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神经病理学学报。2013; 126（6）：895–905。
2013年10月29日在线发布。 数字对象标识：2007年10月10日/00401-013-1199-1
预防性维修识别码：项目经理3830740
PMID：24166615

减少C9或72c9FTD/ALS中的基因表达是由组蛋白三甲基化引起的，这是一种在血液中可检测到的表观遗传事件

维罗尼克·贝尔齐尔，1 彼得·鲍尔，1 梅赛德斯·普鲁登西奥，1 塔尼亚·F·根德隆，1 卡罗琳·斯特勒，1 艾琳·K·燕，4 吕克·普雷金特，1 莉莲·多赫蒂（Lillian Daughrity），1 马修·贝克，1 罗莎·拉德梅克斯，1 凯文·博伊兰，2 Tushar C.Patel公司，三 丹尼斯·W·迪克森，1和伦纳德·彼得鲁切利通讯作者1
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补充资料

摘要

携带（GGGCC）扩增重复序列的个体C9或72该基因在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆症（FTD）患者中占很大比例。解释这些扩展重复是如何导致“c9FTD/ALS”的，这已成为该领域的一个重要目标。为此，我们试图研究表观遗传变化是否是导致C9或72c9FTD/ALS患者的表达水平。我们从10个c9FTD/ALS个体中获得了脑组织，其中9个FTD/ALS病例没有C9或72重复扩增，9名疾病控制参与者，并从7名患者中产生成纤维细胞系C9或72扩大重复携带者和7名携带正常等位基因的参与者。使用赖氨酸9（H3K9）、27（H3K27）、79（H3K179）和20（H4K20）三甲基化组蛋白H3和H4抗体的染色质免疫沉淀显示，这些三甲基化残基与C9或72脑组织中的扩增重复，但不是非致病性重复。我们的发现C9或72c9FTD/ALS患者额叶皮质和小脑的mRNA水平降低与这些组蛋白残基的三甲基化一致，这是一种已知的抑制基因表达的事件。此外，用DNA和组蛋白去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理重复载体衍生的成纤维细胞，不仅减少了C9或72与三甲基化组蛋白残基结合，但也增加C9或72mRNA表达。我们的结果提供了令人信服的证据，证明组蛋白H3和H4中赖氨酸残基的三甲基化是一种参与减少C9或72mRNA在扩增重复载体中的表达。重要的是，我们展示了突变体C9或72在c9FTD/ALS患者的血液中可以检测到与三甲基H3K9和H3K27的结合。使用来自更多患者队列的血液证实这些令人兴奋的结果，可能会将这种新的表观遗传事件作为c9FTD/ALS的生物标记物。

电子辅助材料

本文的在线版本（doi:10.1007/s04041-13-1199-1）包含补充材料，授权用户可以使用。

关键词：肌萎缩侧索硬化、额颞痴呆、，C9或72、表观遗传修饰、重复扩增、组蛋白甲基化

介绍

肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是两种破坏性神经退行性疾病，高达50%的患者同时患有这两种疾病[23，28]。ALS是最常见的运动神经元疾病[26]其特征是上下运动神经元变性，导致成年中期肌肉无力、痉挛和萎缩，患者发病后的平均预期寿命为3-5年[7]。额颞叶痴呆是最常见的老年前期痴呆之一[19]额叶和颞叶神经元变性，导致行为、个性和/或语言的逐步恶化[24]。最近的研究表明，一个扩展的非编码己核苷酸（GGGCC）在9号染色体开放阅读框72基因(C9或72，OMIM*614260）是FTD和ALS最常见的已知病因，统称为c9FTD/ALS[16，36]。突变携带者有数百到数千个（GGGCC）六核苷酸重复序列拷贝，而非致病携带者只有30个或更少拷贝[16]。这一发现进一步证明了这两种疾病是由相同或重叠的生物途径缺陷引起的。

最近的研究表明C9或72重复扩增可能通过形成可能隔离RNA-结合蛋白的RNA焦点，以及导致聚集蛋白c9RAN合成的重复相关非ATG（RAN）翻译，导致RNA-介导的毒性[2，16，30]。减少C9或72重复扩张携带者脑和淋巴母细胞中的mRNA水平也有报道[16，22，36]表明C9orf72功能的丧失也可能在疾病发病中起作用。此外，斑马鱼同源基因的下调C9或72导致运动神经元轴突形态改变和运动缺陷，并且这些特征在野生型人类过度表达后会逆转C9或72，进一步支持C9orf72功能丧失是有害的概念[14]。RNA毒性和功能丧失的双重参与与重复扩张引起的各种神经退行性疾病有关，包括强直性肌营养不良、脊髓小脑共济失调（SCA）8型和31型以及脆性X相关震颤/共济失调综合征[35].

越来越多的证据表明，重复扩增可通过DNA和组蛋白甲基化变异引起的表观遗传变化损害mRNA表达，从而导致异染色质形成导致转录机制异常结合[1，4，15，27，32，41]。表观遗传改变和mRNA表达改变以前与FTD/ALS发病机制有关。例如，异常的表观遗传调控颗粒蛋白(GRN），该基因编码前颗粒蛋白（PGRN），在大约5-10%的FTD总人群中发生突变，导致GRN公司mRNA表达[18]。有趣的是，DNA甲基转移酶（DNMTs）的蛋白质水平通过催化甲基转移到调控区域的胞嘧啶残基来诱导DNA甲基化，从而增加小鼠运动神经元的凋亡前水平[13]，和DNMT1、DNMT3a和5-甲基胞嘧啶在ALS患者的运动神经元中均上调[13]。据报道，DNMT1在重复区域和重复基因组序列中都起到维持甲基转移酶的作用，其特征是胞嘧啶-鸟嘌呤序列（称为胞嘧啶-磷酸-鸟嘌嘧啶（CpG）岛）的频率较高，而DNMT3主要在CpG岛起作用。这些岛在活性基因中通常不甲基化，通常甲基化以抑制印记基因的基因表达[9]。观察到的预期CpG比率大于60%预测基因组DNA区域中大于200 bp的CpG岛[20]。根据这一标准，携带700-1600份（GGGCC）拷贝的患者的观察到的预期CpG比率为75%。这表明存在一个新形成的CpG岛，跨越重复区域，可能存在扩张载体异常甲基化的风险。鉴于重复序列的甲基化以及启动子区域内相邻CpG岛的超甲基化已被证明异常影响组蛋白甲基化过程，导致基因沉默，从而导致蛋白质功能丧失[1，37]，我们试图确定是否在c9FTD/ALS中发生类似的疾病级联反应。

为了阐明导致C9或72突变携带者的信使核糖核酸[16，22，36]这可能导致C9orf72功能丧失，我们研究了是否涉及扰动的表观遗传过程。我们的结果清楚地表明，组蛋白H3和H4在几个赖氨酸残基上的三甲基化是一种新的机制，涉及到减少C9或72mRNA在扩增重复载体中的表达。此外，使用两个扩增重复序列携带者的外周血，我们证实这些表观遗传变化很容易检测到。未来的研究需要在更大的c9FTD/ALS患者队列中确认表观遗传变化的血液检测，以验证这一新的表观遗传事件的生物标记物能力。

材料和方法

标准方案批准、注册和患者同意

梅奥诊所机构审查委员会和道德委员会批准了人体实验方案。所有参与者或授权家庭成员均出具书面知情同意书，然后收集参与者和家庭信息、皮肤活检或进行尸检分析。

学科

这项研究的所有参与者都是在佛罗里达州梅奥诊所招募的，并由训练有素的神经学家独立确定患有ALS和/或FTD。对4例ALS患者和6例FTD患者进行尸检分析后，获得了额叶皮质和小脑组织C9或72扩张，4例ALS和5例FTD，无C9或72扩展和九名疾病控制参与者（在线资源中的临床信息，表2）。共收集了七份皮肤活检C9或72扩张携带者，包括两名28岁和30岁的健康携带者和七名携带正常等位基因的参与者（在线资源中的临床信息，表3）。血样取自两名携带重复扩增的ALS患者和两名携带正常等位基因的ALS病例（在线资源中的临床信息，表4）。

成纤维细胞的维护和治疗

成纤维细胞来源于前臂前部穿刺活检的皮肤样本。成纤维细胞在37°C、含5%CO的大气中，在Dulbecco改良的Eagle's培养基（瑞士巴塞尔Lonza）中培养，补充10%热灭活胎牛血清（美国密苏里州St-Louis的Sigma-Aldrich）、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Gibco）2和95%的空气。细胞用2μM 5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza）或二甲基亚砜（DMSO）处理6天，然后收获用于进一步实验。

定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

按照制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从成纤维细胞中提取总RNA，并使用RNEasy Plus Micro Kit（QIAGEN，Venlo，Limberg，Netherlands）从脑组织中提取总RNA。RNA完整性在安捷伦2100生物分析仪上得到验证（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）。按照制造商的说明，使用约1μg带有随机引物的RNA和高容量cDNA转录试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得cDNA。按照标准方案，对所有样本进行三次qRT-PCR，使用盘点的TaqMan基因表达测定C9或72转录变体1（NM_145005.5）、2（NM_018325.3）和3（NM_001256054.1）（Hs00376619），C9或72转录变体2和3（Hs00945132），C9或72转录变体1（Hs00331877），GAPDH公司（Hs00266705），以及H19型（Hs 00262142）（应用生物系统），ABI Prism 7900HT快速实时PCR系统（应用生物系）。使用∆∆Ct方法确定相对定量，并将其归一化为GAPDH公司.

滴滴数字PCR（ddPCR）

使用RNEasy Plus Micro Kit（QIAGEN）从脑组织中分离RNA，并按照制造商的说明，使用随机引物和高容量cDNA转录试剂盒（Applied Biosystems）通过逆转录获得cDNA。使用4μl逆转录产物、10μl ddPCR 2x Master Mix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）、1μl 20x引物和TaqMan探针分析为液滴数字PCR制备反应混合物C9或72转录变体1、2和3（Hs00376619），C9或72转录变体2和3（Hs00945132），C9或72转录物变体1（Hs00331877）（Applied Biosystems）和5μl无核酸酶的水，每个反应混合物。阴性对照只含有水。使用QX100液滴发生器（Bio-Rad）和液滴发生器DG8筒（Bio-Rad）生成乳化的1 nL反应液滴，每口井含有20μl反应混合物和70μl ddPCR液滴生成油（Bio-Read）。35微升生成的液滴乳剂被转移到96个PCR板上，这些板用箔板进行热密封。通过热循环液滴乳剂进行目标DNA扩增，如下所示：初始变性在95°C下进行10分钟，然后在94°C下40次循环30秒，60°C下1分钟，然后98°C下10分钟。使用QX100液滴读取器（Bio-Rad）测量每个热循环液滴的荧光。阴性对照组荧光阈值设置后，使用QuantaSoft软件（Bio-Read）分析数据。

染色质免疫沉淀（ChIP）

将生长在90-95%汇合处的10cm培养板中的成纤维细胞用二甲基亚砜或5-AZA处理，然后在37°C下与1%甲醛孵育10分钟进行交联。然后添加甘氨酸（125 mM），并在室温下培养细胞5分钟以猝灭交联。成纤维细胞用冷PBS清洗，在13000×克将细胞颗粒重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的500μl SDS裂解缓冲液（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）中，并在冰上培养10分钟。在35%的输出下，DNA被四个10秒开/30秒关的声波周期剪切。然后用900μl ChIP稀释缓冲液（EMD Millipore）稀释100μl每个样品。对于预清洗，样品与40μl蛋白A琼脂糖浆液（EMD Millipore）在4°C下旋转培养1 h。然后，将样品在4°C下与2μg抗（pan）H3（EMD Millipore）或抗H3K9me3（Diagenode，Denville，NJ，USA）孵育过夜。使用50–70 mg在交联和淬火后使用组织研磨机均质的组织进行大脑样本的ChIP，并遵循与成纤维细胞相同的程序，但样品在4°C下与2μg抗（pan）H3和H4（EMD Millipore）以及抗H3K9me3、H3K27me3、，H3K79me3，H4K20me3（对角化合物）。用抗体隔夜孵育，然后在4°C下用50μl琼脂糖浆液孵育3小时。使用在标准条件下分离的单核细胞进行血液ChIP，并使用汉克溶液清洗两次（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司）。DNA被六个10秒开/30秒关的声波周期以30%的输出剪切，然后进行与成纤维细胞研究相同的ChIP程序。然而，使用1μg抗（pan）H3（EMD Millipore）、抗H3K9me3和抗H3K27me3（Diagenode）抗体在4°C下进行过夜培养，然后使用25μl琼脂糖浆液在4°C下培养3小时。三个实验的结合络合物在室温下旋转洗涤10分钟，首先用低盐免疫复合物洗涤缓冲液，然后用高盐和氯化锂免疫复合物清洗缓冲液（均来自EMD Millipore），最后用TE缓冲液洗涤两次。用TE缓冲液进行最终清洗后，用新制备的ChIP洗脱缓冲液（0.1 M NaHCO）培养琼脂糖三，1%SDS）在室温下旋转20分钟，然后丢弃琼脂糖珠。在65°C下用200 mM NaCl反向交联过夜用于成纤维细胞和大脑研究，或在6 h用于血液研究后，用0.5μg/μl蛋白酶K在45°C下处理样品90 min。使用DNA清理试剂盒（Zymo Research，Irvine，CA，USA）纯化洗脱的DNA进行分析。对于半定量（semi-q）PCR，使用PrimerSelect（美国威斯康星州麦迪逊市DNASTAR）设计正向引物5′AGAGTGGAAAAACAAAAAACAC3′和反向引物5’AAAACCAAAAATCGTCTTCACTT3′。使用1μl ChIP获得的DNA、0.75μl dNTP、1.5μl 10x标准缓冲液（包括1.5 mM最终MgCl）通过PCR进行DNA扩增2浓度）、0.6μl每个引物、10.25μl无核水和0.3μl Apex Taq聚合酶（Genesee Scientific），每个反应混合物在Mastercycler proS（Eppendorf）上运行。对于每个片段，首先在95°C下进行5分钟的变性步骤。之后，采用着陆方案，包括94°C下20 s变性、65°C下20s退火和72°C下30 s伸长率的初始循环。随后进行十个循环，其中退火温度每次降低1°C。然后在94℃下进行40次20 s变性、58℃下进行20 s退火和72℃下进行30 s伸长率。在72°C下进行最终拉伸5分钟。DNA产物在2%琼脂糖凝胶中电泳。

统计分析

我们使用了未成对学生的t吨两个样本组之间的比较测试，置信水平为95%。采用单向方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行多重比较，置信度为95%。当对 < 0.05 (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.005).

结果

鉴于大脑组织分析C9或72mRNA表达水平仅限于额叶皮层[16，22]，我们首先试图探索C9或72在我们的患者队列中，额叶皮层的mRNA表达同样减少，为了评估小脑中是否也观察到mRNA表达减少，小脑是c9FTD/ALS的另一个脑区[34]。我们从10个ALS和FTD中获取了脑组织样本C9或72重复携带者（C9orf72+）、9名ALS和FTD患者携带非致病菌C9或72重复（C9orf72−）和九种C9orf 72−疾病对照（在线资源中的临床信息，表2）。然后，我们从小脑和额叶皮质分离RNA，并使用靶向转录变体1、2和3以及转录变体2和3的Taqman探针，通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）进行表达分析（图1a） ●●●●。由于转录变体1很难通过标准qRT-PCR检测，我们使用一种高度精确和绝对的核酸定量技术，即滴滴数字PCR（ddPCR）来评估其表达[25]。此外，我们进一步比较了从标准qRT-PCR和ddPCR获得的表达水平（在线资源，图1，表1）。我们发现，与正常重复长度携带者和疾病控制参与者相比，C9orf72+组在所有检测中的mRNA表达均降低（图1b–e）。

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C9orf72+组的额叶皮层和小脑组织样本显示C9或72mRNA表达水平。一显示三种已知转录变体的示意图C9或72. The星形标记重复位置。b条，c（c）qRT-PCR用于C9或72转录物变体1、2、3和C9或72转录变体2、3在额叶皮层进行(b条)和小脑(c（c）). 将图表上的数据归一化为疾病对照组（平均值设置为1）。通过Tukey事后检验的单因素方差分析计算统计学差异*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.005.d日，e（电子）ddPCR用于计算不太丰富的C9或72额叶皮质转录变体1(d日)和小脑(e（电子）). 转录表达以每微升拷贝数表示。每组显示了所有测试样本的平均表达和表达范围。参与者的临床描述见表2（在线资源）

我们接下来探讨了C9或72组蛋白H3在赖氨酸9、27、79和赖氨酸20处的三甲基化与基因阻遏有关[三]。我们使用来自所有28名参与者的脑组织，进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验，使用抗H3K9me3、抗H3K27me3、防H3K79me3、反（泛）H3（总组蛋白H3）以及抗H4K20me3和反（潘）H4（总组分H4）。我们成功地放大了C9或72致病性重复载体中的启动子区域，并发现三甲基化残基只与C9或72重复膨胀（图2a–e）。值得注意的是C9或72在抗（pan）H3和抗（pan）H4沉淀的所有样品中扩增基因组区域（在线资源中的完整结果，图2），确认正常C9或72与组蛋白H3和H4结合。

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减少C9或72C9orf72+组的mRNA表达水平是与三甲基化组蛋白残基异常结合的结果。一一组受试者染色质免疫沉淀DNA的电泳表现。使用对总组蛋白H3和H4或三甲基化组蛋白H3K9、H3K27、H3K79和H4K20特异的抗体，对两种不同的人类组织，即额叶皮层（F）和小脑（C）进行染色质免疫沉淀（ChIP）。下拉后，纯化结合DNA并用于PCR扩增C9或72启动子区。当使用靶向三甲基化组蛋白残基的抗体进行ChIP时，C9orf72+组成功扩增了该区域；在相同条件下，C9orf72−和疾病对照组中该区域没有扩增，表明没有结合。在线资源中提供了完整的数字。b条，c（c），d日，e（电子）通过测量每个免疫沉淀组蛋白的条带强度（在线资源中的完整凝胶，图2），对所有大脑DNA进行相对定量，并以与输入的比率表示。每个图表均归一化为疾病对照组的总组蛋白水平（平均值设置为1）。采用Tukey事后检验，通过单因素方差分析计算统计差异*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。参与者的临床描述见表2（在线资源）

为了证实c9FTD/ALS中扩增重复序列与三甲基化赖氨酸残基的异常结合导致mRNA表达减少，我们治疗了从携带正常等位基因（C9orf72−）的7名参与者和携带（GGGGCC）重复扩增（C9orf72+）的7名患者获得的成纤维细胞（在线资源中的临床信息，表3）与5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza），一种著名的DNA和组蛋白去甲基化剂[31，33]。在RNA分离和反转录后，我们使用探针靶向性，通过qRT-PCR进行表达分析C9或72转录变体1、2和3以及转录变体2和3。5-AZA治疗后，C9或72重复扩增载体（GGGGCC）成纤维细胞的mRNA表达显著增加，而携带正常等位基因的受试者的成纤维细胞未观察到这种效应（图三a、 b）。然而H19型5-AZA治疗后，病理性和正常重复载体中的印迹基因均增加（图三c） ●●●●。与我们的大脑ChIP实验一致，我们发现H3K9me3与C9或72DMSO处理的C9orf72+成纤维细胞重复扩增，但C9orf 72-成纤维细胞没有重复扩增。重要的是，5-AZA诱导的C9或72C9orf72+成纤维细胞中mRNA的表达伴随着细胞与C9或72H3K9me3启动子（图三d、 e）。与我们使用脑组织的研究类似，我们发现C9或72用抗（pan）H3沉淀样品后，所有成纤维细胞中的组蛋白H3（图三f） （在线资源中的完整结果，图3）。

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C9或725-AZA治疗后C9orf72+成纤维细胞中mRNA表达增加，H3K9me3结合减少。一，b条从DMSO或5-AZA脱甲基剂中生长的人成纤维细胞获得的RNA的qRT-PCR。两种分析均针对转录变体1、2、3(一)和2,3(b条)5-AZA治疗后仅在C9或72重复扩展托架。c（c）的qRT-PCRH19型，一个印迹基因，显示5-AZA治疗C9orf72+和C9orf 72-成纤维细胞的有效性。未配对学生评估了统计差异t吨测试*对 < 0.05, **对 < 0.01.NS公司无显著差异。d日使用对总H3或三甲基化组蛋白H3K9特异的抗体对来自成纤维细胞亚群的染色质免疫沉淀DNA进行电泳表示。成纤维细胞在DMSO或5-AZA中生长。对C9orf72+和C9orf 72-参与者的成纤维细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）。下拉后，纯化结合DNA并用于PCR扩增C9或72启动子区。用载体（DMSO）处理后，C9orf72+细胞中与三甲基组蛋白H3K9的结合通过扩增水平评估C9或72启动子区的启动子水平高于C9orf72−。在C9orf72+病例中，5-AZA治疗降低了这种结合。在线资源中提供了所有成纤维细胞系的完整数据。e（电子），（f）通过测量每个免疫沉淀组蛋白的条带强度（在线资源中的完整凝胶，图3），对所有成纤维细胞系进行相对定量，并以与输入的比率表示。图被标准化为疾病对照组的总组蛋白水平（平均值设置为1）。采用Tukey事后检验，通过单因素方差分析计算统计差异*对 < 0.05. 参与者的临床描述见表3（在线资源）

最后，为了确定这些生物变化在外周血中是否可检测到，我们从两个重复扩增载体（C9orf72+）和两个携带正常等位基因（C9orm72-）的参与者的血液中分离出单核细胞，并使用抗H3K9me3、抗H3K27me3和抗（pan）H3进行了ChIP实验。和大脑一样，我们确认只有突变体C9或72强烈结合H3K9me3和H3K27me3，尽管正常结合C9或72所有四个样品中组蛋白H3的启动子区域（图4).

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扩展的强大绑定C9或72c9FTD/ALS患者血液中可检测到H3K9me3和H3K27me3。来自两个重复扩增载体（C9orf72+）和两个携带正常等位基因（C9orm72-）的参与者的染色质免疫沉淀血液DNA的电泳表现。使用对总H3或三甲基化组蛋白H3K9和H3K27特异的抗体下拉DNA。下拉后，纯化结合DNA并用于PCR扩增C9或72启动子区。通过扩增水平评估C9orf72+血细胞中与三甲基化H3K9和H3K27的结合C9或72与C9orf72−相比，启动子区域更高

我们的实验提供了令人信服的证据C9或72致病性（GGGCC）重复载体中的基因是由突变的结合引起的C9或72组蛋白H3和H4中的三甲基赖氨酸残基。

讨论

在这项研究中，我们表明C9或72致病性脑组织和成纤维细胞的表达水平C9或72扩张载体与突变体结合增强有关C9或72组蛋白H3和H4中的三甲基赖氨酸残基。我们还证明，这些表观遗传变化在外周血中可以检测到，这一发现在更大的患者队列中得到证实时，可能代表c9FTD/ALS的疾病特异性生物标志物。

我们的数据表明C9或72mRNA表达是组蛋白甲基化异常后异染色质形成的结果。作为C9或72扩张主要以常染色体显性方式遗传，即杂合子C9或72扩增重复载体携带野生型转录活性等位基因（常染色质）和突变的转录沉默等位基因。野生型等位基因很可能无法产生足够的C9orf72蛋白来补偿突变等位基因的蛋白质损失，从而导致单倍体不足（图5). 由于组蛋白甲基化通常被认为是通过调节大量组蛋白修饰复合物诱导灵活的短期基因沉默，染色质结构的调节取决于染色质重塑酶的可用性，包括组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰化酶、，组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶。这种动态染色质结构可能会影响扩增的C9或72，其因此可能积聚为RNA焦点或转化为易于聚集的c9RAN蛋白。

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c9FTD/ALS表观遗传变化导致的拟议单倍体不足机制示意图

当我们的研究正在进行时，Rogaeva小组报告称，在所有接受测试的ALS病例中，约40%的病例上游CpG岛的DNA超甲基化[43]。尽管他们在研究的大约60%的ALS病例中没有发现超甲基化，但仍有可能在这些患者中另一个远离重复序列的CpG岛被甲基化。如甲基敏感限制性内切酶消化和测序（MRE-seq）CpG评分工具所示，重复序列本身中的几个CpG位点也可能甲基化(http://genome.ucsc.edu). 值得注意的是，在扩增载体中，重复区域中的CpG位点数量增加，从而形成一个新的CpG-岛，可以作为甲基化的靶点。未来的研究需要确定扩增重复序列以及附近的CpG岛是否甲基化，并估计ALS和FTD病例中异常DNA甲基化的频率。虽然DNA甲基化通常被认为触发组蛋白甲基化，但我们现在知道，DNA或组蛋白残基的甲基化可以首先出现，导致其他结构的异常甲基化[10]。如果DNA甲基化首先出现，它必须发生在症状出现之前；突变体结合增强C9或72在两个无症状重复携带者（28岁和30岁）和已经诊断为ALS或FTD的患者（在线资源中的临床信息，表3）中，三甲基组蛋白H3K9也同样存在。扩增的重复序列也可能导致不寻常的DNA结构，增加DNMT在重复序列本身内催化甲基成为胞嘧啶残基的能力。这种异常的DNA甲基化反过来可能触发组蛋白H3和H4的甲基化。无论哪种结构首先被甲基化，我们的研究结果都支持这样的观点，即所有被评估的c9FTD/ALS患者样本中组蛋白H3和H4残基的异常甲基化导致了C9或72mRNA。

扩展非编码（GGGCC）重复序列，位于两个选择性剪接的非编码5′外显子之间C9或72产生三种不同的转录变体（图1a） ●●●●。转录变体1（NM_145005.5）和3（NM_001256054.1）的重复序列位于内含子区域，被认为会导致RNA焦点的形成和RNA结合蛋白的隔离，而变体2（NM_018325.3）的表达，重复序列位于启动子区域，已证明在致病性重复携带者中沉默[16，29]。其他人报告三种已知转录变体的表达减少[22]。鉴于重复位置的这种差异，并考虑到表观遗传变化的参与，每个变体的转录水平可能不会因甲基化而统一改变，从而导致不同的病程和/或生物学结果。这种甲基化变异先前已被证明强烈影响脆性X和Rett综合征的表型[8，40]。未来的研究需要评估甲基化变异是否同样影响ALS和FTD表型。

我们的研究结果提出了有关成年中期发病的重要问题，因为组蛋白H3和H4的甲基化模式随年龄变化，根据组蛋白残基的不同而增减[11]。有趣的是，三甲基化组蛋白残基被突变体异常结合C9或72也已知以年龄依赖的方式甲基化。具体而言，残基H3K9的甲基化随着年龄的增长而降低，残基H1K27、H3K79和H4K20的甲基化增加[17，38，42]。此外，众所周知，随着时间的推移，活性氧物种的积累导致分子氧化应激指数增加，这是一种与ALS广泛相关的事件[12]这被认为会导致与衰老相关的体内平衡机制逐渐下降[5，39]。也有人认为，老化引起的表观遗传机制可能在氧化应激的存在中发挥重要的生理病理作用[11]。已知氧化应激会改变组蛋白残基中乙酰化/去乙酰化和甲基化/去甲基化过程之间的平衡，从而解除促炎基因的表达调控。因此，组蛋白甲基化异常是C9或72重复扩张、氧化应激积累导致表观遗传失调以及与年龄相关的正常表观遗传机制变异都可能导致成人发病以及ALS患者的神经炎症[44]。由于c9FTD/ALS组蛋白相关甲基化可通过患者血液轻松检测，因此评估异常组蛋白甲基化是否会在疾病过程中发生变化将是一个有趣的问题。

我们的结果表明，c9FTD/ALS现在可以被视为以染色质修饰为标志的重复性疾病，如强直性肌营养不良、SCA 8型和31型、Friedreich共济失调、脆性X和脆性X相关震颤/共济失调综合征[6]。神经元中适当的染色质构象对于防止DNA损伤、确保DNA的正确包装和保持正常的基因表达至关重要。与强直性肌营养不良和SCA8类似，三种不同的致病过程似乎与c9FTD/ALS的发病机制有关。第一，C9或72重复扩增导致RNA焦点的形成，它有可能隔离RNA结合蛋白并损害其功能[16，29]。其次，我们和其他人最近报告说C9或72重复扩增导致RAN翻译，从而产生聚甘氨酸-丙氨酸、聚甘氨酸/精氨酸和聚甘氨酸–脯氨酸肽，这些肽作为不溶性聚集体积聚在神经元细胞质中[2，30]，进一步支持c9FTD/ALS中RNA介导的毒性机制。第三，我们当前的研究表明突变体的结合C9或72组蛋白H3和H4中的三甲基赖氨酸残基会抑制C9或72基因，这一事件可能在c9FTD/ALS的发展中起重要作用。综上所述，早期研究表明C9orf72功能丧失是一种疾病机制，它是通过神经毒性过程和表观遗传变化造成的，并证明更好地了解C9orf 72蛋白的功能对于确定治疗靶点和制定有效的治疗策略至关重要[21]。进一步研究DNA和组蛋白甲基化作为c9FTD/ALS发病机制的一部分，也可能有助于确定ALS和FTD的新治疗靶点。迫切需要开展此类工作：尽管在阐明FTD和ALS的分子机制方面做出了巨大努力，但患者的预后并未改善，也没有开发出有效的治疗方法。发现C9或72单倍体不足有助于疾病的发病机制，表观遗传过程介导了这种效应，为治疗发展提供了独特的机会，为c9FTD/ALS患者带来了新的希望。

电子辅助材料

以下是电子补充材料的链接。

致谢

我们感谢参与本研究的患者，并感谢Jeannette N.Stankowski、Yong-Jie Zhang、Karen R.Jansen-West、Jennifer M.Gass、Kristin Staggs-Douberly、Pamela Desaro、Amelia Johnston、Marka M.Van Blitterswijk、Patricia H.Brown、Melissa E.Murray、Kevin F.Bieniek、Amanda M.Liesinger、，和梅奥诊所的琳达·G·卢梭。这项工作得到了梅奥诊所基金会、美国国立卫生研究院/美国国家老龄研究院[R01AG026251（LP）]、美国国立健康研究院/国家神经疾病和中风研究所[R01 NS 063964-01（LP）、R01 NS077402（LP）】、美国国家环境卫生服务研究所[ES20395-01（LP]的支持，肌萎缩性侧索硬化协会（LP）、加拿大卫生研究院（VVB）和Siragusa基金会（VVB）。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

脚注

V.V.Belzil和P.O.Bauer对这项工作做出了同等贡献。

工具书类

1Al-Mahdawi S、Pinto RM、Ismail O、Varshney D、Lymperi S、Sandi C等。Friedreich共济失调GAA重复扩增突变在人类和转基因小鼠脑组织和心脏组织中诱导了类似的表观遗传变化。人类分子遗传学。2008;17(5):735–746. doi:10.1093/hmg/ddm346。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
2Ash PE、Bieniek KF、Gendron TF、Caulfield T、Lin WL、Dejesus-Hernandez M等。C9ORF72 GGGCC膨胀的非常规翻译产生c9FTD/ALS特有的不溶性多肽。神经元。2013;77（4） ：639–646。doi:10.1016/j.neuron.2013.02.004。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
三。Barski A、Cuddapah S、Cui K、Roh TY、Schones DE、Wang Z等。人类基因组组蛋白甲基化的高分辨率分析。单元格。2007;129(4):823–837. doi:10.1016/j.cell.2007.05.009。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
4Bauer PO、Zumrova A、Matoska V、Mitsui K、Goetz P。在SCA2患者中，等位基因特异性从头开始DNA甲基化能否下调ataxin-2？医学假说。2004;63(6):1018–1023. doi:10.1016/j.mehy.2004.03.046。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
5Beckman KB，Ames BN。衰老的自由基理论成熟了。生理学评论。1998;78(2):547–581.[公共医学][谷歌学者]
6Belzil VV、Gendron TF、Petrucelli L.RNA介导的神经退行性疾病毒性。分子细胞神经科学。2012;56摄氏度:406–419. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7布拉德利工作组。临床实践中的神经病学。3.波士顿：巴特沃斯·海尼曼；2000[谷歌学者]
8Braunschweig D、Simcox T、Samaco RC、LaSalle JM。X染色体失活率影响镶嵌Rett综合征和MeCP2小鼠脑内野生型MeCP2的表达。人类分子遗传学。2004;13(12):1275–1286. doi:10.1093/hmg/ddh142。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
9Caiafa P，Zampieri M.DNA甲基化和染色质结构：令人困惑的CpG岛。细胞生物化学杂志。2005;94(2):257–265. doi:10.1002/jcb.20325。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
10Cedar H，Bergman Y。DNA甲基化和组蛋白修饰的联系：模式和范式。Nat Rev基因。2009;10(5):295–304. doi:10.1038/nrg2540。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
11Cencioni C、Spallotta F、Martelli F、Valente S、Mai A、Zeiher AM等。衰老和年龄相关疾病中的氧化应激和表观遗传调控。国际分子科学杂志。2013;14(9):17643–17663. doi:10.3390/ijms140917643。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
12Chen S，Sayana P，Zhang X，Le W.肌萎缩侧索硬化的遗传学：最新进展。摩尔神经变性剂。2013;8(1):28. doi:10.1186/1750-1326-8-28。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
13Chestnut BA、Chang Q、Price A、Lesuise C、Wong M、Martin LJ。通过DNA甲基化对运动神经元细胞死亡的表观遗传调控。神经科学杂志。2011;31(46):16619–16636. doi:10.1523/JNEUROSCI.1639-11.2011。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
14Ciura S、Lattante S、Le Ber I、Latouche M、Tostivent H、Brice A等。C9orf72功能丧失导致肌萎缩侧索硬化斑马鱼模型的运动障碍。Ann Neurol公司。2013[公共医学][谷歌学者]
15Cong SY、Pepers BA、Zhou TT、Kerkdijk H、Roos RA、van Ommen GJ等。多聚谷氨酰胺重复序列扩增的亨廷顿蛋白影响Jab1-p27（Kip1）通路。神经生物学疾病。2012;46(3):673–681. doi:10.1016/j.nbd.2012.03.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
16DeJesus-Hernandez M、Mackenzie IR、Boeve BF、Boxer AL、Baker M、Rutherford NJ等。C9ORF72非编码区的扩增GGGCC六核苷酸重复导致染色体9p-linked FTD和ALS。神经元。2011;72（2） ：245–256。doi:10.1016/j.neuron.2011.09.011。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
17Fraga MF，Esteller M.表观遗传学与衰老：目标和标记。趋势Genet。2007;23(8):413–418. doi:10.1016/j.tig.2007.05.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
18Galinberti D、D'Addario C、Dell’oso B、Fenoglio C、Marcone A、Cerami C等。散发性额颞叶退行性变患者中，前列腺素基因（GRN）启动子甲基化增加。神经科学。2013;34(6):899–903. doi:10.1007/s10072-012-1151-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
19Galinberti D，Scarpini E.阿尔茨海默病和额颞叶变性的遗传学和生物学。国际临床实验医学杂志。2010;三(2):129–143. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Gardiner-Garden M，Frommer M.脊椎动物基因组中的CpG岛。分子生物学杂志。1987;196(2):261–282. doi:10.1016/0022-2836（87）90689-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
21Gendron TF，Cosio DM，Petrucelli L.c9RAN翻译：治疗肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的潜在治疗靶点。专家操作目标。2013;17(9):991–995. doi:10.1517/14728222.2013.818659。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
22Gijselinck I、Van Langenhove T、Van der Zee J、Sleegers K、Philtjens S、Kleinberger G等。在患有额颞叶退化性肌萎缩性侧索硬化症谱系障碍的佛兰德斯-比利时队列中的C9orf72启动子重复扩增：一项基因鉴定研究。《柳叶刀神经》。2012;11(1):54–65. doi:10.1016/S1474-4422（11）70261-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
23Giordana MT、Ferrero P、Grifoni S、Pellerino A、Naldi A、Montuschi A。肌萎缩侧索硬化症中的痴呆和认知障碍：综述。神经科学。2011;32(1):9–16. doi:10.1007/s10072-010-0439-6。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
24格拉夫·拉德福德NR，伍德拉夫BK。额颞叶痴呆。Semin Neurol公司。2007;27(1):48–57. doi:10.1055/s-2006-956755。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
25Hindson CM、Chevillet JR、Briggs HA、Gallichotte EN、Ruf IK、Hindson BJ等。液滴数字PCR与模拟实时PCR的绝对定量。自然方法。2013;10（10） ：1003–1005。doi:10.1038/nmeth.2633。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
26Johnston CA、Stanton BR、Turner MR、Gray R、Blunt AH、Butt D等，《城市环境中的肌萎缩性侧索硬化：伦敦市中心的人口研究》。神经学杂志。2006;253(12):1642–1643. doi:10.1007/s00415-006-0195-y。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
27Laffita-Mesa JM、Bauer PO、Kouri V、Pena Serrano L、Roskams J、Almaguer Gotay D等。核心ataxin-2基因启动子中的表观遗传学DNA甲基化：新的生理和病理意义。人类遗传学。2012;131(4):625–638. doi:10.1007/s00439-011-1101-y。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
28Lomen-Hoerth C、Anderson T、Miller B。肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的重叠。神经病学。2002;59(7):1077–1079. doi:10.1212/WNL.59.7.1077。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
29Mori K、Lammich S、Mackenzie IR、Forne I、Zilow S、Kretzschmar H等。hnRNP A3与GGGCC重复序列结合，是C9orf72突变患者海马p62阳性/TDP43阴性内含物的组成部分。神经病理学学报。2013;125(3):413–423. doi:10.1007/s00401-013-1088-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
30Mori K、Weng SM、Arzberger T、May S、Rentzsch K、Kremmer E等。C9orf72 GGGGCC重复序列被翻译成FTLD/ALS中的聚集二肽-重复蛋白。科学。2013;339(6125):1335–1338. doi:10.1126/science.1232927。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
31Murgo AJ。DNA甲基化抑制剂作为表观遗传重塑药物的临床开发创新方法。塞明·昂科尔。2005;32(5):458–464. doi:10.1053/j.seminoncl.2005.07.004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
32Nasrallah议员、Cho G、Simonet JC、Putt ME、Kitamura K、Golden JA。Arx中多胺道扩张对神经发育和基因表达的差异影响。人类分子遗传学。2012;21(5):1090–1098. doi:10.1093/hmg/ddr538。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
33Oki Y，Issa JP。综述：表观遗传治疗的最新临床试验。最新临床试验综述。2006;1(2):169–182. doi:10.174/157488706776876490。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
34Prell T，Grosskreutz J（2013）小脑在肌萎缩侧索硬化症中的参与。肌萎缩侧索前颞部除颤器（印刷前Epub）[公共医学]
35Renoux AJ，Todd PK.RNA途径的神经变性。神经生物学进展。2012;97(2):173–189. doi:10.1016/j.pneurobio.2011.10.006。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
36Renton AE、Majounie E、Waite A、Simon-Sanchez J、Rollinson S、Gibbs JR等。C9ORF72中的六核苷酸重复扩增是染色体9p21-连锁ALS-FTD的原因。神经元。2011;72(2):257–268. doi:10.1016/j.neuron.2011.09.010。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
37Santoro MR、Bray SM、Warren ST。脆性X综合征的分子机制：一个二十年的展望。《病理学年鉴》。2012;7：219–245。doi:10.1146/annurev-pathol-011811-132457。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
38Sarg B、Koutzamani E、Helliger W、Rundquist I、Lindner HH。哺乳动物组织中组蛋白H4在赖氨酸20处的合成后三甲基化与衰老有关。生物化学杂志。2002;277(42):39195–39201. doi:10.1074/jbc。M205166200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
39斯塔特曼ER。蛋白质氧化和老化。科学。1992年；257(5074):1220–1224. doi:10.1126/science.1355616。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
40Stoger R，Kajimura TM，Brown WT，Laird CD。脆性X基因FMR1的DNA甲基化模式说明的表观遗传变异。人类分子遗传学。1997;6(11):1791–1801. doi:10.1093/hmg/6.11.1791。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
41Todd PK、Oh SY、Krans A、Pandey UB、Di Prospero NA、Min KT等。组蛋白脱乙酰酶通过转录沉默在脆性X震颤共济失调综合征模型中抑制CGG重复诱导的神经变性。公共科学图书馆-遗传学。2010;6（12） ：e1001240。doi:10.1371/journal.pgen.1001240。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
42Wang CM，Tsai SN，Yew TW，Kwan YW，Ngai SM。衰老加速易感小鼠脑内组蛋白甲基化多重模式的鉴定8。生物老年学。2010;11(1):87–102. doi:10.1007/s10522-009-9231-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
43Xi Z，Zinman L，Moreno D，Schymick J，Liang Y，Sato C等人（2013）ALS中GC重复序列附近CpG岛的超甲基化，C9orf72扩增。Am J Hum Genet（出版前的Epub）[PMC免费文章][公共医学]
44赵伟，Beers DR，Appel SH.肌萎缩侧索硬化症发病过程中的免疫介导机制。神经免疫药理学杂志。2013;8(4):888–899. doi:10.1007/s11481-013-9489-x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自神经病理学学报由以下人员提供施普林格