利用PAR-CLIP鉴定RNA-蛋白质相互作用网络

摘要

简介

RNA-结合蛋白（RBP）和核糖核蛋白复合物（RNP）识别成熟编码和非编码RNA及其前体中的一级序列和/或二级结构元素。许多RBP和RNP是构成过程所必需的，例如前mRNA剪接、切割和多聚腺苷化。然而，RNA靶点丰度的变化和这些RNA相互作用因子也会影响特定基因的表达。此外，细胞型特异性RBP和非编码RNA以更直接的方式调节遗传信息的流动，例如通过调节mRNA的稳定性或翻译。转录后基因调控（PTGR）的重要性因RBP、RNP成分和/或其mRNA靶点的基因改变而引起的广泛疾病而得到强调。¹

根据Pfam中描述的已知RNA-结合域（RBD）的存在，人类基因组至少编码600个RBP²数据库(^图1和^表1)另有1400个核酸结合蛋白具有锌指结构域、解旋酶结构域或核酸酶结构域，其中许多蛋白质的特征尚不明确，并且缺乏关于它们是否靶向DNA、RNA或两者的信息。尽管人类基因组中编码的RBP数量众多，但对绝大多数RBP的靶点和功能尚不清楚。RBD代表进化保守的肽域，可识别其目标RNA中嵌入的特定序列或结构元素，称为RNA识别元素（RRE）。大约有75个带注释的RBD，那些已被分子表征的RBD大多以序列和/或结构特异的方式结合短的4-6 nt片段。^三大多数RBP（65%）只包含一个RBD，而较小的比例（35%）通常包含RNA识别基序（RRM）、hnRNP K同源性（KH）、dsrm、zf-CCHC、Piwi、Argonaut和Zwille（PAZ）以及Piwi域，这些RBD、其他RBD和/或RNA处理域的额外重复。鉴于大多数RBD识别短且经常退化的RNA序列，使用多种类型的结合域应能提高目标识别的特异性。

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图1

RNA结合蛋白（RBP）及其RNA-结合域（RBD）。（a） 显示了约400种人类蛋白质中最常见的RBD。域名符合Pfam命名法。⁴包含一种以上RBD的RBP将被多次计数。（b） 进一步解决了RBP的域组成问题。顶部面板显示RBP中相同RBD的单一与重复出现。中间面板解析RBP中RBD的组合，底部面板显示有多少RBP与另一个酶活性蛋白质域（如核酸酶、解旋酶或蛋白质-蛋白质相互作用域）组合，其中至少有一个RBD成员。底部面板中排除了无辅助RBD的核糖核酸酶和解旋酶。

组装到RNP中的非编码RNA可能发挥多种作用。它们可以作为招募RBP的支架，进一步招募辅助蛋白以形成成熟或功能性RNP，也可以在靶RNA的加工中作为催化剂。最后，非编码RNA或其片段可以作为识别目标RNA中互补序列的指南。将具有不同引导序列的非编码RNA组装成具有相似或相同蛋白质组成的RNP的能力提供了进化优势，并在与mRNA成熟或调节相关的几个过程中得到利用。

许多RBP的RRE尚未确定，单靠计算方法还不足以预测给定RBP识别的RNA片段的主要序列或结构。比较基因组方法可有效预测UTR中的短保守序列模体，其中约一半对应于miRNA-结合位点，但识别其余模体的RBP尚未确定。²⁴此外，旨在表征RRE和RBD之间序列特异性接触的生化研究可能会因RBP对RNA具有一般静电亲和力而变得复杂，其中核心RRE两侧的核苷酸残基可能有助于结合。因此，用于剖析RNA-RBP和RNA-RNP相互作用的系统生物学方法需要敏感的方法来识别天然RNA靶位点，最终以细胞类型特定的方式捕获完整的相互作用网络。在强大的测序技术的发展推动下，这一目标已经取得了相当大的进展，这些测序技术适用于表征由特定RBP和RNP结合的RNA片段。综述了实现这一宏伟目标的方法，然后讨论了如何将这些相互作用转化为基因表达的功能结果。

无交叉的RRE和RBP天然靶点的分子和生物化学识别方法

在首次发现RBP及其相关RNA后，使用计算和生物化学方法识别RBD和RRE。通过对多个靶点和/或进化相关靶点的序列分析，预测了对RBP结合至关重要的RNA一级和二级结构元素。随后，通过电泳迁移率变化分析或RBP与靶RNA的紫外线（UV）交联等生化方法，对包含基序和一些侧翼序列的RNA片段以及基序的突变体进行分析。一些研究人员执行了在体外从随机RNA序列库中分离高亲和力RNA配体（适配体）的进化实验（也称为SELEX）。²⁵对一些RBP进行了RNA适配体鉴定，其中包括RRM域蛋白ELAVL2、，²⁶KH域蛋白震颤（QKI），²⁷和Nova。²⁸据推测，RBP对RNA的固有亲和力有助于恢复组成其天然RRE的RNA配体。与使用天然靶RNA发现RRE类似，适配体定义的RRE是通过对独立选择的序列进行比较分析得出的。随后，根据编码RBP的物种转录组中发现的RRE的存在，预测自然靶点。还提出了一种适用于恢复低复杂度RRE的基于阵列的方法，其中RRE是通过序列富集从RBP–RNA共免疫沉淀中约200000个不同的29–38 nt RNA库中获得的。²⁹

为了直接识别内源性靶点，建立了各种RBP免疫沉淀（IP）方法。它们的不同之处在于捕获和分析RBP或RNP相关RNA的方式。IP和RNA分离协议要么旨在恢复全长RNA靶点，如mRNA，要么旨在恢复受RBP/RNP约束和保护的部分RNase-digsized片段。随后，通过阵列杂交分析、定量逆转录（RT）聚合酶链反应（PCR）或转换到cDNA文库进行直接测序来检测结合RNA。以下列出了各种方法^表2调整细胞裂解和IP的实验条件以不破坏RNA–RBP/RNP相互作用的稳定性至关重要，例如避免高盐缓冲液或超声波作用。^30,31真实靶点与背景RNA的分离需要实验控制，例如模拟IP，以确定IP与对照中RNA靶点的富集。随着深测序技术的引入，通过对共免疫沉淀RNA制备的cDNA文库进行测序，现在可以全面识别RBP靶点。³²进行源自短RNA片段的大规模基因组或转录组比对，并且与基于阵列的cDNA分析相比具有更大的重要性，因为它还促进了从头开始发现转录本、编辑和选择性剪接事件。

RNA-蛋白质交叉鉴定RBP的RRE和天然靶点

交联和免疫沉淀（CLIP）协议具有相同的基本轮廓(图2). RNA最好与相互作用的蛋白质共价交联体内以及在细胞裂解之前，以消除相互作用伙伴在裂解后重新结合的任何可能性。³¹用核糖核酸酶处理细胞裂解物，通过将mRNP分裂成小RNA-蛋白质亚复合物来增加IP的产量，并缩短RNA长度，理想情况下简化RRE鉴定。IP期间交联RBP的固定化为各种生化操作提供了机会，包括RBP相关RNA的放射标记。在非变性条件下或不完全RNase处理下回收RBP可导致直接或间接相互作用的与各自靶点交联的额外RBP的铜提纯。因此，使用蛋白质变性十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶进一步分离回收的络合物。25-nt大小范围内的共价连接RNA预计将使RBP的分子质量改变约8kDa，这表示当使用大于50kDa的RBP时，总质量发生微小变化。SDS凝胶还可以分离非共价连接的RNA片段，因为它们的迁移速度比交联的RBP–RNA复合物更快。与预期分子量的蛋白质交联的RNA在蛋白酶K处理后恢复，在交联核苷酸处留下共价结合氨基酸或寡肽。制备cDNA文库，然后进行深度测序。最后，序列读取与基因组和/或转录组对齐。选择重叠序列读取簇，以进一步确定RRE，并获得基因靶标内精确结合位点的列表。

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图2

光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）及其他CLIP方法概述。（a） 高通量测序CLIP（HiTS CLIP，左图）、单个核苷酸解析CLIP（iCLIP，中图）和单个核苷酸解析交联亲和纯化（iCLAP，右图）利用254nm的短波紫外线（UV-254）将RNA交联到相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）在活细胞或新鲜组织中溶解。（b） PAR-CLIP首先将可光活化的硫代核糖核苷并入新生转录物中，然后使用长波长波UV-365进行交联。RNA-RBP复合物的分离可以通过免疫沉淀（IP）（PAR-CLIP、HiTS-CLIP和iCLIP）或链霉亲和素/IMAC双亲和纯化（iCLAP）实现。与iCLAP类似，cDNA的交联和分析（CRAC）⁵⁶该方法（未显示）利用RBP的双亲和富集，其中在变性条件下进行第二次纯化。3′和5′适配器的添加因CLIP方法而异。iCLIP和iCLAP方法使ssDNA中间体环化，以在交联位点捕获由过早终止的逆转录（RT）产物产生的序列。在PAR-CLIP中，通过硫代核糖核苷交联RNA进行RT，然后进行聚合链反应（PCR）扩增，导致特征突变[T到C（当使用4-硫代尿苷（4SU）时）和G到a（当使用6-硫代鸟苷（6SG）时]。对这些突变进行评分会导致交联阅读簇与来源于非交联背景序列（包括丰富的细胞RNA）的簇的分化。

CLIP方法因使用天然核苷酸和非天然核苷酸而不同，每种核苷酸具有不同的最佳交联UV波长。此外，在特定核糖核酸酶的选择和滴定、交联RBP–RNA复合物的回收方法、cDNA文库的构建以及计算数据分析方面也存在差异。

UV-254夹具协议

将裂解物、培养细胞或组织中的核酸暴露于254 nm（UV-254）的短波紫外线下，会产生分子内和分子间核酸和核酸-蛋白质交联。⁶¹该方案的一个早期版本被开发用于表征已知蛋白质和RNA组成的大量剪接体RNP中的RNA–蛋白质相互作用位点。⁶²在这些研究中，通过IP回收交联的RNA-蛋白质复合物，分离RNA，并通过RT/引物延伸进行分析。交联位点绘图在体外之所以有可能，是因为逆转录酶在交联位点停滞。

为了鉴定mRNA特异性RBPs的内源性靶位点，UV-254交联的RNA可以转化为cDNA文库并测序(^表2和图2（a）).³⁶有效的cDNA合成需要将适配器序列连接到分离的RNA上，以便进行RT-PCR和测序。RNA和RBP之间的交联可以在IP后进行额外的纯化步骤，例如变性SDS凝胶粒度分级和硝化纤维素膜转移，以分离非交联背景RNA。作为抗体的替代方法，六组氨酸标记RBP用于细胞培养实验，使研究人员能够在变性条件下使用金属相关基质纯化RBP–RNA复合物^53,54,56(图2（a），右侧面板）。总的来说，这些纯化步骤丰富了交联RNA，但由于交联RNA群体很难逆转录，剩余的非交联RNA（背景RNA）混淆了分析，因为这些RNA可以高效逆转录，因此可能被过度表达。当逆转录酶在交联位点停滞时，它很少读取光加合物产生的损伤，从而在cDNA中引入特征性突变和/或缺失。因此，cDNA序列读取的比对可以识别富集突变的读取簇。最近的两份出版物报告了源于UV-254交联位点的序列读取中单核苷酸缺失的频率增加，这些错误的定位为交联结合位点的富集提供了重要证据。^63,64然后，可以使用聚集序列读取中这些缺失的位置信息来识别潜在的RRE，从而深入了解RBP–RRE分子相互作用。UV-254交联cDNA文库的序列分析表明，缺失位点几乎完全对应于尿苷，这表明不是所有四个核苷酸都能参与UV-254-交联，或者逆转录酶不能读取过去或不能诱导鸟嘌呤、胞苷、，和腺苷光加合物。总之，RT是产生与某些CLIP方法中的交联证据相对应的突变或缺失的关键步骤。还有几个重要问题有待回答。在cDNA制备过程中，与不同类型的光加合物损伤的过早终止相比，读取事件的比例是多少？在结构明确的光加合物损伤中观察到的cDNA变化频谱是什么？

通常建议使用旨在评估背景RNA信号的实验控制，如无紫外线照射、模拟IP实验或使用RBP敲除细胞的细胞裂解物，但信息量可能不如预期。在这些情况下，可以通过实验进行的背景RNA数量通常不足以复制生成cDNA文库，从而导致背景缺失或失真。因此，评估背景的另一种方法可能是对丰度和亚细胞定位相似但靶RNA特异性不同的无关RBP进行平行CLIP实验。这样的实验将有助于去除源自紫外线损伤的RNA的信号，⁶⁵分子内RNA交联、被解释为交联事件的单核苷酸多态性以及核糖核酸酶消化产生的短片段RNA背景。

iCLIP方法(图2（a），中间面板）⁵³是为了利用交联位点频繁发生的逆转录酶终止事件而开发的。它依赖于单个适配器的连接，该适配器在交联RNA的3′端提供RT引物结合位点。使用与衔接子互补的引物通过RT合成第一链cDNA，衔接子还包含用于Solexa测序的限制性位点、条形码序列和5′引物结合位点。然后将停滞的cDNA片段循环，定位cDNA片段上游的5′引物结合位点。在第二链生成后，将得到的dsDNA线性化，PCR扩增，并进行深度测序。紧邻序列5′末端读取簇上游的核苷酸位置被认为与最初暂停逆转录酶的交联位点相对应。然而，如果没有一种方法来测量背景中来自交联位点的读取的富集程度，则很难评估与交联与非交联RNA序列相对应的读取比例。

PAR-CLIP协议

光活化核苷在RNA-蛋白质交联中的应用

作为用短波紫外光交联天然核酸的替代品，用可光活化的核苷类似物修饰RNA可以提高核酸交联的效率。最具特征的光活化核糖核苷类似物(图3（a）)是卤化嘧啶，例如5-碘尿嘧啶和5-碘胞嘧啶，⁶⁶以及含有硫酮的核糖核苷，如4-硫尿苷（4SU）和6-硫鸟苷。⁶⁷可光活化的核糖核苷用长波紫外线（>310 nm）激发，天然核苷酸不再交联，并产生不同结构的光加合物(图3（b）)这取决于它们的反应机理，包括作为中间体的短寿命自由基或无反应中间体的直接光加成。蛋白质内的氨基酸侧链对不同的核苷类似物表现出不同的反应性，反应主要涉及芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，但也涉及赖氨酸和半胱氨酸。⁶⁶

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图3

光活化核糖核苷类似物。（a） 卤化和含硫核苷类似物已被用于光交联，以探测RNA–RNA以及RNA–蛋白质相互作用。（b） 预测核糖核苷类似物在紫外线（UV）365交联到芳香氨基酸侧链时的结构。显示了与酪氨酸交联后的结构。（c） 4-硫代尿苷（4SU）并入细胞RNA的比率分析。总RNA（0.2 OD₂₆₀用蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶消化HEK293细胞，并用反相高效液相色谱（HPLC）分析。C、U、G和A对应的峰在280 nm处检测到，而4SU对应的峰则在330 nm处进行检测。根据U和4SU的吸收系数计算出4%4SU掺入率。其他细胞系的4SU替代率也为1-4%。5BrU，5-溴尿嘧啶；5IU，5-碘脲；5IC，5-碘胞苷；6SG，6-硫代鸟苷。

最初，可光活化核苷通过在体外通过DNA模板或化学合成进行转录，并用于探测RNA–RNA和RNA–蛋白质相互作用。^68–71RNP由细胞提取物或与重组蛋白和修饰RNA进行生化重组。在长波长紫外线照射后，通过监测引物延伸分析中逆转录酶停滞导致的过早终止的cDNA产物的积累来检测RNA内的交联位点。通过转染修饰的RNA，然后交联和鉴定交联蛋白伙伴，在活细胞中完成RNP的重建。⁷²

一些可光活化的核苷通过将其提供在组织培养基中供吸收而易于生物利用。^73,744SU通过平衡核苷转运体（ENT1和SLC29A1）的至少一个成员导入后生动物细胞。⁷⁵据推测，6SG被相同或相关机制占用。RNA的4SU标记也可以在哺乳动物细胞中以及使用转基因动物的组织和发育阶段特异性方式中通过有条件表达弓形虫尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）和喂养4-氟尿嘧啶来实现。^76–78UPRT对尿嘧啶类似物和5-磷酸核糖基-1-R-二磷酸转化为尿苷类似物一磷酸进行催化。硫核苷随机并入新生RNA中，取代相应天然核苷的一部分。修饰核苷的掺入率取决于各种因素，包括核苷的特性、核苷浓度、孵育时间和细胞类型。因此，在给定的实验条件下，应通过回收RNA和量化核苷酸组成来确定改良的核苷掺入率(图3（c）). 理想情况下，掺入比例被调整以实现每个相互作用RNA片段的一个交联，但生物利用度和毒性受到限制。在培养的人类细胞中，相对于尿苷，4SU的掺入率高达4%（即每25 Us有1个替代物），而基因表达或毒性没有明显变化。^59,784SU在小鼠等全动物模型中的直接应用尚未得到彻底测试。我们怀疑，在所选组织中实现4SU掺入必须平衡最佳给药与毒性。因此，光活化核苷的使用仍然是细胞培养的一种可行方法。规避这一限制的一种方法是使用与感兴趣的转录组接近或匹配的培养的原代细胞或细胞系。

光活化核糖核苷增强型CLIP（PAR-CLIP）⁵⁹利用光活化核糖核苷类似物在活体细胞中随机转录全掺入新合成的RNA，并随后交联到相互作用的蛋白质。PAR-CLIP的当前版本使用4SU和6SG(图4（a）). 光交联效率取决于核糖核苷类似物、RRE及其侧翼序列的序列组成以及蛋白质表面的氨基酸组成。通常，在相同能量剂量下，修饰RNA的交联效率超过UV-254交联效率。^59,63然而，只有少数蛋白质进行了比较分析。IGF2BP1的PAR-CLIP的4SU取代率在2%到4%之间，产生的交联RNA比无4SU的UV-254辐射细胞多几百倍。⁵⁹在类似条件下，另一项研究报告称，AGO2的交联效果更好，而ELAVL1（HuR）的交联效率与UV-254方法相似。⁶³根据在SDS变性蛋白凝胶上解析交联和IPed RBP时获得的放射性RNA信号强度，估计交联效率。然而，最终需要测定UV-254或−365交联RNA的反转录全长cDNA的产量，以便更好地判断哪种交联方法在结合位点测定方面更有效。

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图4

硫核糖核苷的光活化交联。（a） 表达FLAG/血凝素（HA）标记的IGF2BP2的HEK293细胞的光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP），该IGF2BP1包含4个RRM和2个K同源性（KH）RNA-结合域（RBD）。顶部面板显示了与IGF2BP2交联并通过蛋白变性十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶电泳在免疫沉淀（IP）后解析的放射性标记RNA的自射线照片。表位标记的IGF2BP2的预期分子量约为75kDa。底部面板显示了一个抗HA免疫印迹（IB），以控制SDS凝胶上标记的IGF2BP2蛋白的量。（b） 顶部面板：尿苷和芳香侧链氨基酸（Tyr、Phe和Trp）的紫外线（UV）254交联产物。逆转录酶通常在交联加合物处停滞，但偶尔会跳过损伤，导致对应于交联位置的cDNA内缺失。下图显示4-硫尿苷（4SU）与芳香侧链氨基酸的UV-365交联产物。4SU交联产物的结构不同于UV-254交联光加合物。逆转录酶也会在损伤处停滞，但当它通读时，最好在光加合物的正对面结合dG，从而导致定义4SU交联位点的特征性T到C转变。

计算分析

CLIP程序生成的cDNA文库的Solexa测序目前产生了超过20 Mio的序列读取，并描述了用于数据分析的几个生物信息管道。^79,80序列读取按照基因组比对和注释mRNAs、rRNAs和tRNAs等的参考数据库进行分类。序列读取映射必须考虑至少一个错误（替换、插入或删除），以捕获交联RNA产生的读取，并计算交联诱导的突变比率（T到C和G到A）。允许多个错误可以增加映射序列的百分比，但也可以增加将序列读取分配给多个基因组位置的发生率，其中只有一个位置代表其起源。长度大于20 nt的序列读取更可取，以最小化到多个位置的映射。将序列与转录组和基因组参考序列对齐，可以注释内含子、外显子、外显子-内含子和外显子-外显子序列，其比值可以提供对RBP潜在作用和亚细胞定位的见解。使用mRBP的PAR-CLIP实验通常会产生数千到数十万个代表RBP结合位点的重叠序列读取簇(图5).

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图5

光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）重叠序列读取簇和相应的RNA识别元件（RRE）的示例。从RNA结合蛋白（RBP）PUM2、QKI和IGF2BP家族成员的PAR-CLIP获得的重叠序列读取簇。读数与所示基因转录本的参考序列对齐；只显示最频繁的读取。序列读取拷贝数和与参考序列不匹配的数量显示在右侧；它们都代表T到C的突变（用红色字母表示）。蓝色方框表示RRE的位置，如Phylo-Gibbs基序分析所定义（右侧面板）。

非交联RNA背景中偶尔出现的单核苷酸T至C（或G至A）多态性可能被误解为交联位点，应谨慎考虑二倍体细胞系中单个位点突变频率精确为50%或100%的读数簇。对相应细胞系或组织的转录组进行RNAseq分析有助于识别这些多态性变异并掩盖这些簇。将RNAseq转录物丰度与交联位点的读取数相关联，也可以测量RBP与其靶位点的亲和力，还可以确定饱和发现RNA-结合位点所需的转录物丰富度水平。⁵⁸

为了便于通过模体发现程序发现潜在的RRE，对簇进行排序并仅使用数百个顶级簇可能很有用。PAR-CLIP簇可以根据显示交联后特征序列变化的不同位置的数量、具有交联诱导突变频率的读取分数以及定义簇的读取总数进行排序。当多个结合位点发生在附近时，相应的序列读取将重叠并生成大簇。这些簇可以通过交联峰发现方法分解为单个结合位点。完成这项任务的一个软件工具是由Öhler及其同事开发的PARalyzer(http://www.genome.duke.edu/labs/ohler/research/PARalyzer/). 该程序首次用于分离在3′UTR富含AU区域和ELAVL1结合的内含子序列中发现的短寡核苷酸丰富的RRE。⁵⁷这种方法对于研究包含多个RBD和/或重复相同域的RBP也很有用(图1（b）).

有几种算法可以搜索常见的序列模体，其中包括（Phylo）Gibbs、MEME、MDScan、Consensus、Weeder、cERMIT或Gimsan。^81–88许多RBP包含的RBD通常识别短期RRE，例如，KH中的4 nt，RRM中的4-5 nt。^三例如，含有3个KH结构域的NOVA蛋白质识别退化的HYCAY（其中H表示A、C或U，Y表示C或U），²⁸具有4个KH和2个RRM结构域的IGF2BP识别CAUH，而具有单个KH结构域的QKI与包含AYUAAY的序列结合⁵⁹(图5).

基于主序列的模式识别可能并不总是成功的，因为某些RBP，例如那些包含dsrm RBD的RBP，主要识别结构元素，而没有主序列保护。二次结构预测算法，如Mfold⁸⁹可以与序列突变对RBP-RNA相互作用的影响的分析结合使用。在表现出足够进化保守性的结合位点中，可以确定是否存在碱基-对共变⁹⁰可靠地预测交联序列中的RNA二级结构元素。

最终可能需要确认预测的RRE和侧翼序列对蛋白质结合的贡献。对于这些验证实验，需要重组蛋白，以便进行凝胶转移或类似的结合研究。使用与已识别RRE相对应的二核苷酸和三核苷酸重复序列进行分析，以及测试天然结合位点及其序列变体，将理想地证实PAR-CLIP的结果。

随着各种CLIP方法得到更广泛的应用，它们可能会识别出由单个RBP识别的更广泛的序列，自在体外已考虑具有最高亲和力的特征序列。CLIP方法深入捕捉RNA–蛋白质相互作用的事实体内改变了模体发现的相关性，从目标预测到RRE使用和占用的表征，RBD之间的亲和力差异，以及对PTGR的影响。

PAR-CLIP和UV-254 CLIP协议中的技术挑战和限制

优先考虑受限制性商业惯例约束的目标

CLIP或PAR-CLIP的应用经常识别出数千到数万个序列读取簇，这些序列读取簇被认为代表给定RBP的结合位点（参见表2). 解释RBP耗竭、过度表达或突变导致的特定表型的靶点排序是一个挑战，需要进行额外的分析。例如，通过使用mRNA微阵列（全基因组或外显子阵列）或RNAseq实验，当感兴趣的RBP过度表达或敲除时，交联位点与调控靶点的相关性已经证明了RBP在调节转录稳定性或选择性剪接中的作用。^59,91,92交联捕获稳定和短暂的RNA-RBP相互作用，并根据RBP的亲和力或占有率对靶点进行排序，这可能为识别最重要的生理靶点提供进一步的线索。RIP-芯片分析及其与CLIP目标站点的相关性可以提供此类排名。⁵⁷定量高通量蛋白质组学方法的日益可用，包括用细胞培养中的氨基酸（SILAC和pSILAC）进行（脉冲）稳定同位素标记，使RBP的翻译调控分析成为可能。⁵⁸HEK293细胞miRNA敲除的蛋白质组学分析结果⁹³显示与包含PAR-CLIP定义的miRNA-结合位点的靶点相关。⁵⁹基于测序的核糖体分析也可能为蛋白质组学方法和翻译调控评估提供一种替代方法。^94,95参与信使核糖核酸转运和定位的RBP的功能注释将需要开发或应用更特异的检测方法。

结论

随着CLIP技术的不断应用和RBP–RNA相互作用数量的增加，该领域的下一个挑战之一是这些相互作用的时空分辨率。图6显示了由RBP的核质分布组织的相互作用图的示例。此外，不同的细胞类型表达不同的转录子亚群以及RBP，不同细胞生长条件（压力、外部刺激等）可能导致RBP的翻译后修饰，例如已知的ELAVL1/HuR发生的修饰⁹⁶和FMR1。^97,98鉴于大量RBP经常以多成员基因家族的形式表达，对特定生物化学和调节功能的评估将是劳动密集型的，类似于研究多拷贝和/或顺反子组织miRNA的作用。⁹⁹

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图6

可光激活核糖核苷增强CDK1 mRNA的交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）RNA结合蛋白（RBPs）结合位点。CDK1 mRNA长1923 nt({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001786.4”，“term_id”：“281427275”，“term_text”：“NM_001784.4”}}NM_001786.4号). 该图仅显示了几个核和细胞质尺度RBP的外显子结合位点。显示了每个RBP的亚细胞定位。报告的一些RBP的亚细胞分布表明，它们主要是核（FUS），而不是胞浆（PUM2）。然而，RBP相互之间的核质比尚不清楚，也不知道它们与mRNA靶点的关联。

参考文献