被标准化为Gapdh公司ESC，未分化ES细胞；未排序、未排序d4.75 EB。（A） 分选后的细胞群不表达多能性标记Sox2系统和纳米（B）新生中胚层标记的差异表达T型和肠系膜标志物混合物1和Gsc公司.（C）中胚层标记的差异表达Flk1，扭转（侧板中胚层），Tbx6型和Pdgfra公司（近轴中胚层），福克斯2（轴向中胚层），以及Gata4公司（心脏前中胚层）。所有QRT-PCR检测至少进行了三次；每个标记都显示了一个具有代表性的结果。

Podxl是EB中第一个具有原始红细胞生成潜能的人群

原始红细胞（EryP）是在原肠胚中出现的第一个造血谱系[36]或分化ES细胞[25]. 为了确定d4.75 EB中哪种分类细胞群含有EryP潜能，我们在甲基纤维素中进行了克隆形成祖细胞分析，并对EryP菌落进行了评分（代表EryP-菌落形成细胞或EryP-CFC）。大多数EryP电位（75%）在Podxl-SP人群中检测到，其余25%在DP人群中检测出(图3A). 胚胎（βH1和εY）和成人β1珠蛋白在Podxl-SP细胞中以显著水平表达，在DP细胞中以低得多的水平表达(图3B). 基本上没有表达珠蛋白在DN或Flk1 SP群体中检测到基因。结合EryP-CFC数据，这些发现表明最早具有原始红细胞生成潜能的细胞群体以Podxl表达为标志。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms531205f3.jpg
Podxl-SP人群具有原始红细胞生成潜能

（A） 进行EryP-CFC分析以评估d4.75 EB人群的原始红细胞生成潜能。将分选好的细胞（20000个）置于含有EPO的甲基纤维素中，4d后对EryP菌落进行评分。原始红细胞电位主要存在于Podxl-SP人群中。使用非配对双尾Student t检验（***p<0.001）分析3个独立实验的数据。（B） 对d4.75 EB人群中胚胎（βh1和εY）和成人（β1或βmaj）β样珠蛋白基因表达的QRT-PCR分析。每个基因的表达被标准化为Gapdh公司.

Flk1+Podxl+（DP）人群具有明确的造血潜能

为了评估这四个群体的确切造血潜能，我们进行了多系造血祖细胞分析。只有DP群体产生了大量明确的造血集落（EryD、巨噬细胞、巨核细胞、混合红细胞/巨噬细胞或红细胞/巨核细胞；图4A). 造血转录因子基因(Lmo2、Cdx4、Ets1、Runx1、Gata1、Tal1、HoxB4和飞行1)也主要在DP人群中表达(图4B). d4.75的DP人群同时表达c-Kit和CD41(图4C)，两个明确的造血祖细胞表面标记[37，38]. 然而，这些标记物并没有共同表达(图4C和数据未显示）。这些数据与其他人发表的结果一致，这些结果显示c-Kit在4.75天的EB中显著表达，但CD41水平较低[37]. CD41在大多数（58%）分离并在IV型胶原上重新培养3d的DP细胞表面表达[26，39]但其他三个再培养群体的细胞很少（如果有的话）(图4D). 综上所述，这些结果表明DP人群具有明确的造血潜能。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms531205f4.jpg
DP人群具有明确的造血潜能

（A） 多系祖细胞分析评估分类d4.75 EB细胞群的造血潜能。将细胞（10000）接种在含有细胞因子的甲基纤维素中。第5天对EryD菌落进行评分，第10天对其他菌落进行得分。使用非配对双尾Student t检验分析了3个独立实验的数据。DP群体产生的最终造血集落数量显著高于其他任何群体（*p<0.0001；**p<0.05）。EryD，明确的红细胞；巨核细胞；Mac，巨噬细胞；E/Mac，混合红细胞/巨噬细胞；和E/Mega，混合红细胞/巨核细胞集落。（B） 编码造血和内皮转录因子的基因表达的QRT-PCR分析。从分类的d4.75 EB群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）中分离出总RNA，并使用QRT-PCR进行分析。每个基因的表达被标准化为Gapdh公司该实验进行了三次，结果具有可比性。ESC，未分化ES细胞；未排序、未排序d4.75 EB。（C） 通过流式细胞术分析分选的d4.75 EB人群的C-Kit和CD41表达。这个实验重复了三次，结果相当。（D） 用IV型胶原再培养3d后，对d4.75 EB人群的Flk1和CD41进行代表性流式细胞术分析。该实验进行了4次，结果具有可比性。将由DP和Flk1-SP群体形成的CD41+细胞装箱。

Flk1-SP和DP人群含有内皮潜能

内皮转录因子基因的表达Etv2/ER71标准，塔尔1，Lmo2、Fli1和等1[40]在第4.75天，Flk1-SP和DP种群中(图4B)引导我们评估它们的内皮潜能。在有VEGF存在的情况下，对IV型胶原进行再培养后，用流式细胞术检测分选细胞上内皮标记物Flk1和CD31的表达。Flk1-SP和DP群体都表达Flk1和CD31，但Podxl-SP或DN群体没有表达(图5A)并显示对DiI-Ac-LDL的摄取(图5C). 免疫荧光进一步证实CD31的表达(图5B). 最后，Flk1-SP和DP细胞在基质凝胶上形成毛细血管样结构(图5D).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms531205f5.jpg
Flk1-SP和DP人群显示内皮潜能

（A） 分选的d4.75细胞群（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）在IV型胶原上培养3d，并用流式细胞术分析内皮标记物CD31（Pecam1）的表达。该实验进行了4次，结果具有可比性。（B） Pecam1的代表性免疫染色。将分选好的d4.75细胞群（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）在VEGF（5 ng/ml）存在下在IV型胶原上重新培养3d，然后用抗Pecam1（初级）抗体和Alexa Fluor 568山羊抗鼠二级抗体染色。比例尺，50微米。（C） 代表性DiI-Ac-LDL摄取分析。分选的d4.75细胞群（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）在VEGF存在下在IV型胶原上重新培养3d，然后与DiI-Ac-LDL（10 mg/ml）孵育4小时。比例尺，50微米。（D） Matrigel上毛细结构的形成。将分选好的d4.75群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）培养在Matrigel上，并加入VEGF和bFGF。培养后6小时采集图像。（B）和（C）中的分析进行了3次，结果具有可比性。重复两次（D）中所示的分析，结果具有可比性。C166是用作阳性对照的小鼠内皮细胞系。

心脏中胚层电位仅限于Flk1-SP人群

高水平表达Gata4公司(图2C)，心脏前中胚层的标志物[41]在Flk1-SP细胞中，提示我们询问该人群是否具有心脏电位。我们检查了心脏标志物Gata4、Hand1、Hand2、和牛顿x2.5在分类的d4.75群体中。Gata4、Hand1和Hand2在Flk1-SP和DP细胞中的表达水平均高于DN和Podxl-SP细胞(图6A).牛顿x2.5在我们的分析中，在d4.75时未检测到表达；其他人报告称其激活了EB分化的~d6[42，43]. 为了检测分选群体形成跳动菌落的可能性，从d4.75 EB分选的细胞被允许重新聚集24小时，然后在VEGF和bFGF的存在下培养4天[34]. 仅在培养的Flk1-SP聚集体中发现打浆菌落(图6B). 使用免疫荧光分析心脏标志物肌钙蛋白T（cTnT）的表达，并且仅在Flk1 SP细胞的搏动集落的细胞中检测到(图6C). 总的来说，这些数据表明Flk1的单独表达表明中胚层细胞向心肌谱系分离。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms 531205f6.jpg
Flk1-SP人群包含心脏电位

在StemPro-34无血清培养基中重新聚集分类的d4.75群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）24小时，然后在VEGF和bFGF存在下重新培养聚集物4天。对骨料形成的总菌落和收缩菌落进行评分。（A） 心脏中胚层标志物表达的QRT-PCR分析。从分类的d4.75 EB群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）中分离出总RNA，并使用QRT-PCR进行分析。每个基因的表达被标准化为Gapdh公司该实验进行了两次，结果具有可比性。ESC，未分化ES细胞；未排序、未排序d4.75 EB。（B） 两个独立实验的结果显示为跳动菌落数/总菌落数。（C） 使用大鼠抗鼠cTnT（初级）和Alexa Fluor 488山羊抗鼠（次级）抗体对Flk1-SP细胞聚集体形成的集落进行免疫染色。（比例尺，100微米）

Podxl表达区分小鼠胚胎中Flk1+中胚层种群

为了确定Podxl表达是否区分体内Flk1+中胚层群体，在E7.5、E8.5和E9.5处采集小鼠胚胎，分散到单个细胞，并使用流式细胞术分析Flk1和Podxx的表面表达。正如区分EB所观察到的(图1)，发育中的小鼠胚胎包含Flk1-SP、Podxl-SP和DP群体(图7A)在分析的每个阶段（E7.5和E8.5，在循环开始之前，当EryP局限于含有祖细胞活性的卵黄囊时；E9.5，当Ery P存在于血流中，但祖细胞活性已消失时[29，36]).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms531205f7.jpg
Podxl标记小鼠胚胎中的原始红细胞群

转基因电子球蛋白：：将H2B-GFP胚胎（E7.5、8.5和9.5）分离为单个细胞进行流式细胞术分析。（A） Podxl和Flk1在E7.5-E9.5小鼠胚胎中的表达。分化ES细胞的观察结果(图1)发育中的小鼠胚胎在每个阶段都含有Flk1-SP、Podxl-SP和DP种群。（B） Flk1在E7.5时在EryP/GFP+细胞的显著亚群表面表达，但在E8.5和E9.5时，在绝大多数EryP中不表达。相反，当几乎所有EryP都是Podxl+时，GFP+EryP上Podxl的表达从E7.5显著增加到E8.5。（C） 造血标记物CD41的表达在每个发育阶段与GFP荧光密切相关，表明大多数EryP表达CD41。Podxl+CD41+种群被装箱。底部的直方图显示了CD41表达从E7.5到E9.5的变化。面板A-C中显示的实验重复了两次，结果相当。

以前的一份报告表明，Podxl在E10的胚胎外周血细胞和E12卵黄囊的Ter119+CD71+细胞上表达[20]. 为了更直接地确定该蛋白是否在EryP上表达，我们使用了一种转基因小鼠系，在该系中，组蛋白H2B-GFP报告子在人类原发性红细胞（EryP）的细胞核中表达，并且受人类红细胞的控制-珠蛋白启动子和mLCR增强子[27–29]. 用针对Podxl和Flk1的抗体对GFP+（EryP）细胞进行染色，并使用流式细胞术进行分析。如预期[29]，Flk1在E7.5时在EryP/GFP+细胞亚群的表面上表达，但在E8.5和E9.5时在大多数EryP中不存在(图7B). 相反，当几乎所有EryP都是Podxl+时，GFP+EryP上Podxl的表达从E7.5急剧增加到E8.5(图7B). 相反，胚胎中Podxl+细胞的显著比例（27-60%）为EryP(图7B). 造血标志物CD41的表达在各个发育阶段与GFP荧光密切相关(图7C). CD41表达从E7.5增加到E8.5（EryP祖细胞数量增加[29])然后E9.5开始下降，此时EryP在血液中循环，祖细胞活性缺失[36，44]。

讨论

我们对造血发育和多能干祖细胞之间的等级关系的了解极大地得益于使用细胞表面标记来前瞻性地识别、分离和表征处于不同承诺阶段的细胞群体（例如，参见参考文献[45，46]). 以类似的方法，根据表面蛋白表达细分中胚层祖细胞的能力，将促进我们对中胚层谱系规范的理解。在这里，我们报告，根据Podxl表达，通过表面Flk1表达鉴定的ES细胞源性中胚层可以分离为具有不同潜力的不同群体。

在d4.75从EB中分离出的Podxl-SP亚群（此时有四个亚群被明确识别）只产生原始红细胞，且此潜能显著高于其他三个分离的群体。这些发现出乎意料，因为血统追踪研究先前证实原始和最终造血细胞均来自Flk1+中胚层[7]Flk1标记E7.5（祖细胞期）EryP的子集（参考[29]和本工程）。

在分化ES细胞时，Podxl的表达早于Flk1的表达，这增加了至少一些Flk1+中胚层细胞来自早期Podxl+细胞群的可能性。与这个想法一致，在不同时间从EB中分选出来的重新聚集的Podxl-SP细胞几乎只产生Flk1-SP细胞。因此，在Podxl表达分离表达Flk1的中胚层之前，Flk1表达可能会将表达Podxl-的中胚叶分离为亚群。相反，重新聚集的Flk1-SP和DP细胞产生Flk1-SP、DP和Podxl-SP细胞。这些观察结果表明，Podxl-SP群体包含早期中胚层细胞，与形成卵黄囊胚外中胚层和原始红系祖细胞的细胞相当。因此，这些数据表明Podxl可能是Flk1+中胚层细胞参与原始红系命运的早期标记。

在小鼠胚胎中，50%以上的GFP+转基因EryP在E7.5表达Podxl（大约在第一次使用集落分析检测祖细胞活性时[29])以及E8.5和E9.5的基本所有EryP。此外，胚胎中大部分Podxl+细胞是EryP（在E7.5、E8.5和E9.5时分别为~27%、60%和~50%）。因此，Podxl的表达不仅标志着循环EryP，也标志着其祖细胞，为鉴定胚胎的第一批造血细胞提供了新的工具。Podxl具有防粘连性能[47]并可能在动员骨髓中的红系祖细胞中发挥作用[48]. 很容易推测，这种抗粘附作用也有助于在胚胎中开始循环时，原始红细胞从卵黄囊中释放出来。

与Podxl-SP亚群相比，DP细胞基本上包含所有明确的造血潜能。DP群体也表达侧板中胚层标记扭曲所有造血基因都在最高水平上测试。它包含一小部分原始和内皮潜能。以前根据EB中Flk1+细胞出现的时间模式来区分原始和明确的造血谱系[49]. 在这里，我们根据细胞表面标记，在EB分化的同一时间段分离了这些谱系。

Flk1-SP细胞产生少量明确的造血细胞、内皮细胞和心肌细胞，而DP人群产生原始和明确的造血和内皮细胞谱系。Flk1-SP和DP细胞的内皮和造血标记物表达与其各自的发育潜能一致。Flk1 SP细胞表达内皮发育所需的高水平基因，但造血基因水平非常低，能够摄取Ac-LDL，并产生CD31+细胞。这些观察结果表明，该人群的内皮细胞潜能大于造血潜能。Flk1 SP群体也表达高水平的心脏制造因子Gata4公司并引起收缩的cTnT+心肌细胞。它们可能与Brachyury公司-先前报道的GFP/Flk1+心脏祖细胞[6，11]。

如引言中所述，与Flk1+细胞群相比，表达Flk1和Eng的细胞群富含成血管细胞活性[15]. 在提交这项工作后，据报道Eng的表达标志着早期胚胎中的第一个造血祖细胞[50]并且可以根据Eng在发育后期的表达水平来区分造血和内皮谱系[51]. 有趣的是，诱导的Eng过度表达可能影响决定造血与内皮和心脏潜能的转换[52]. 我们有兴趣在这里分析的各种细胞群上检测Eng的表达。CD40和Icam2在血液规范的早期阶段相继表达在体外和体内[53]. 他们与Podxl和Eng的时间关系尚待确定。

结论

Podxl的表达提供了一种新的工具，可以在无需转基因报告ES细胞系的情况下分离不同的中胚层细胞群，从而分化EB，因此应该可以翻译到人类多能干细胞系统。随着Podxl和其他标记物的联合使用，将有可能对具有独特发育潜力的早期中胚层细胞群进行更精确的分离，并最终有助于从分化的多能干细胞中分离谱系特异性祖细胞，以用于再生医学。

补充材料

补充图S1-S4

图S1。未诱导和DOX诱导EB中的基因表达簇和模式。使用从未诱导和DOX诱导的RNA中分离的RNA筛选15K发育cDNA微阵列i-混合1EB。热图显示了Dox（+）和Dox（−）条件下分化期间的基因表达。右侧显示了每个簇的每个时间点的平均表达式。基因本体（GO）富集分析揭示中胚层形成基因(Dkk1、Nckap1、Eomes、Hmga2)在集群#8中（请参阅表S3). 对包含“造血”和“血液”两个词的GO术语分布的458个基因的探索也表明，与这些术语相关的基因在簇#8中有选择性地富集(Cdh2、Amot、Gata2、Gas6).

图S2。分化EB细胞上Flk1和Podxl的表达。E14 ES细胞被诱导分化为EB，并在指定日期收获。用抗Flk1和抗Podxl1抗体对细胞进行染色，然后进行流式细胞仪分析。

图S3。的表达式法兰1和Podxl公司mRNA在分化EB中的表达。E14 ES细胞被诱导分化为EB，并在指定日期收获。提取总RNA并使用QRT-PCR进行分析。的表达式法兰1和Podxl公司被归一化为Gapdh公司.

图S4。流式细胞术分析证实了分类人群的纯度。（A） 流式细胞术分析显示4.75天EB中基于Podxl表达的Flk1+分化ES细胞的细分。方框表示用于FACS对每个种群进行排序的选通示意图。（B） 分类后对每个人群进行流式细胞术分析。分选后立即用流式细胞仪对每个群体进行分析，以测量分选效率。

单击此处查看。（1.9M，pdf格式）

补充表S1-S3

单击此处查看。（54K，文档）

致谢

我们感谢Ambjuj（Butch）Upadhyay提供的杰出技术援助，感谢Andrei Vacaru博士对手稿的周到评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（RO1 HL62248）对M.H.B.的资助。

脚注

潜在利益冲突的披露：作者声明没有利益冲突。

作者贡献：概念和设计：H.Z.、S.T.F.、J.I.、M.H.B。；数据收集和汇编：H.Z.、J.L.、S.T.F.、J.I.、P.D.、D.P.、S.L.D'S。，医学博士。；数据分析和解释：H.Z.、J.L.、S.T.F.、J.I.、P.D.、D.P.、M.A.D.、M.H.B。；手稿撰写：H.Z.、S.T.F.、M.H.B。；财政支持：I.R.L.、M.A.D.、M.H.B。；手稿最终批准：M.H.B。

工具书类

1Lawson KA、Meneses JJ、Pedersen RA。小鼠胚胎胚层形成过程中外胚层命运的克隆分析。发展。1991;113:891–911.[公共医学][谷歌学者]
2Kinder SJ，Tsang TE，Quinlan GA，等。小鼠胚胎原肠胚形成过程中，中胚层细胞有序地分配到胚外结构和前后轴。发展。1999;126:4691–4701.[公共医学][谷歌学者]
三。Kinder SJ，Loebel DA，Tam PP。小鼠胚胎中心血管祖细胞的分配和早期分化。心血管医学趋势。2001;11：177–184。[公共医学][谷歌学者]
4Tam PP，Loebel DA。小鼠胚胎发生中的基因功能：准备原肠胚形成。Nat Rev基因。2007;8:368–381.[公共医学][谷歌学者]
5Ema M，Takahashi S，Rossant J.靶向Flk1-lacZ等位基因中选择盒的缺失，而非相互作用元件的缺失揭示了Flk1在多能耐中胚层祖细胞中的表达。鲜血。2006;107:111–117.[公共医学][谷歌学者]
6Kattman SJ、Huber TL、Keller GM。多功能flk-1+心血管祖细胞产生心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌谱系。开发单元。2006;11:723–732.[公共医学][谷歌学者]
7Lugus JJ、Park C、Ma YD等。原始和最终血细胞均来源于Flk-1+中胚层。鲜血。2009;113:563–566. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Keller G.胚胎干细胞分化：生物学和医学新时代的出现。基因开发。2005;19:1129–1155.[公共医学][谷歌学者]
9Murry CE，Keller G.胚胎干细胞向临床相关人群的分化：胚胎发育的教训。单元格。2008;132:661–680.[公共医学][谷歌学者]
10Fehling HJ、Lacaud G、Kubo A等。胚胎干细胞分化期间中胚层诱导及其对血管母细胞的规范跟踪。发展。2003;130:4217–4227.[公共医学][谷歌学者]
11Kouskoff V，Lacaud G，Schwantz S等。胚胎干细胞分化过程中造血和心脏中胚层的顺序发育。美国国家科学院院刊。2005;102:13170–13175. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Sakurai H，Era T，Jakt LM等。近轴和横向中胚层分化的体外建模揭示了早期的可逆性。干细胞。2006;24:575–586.[公共医学][谷歌学者]
13Era T、Izumi N、Hayashi M等。多个中胚层亚群产生内皮细胞，而造血细胞仅从胚胎干细胞分化培养的有限亚群中分化。干细胞。2008;26:401–411.[公共医学][谷歌学者]
14Kataoka H、Hayashi M、Nakagawa R等。Etv2/ER71从Flk1+PDGFRalpha+原始中胚层诱导血管中胚层。鲜血。2011;118:6975–6986.[公共医学][谷歌学者]
15佩林盖罗RC。内皮素是血管母细胞和早期造血发育所必需的。发展。2007;134:3041–3048.[公共医学][谷歌学者]
16Willey S，Ayuso-Sacido A，Zhang H，等。通过小鼠混合型同源域转录因子在分化ES细胞中加速中胚层发育和造血祖细胞的扩增。鲜血。2006;107:3122–3130. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Zhang H，Fraser ST，Papazoglu C，等。Mixl1同源域蛋白在小鼠胚胎干细胞分化中的转录激活。干细胞。2009;27:2884–2895. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Nielsen JS，McNagny KM。podocalyxin在健康和疾病中的作用。《美国肾脏病杂志》。2009;20:1669–1676.[公共医学][谷歌学者]
19Doyonnas R、Kershaw DB、Duhme C等。缺乏CD34相关蛋白podocalyxin的小鼠的无尿、脐膨出和围产期死亡率。《实验医学杂志》。2001;194:13–27. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Doyonnas R、Nielsen JS、Chelliah S等。Podocalyxin是小鼠造血干细胞和胚胎红细胞的CD34相关标记物。鲜血。2005;105:4170–4178.[公共医学][谷歌学者]
21McNagny KM、Pettersson I、Rossi F等。血栓粘蛋白，一种新的细胞表面蛋白，定义了血栓细胞和多能干造血祖细胞。细胞生物学杂志。1997;138:1395–1407. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Sassetti C，Tangemann K，Singer MS等。足角蛋白样蛋白作为L-选择素的高内皮小静脉配体的鉴定：与CD34相似。《实验医学杂志》。1998;187:1965–1975. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Hara T，Nakano Y，Tanaka M，等。将podocalyxin样蛋白1作为小鼠主动脉-中肾区血管母细胞的新细胞表面标记物的鉴定。免疫。1999;11:567–578.[公共医学][谷歌学者]
24Horvat R、Hovorka A、Dekan G等。内皮细胞膜含有足蛋白——内脏肾小球上皮细胞的主要唾液酸蛋白。细胞生物学杂志。1986;102:484–491. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Kennedy M，Keller GM。培养中ES细胞的造血承诺。方法酶制剂。2003;365:39–59.[公共医学][谷歌学者]
26Fraser ST，Ogawa M，Nishikawa S.将胚胎干细胞分化作为研究造血和内皮细胞发育的模型。方法分子生物学。2002;185:71–81.[公共医学][谷歌学者]
27Isern J、Fraser ST、He Z等。胎儿肝脏是原始红细胞成熟的生态位。美国国家科学院院刊。2008;105:6662–6667. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Isern J、Fraser ST、He Z等。转录因子Eklf对原始红细胞成熟和鉴定的剂量依赖性调节。鲜血。2010;116:3972–3980. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Isern J，He Z，Fraser ST等。单链转录组分析揭示了小鼠胚胎原始红系祖细胞的关键调控途径。鲜血。2011;117:4924–4934. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30’t Hoen PA，de Kort F，van Ommen GJ等。用于微阵列应用的cRNA荧光标记。核酸研究。2003;31：e20。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Tanaka TS，Jaradat SA，Lim MK等。使用15000只小鼠发育cDNA微阵列对妊娠中期胎盘和胚胎进行全基因组表达谱分析。美国国家科学院院刊。2000;97:9127–9132. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Baron MH，Mohn D.用于分析造血和血管发育的小鼠胚胎外植体培养系统。收件人：Baron MH，编辑。发育性造血：方法和方案。第15章。新泽西州托托瓦：Humana出版社；2005年，第231-256页。[公共医学][谷歌学者]
33Fraser ST，Isern J，Baron MH.使用转基因荧光报告鼠系监测胚胎发生期间的造血和红细胞发育。收件人：Wasserman PaSPE。，编辑。小鼠发育技术指南：酶学方法。2010年，第403–427页。[公共医学][谷歌学者]
34Chen VC、Stull R、Joo D等。Notch信号将血管母细胞重新指定为心脏命运。国家生物技术。2008;26:1169–1178. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35McCloskey KE，Stice SL，Nerem RM。胚胎干细胞内皮细胞的体外衍生和扩增。方法分子生物学。2006;330:287–301.[公共医学][谷歌学者]
36Palis J、Robertson S、Kennedy M等。小鼠卵黄囊和胚胎中红系和髓系祖细胞的发育。发展。1999;126:5073–5084.[公共医学][谷歌学者]
37Mikkola HK、Fujiwara Y、Schlaeger TM等。CD41的表达标志着小鼠胚胎中最终造血的开始。鲜血。2003;101:508–516.[公共医学][谷歌学者]
38Ferkowicz MJ、Starr M、Xie X等。CD41表达定义了小鼠胚胎原始和最终造血的开始。发展。2003;130：4393–4403。[公共医学][谷歌学者]
39Nishikawa S-I、Nishikawa S、Hirashima M等。通过细胞分类和培养进行的渐进性谱系分析，在内皮细胞和造血谱系的分叉点识别FLK1+VE-cadherin+细胞。发展。1998;125:1747–1757.[公共医学][谷歌学者]
40De Val S，Black BL。内皮细胞发育的转录控制。开发单元。2009;16:180–195. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Kuo CT、Morrisey EE、Anandappa R等。腹侧形态发生和心管形成需要GATA4转录因子。基因与发育。1997;11:1048–1060.[公共医学][谷歌学者]
42Chi X，Chatterjee PK，Wilson W，3rd等。由noggin敏感增强子激活的复杂心脏Nkx2–5基因表达，随后是心室特异性模块。美国国家科学院院刊。2005;102:13490–13495. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Miller-Hance WC、LaCorbiere M、Fuller SJ等。胚胎干细胞心脏发生过程中的体外室规范。心室肌球蛋白轻链-2基因的表达与心脏导管的形成无关。生物化学杂志。1993;268:25244–25252.[公共医学][谷歌学者]
44McGrath KE、Koniski AD、Malik J等。哺乳动物胚胎中的循环是逐步建立的。鲜血。2003;101:1669–1676.[公共医学][谷歌学者]
45Majeti R，Park CY，Weissman IL。人类脐血中多潜能造血祖细胞层级的鉴定。细胞干细胞。2007;1：635–645。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Pronk CJH、Rossi DJ、Mánsson R等。骨髓红系祖细胞层次的表型、功能和分子地形学阐释。细胞干细胞。2007;1:428–442.[公共医学][谷歌学者]
47Takeda T、Go WY、Orlando RA等。足细胞粘连蛋白的表达抑制Madin-Darby犬肾细胞的细胞间粘附并改变连接特性。分子生物学细胞。2000;11:3219–3232. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Sathyanarayana P、Menon MP、Bogacheva O等。促红细胞生成素对足细胞黏菌素的调节，以及拟议的红细胞生态位。鲜血。2007;110:509–518. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Irion S、Clarke RL、Luche H等。小鼠胚胎干细胞和诱导多能干细胞血液祖细胞的时间规范。发展。2010;137:2829–2839. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Borges L、Iacovino M、Mayerhofer T等。内皮素在胚胎发育期间血液出现中的关键作用。鲜血。2012;119:5417–5428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Borges L，Iacovino M，Koyano-Nakagawa N，等。内皮素表达水平在卵黄囊造血不同阶段的造血和内皮子代鉴别。干细胞。2013 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Baik J，Borges L，Magli A，等。类胚体发育过程中内皮素过度表达的影响。实验血液学。2012;40:837–846. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
53Pearson S、Lancrin C、Lacaud G等。CD40和Icam2的顺序表达定义了中胚层血前体形成的渐进步骤。干细胞。2010;28:1089–1098.[公共医学][谷歌学者]