RARγ对维甲酸诱导的胚胎干细胞染色质重塑和转录激活至关重要

RA对WT和RARγ基因敲除细胞的转录调控不同

为了确定RA治疗调控的基因，我们分析了WT和RARγ的折叠变化^−/−ES细胞独立于8和24 与每个细胞系的未处理对照组相比，RA治疗h。在第8和第24天，WT ES细胞中共有29和91个转录物增加了2.5倍 RA治疗h与未治疗WT相比(图。 1安培;补充材料表S5、S6). 根据Weill Cornell生物信息学核心员工的建议，选择了2.5倍的截止线。WT ES细胞中许多已知RA靶基因的转录水平因RA治疗而增加，例如Hoxa和Hoxb簇基因以及Cdx1、RARβ₂和Gata6(图。 1A、D;补充材料表S5、表S6A). 24小时后，40个基因的转录水平下降 RA在WT细胞中处理h(图。 1摄氏度;补充材料表S6B、表S7B). 与之前的研究一致，干细胞标记物Zfp42（Rex1）的转录水平在24小时后降低了2.7倍 RA处理WT细胞h(图。 1摄氏度;补充材料表S6B). 只有少数基因（Otx2、FGF17、Krt1-17和Tdh）在WT和RARγ中的表达水平降低^−/−RA处理24个细胞 小时(图。 1摄氏度;补充材料表S6B、表S7B).

相反，RARγ中只有23个转录本增加了2.5倍或更多^−/−RA治疗24小时后的ES细胞 h与未经处理的RARγ相比^−/−(补充材料表S7A). 第8个 h RA治疗未引起RARγ中任何转录物水平的显著（>2.5倍）变化^−/−ES细胞与未经处理的RARγ的比较^−/−ES细胞。24小时后，WT细胞中大量转录物受到2.5倍或更多的差异调节 RA治疗h后，RARγ未出现2.5倍或更多的统计学显著变化^−/−ES细胞(图。 1安培;补充材料表S4A). 因此，RARγ参与调节这组基因，我们的结果还表明，其他RAR，即RARα和RARβ，不完全补偿RARγ的损失。然而，即使在没有RARγ的情况下，RA也能诱导Stra8、Dleu7、Leftb、Pitx2和Cdx1超过3.8倍。

基因本体研究表明，绝大多数在RARγ中表达减少的基因^−/−细胞是参与形态发生、轴形成和组织模式形成的同源盒基因（Meis1、Pknox2、Pbx1、Foxq1、Gbx2和Hox基因）。RARγ在RA的轴规范中起着关键作用(Bayha等人，2009年). 诱导Hoxa1、Hoxa2、Hoxb1和Hoxb2参与菱形/后脑的形成(Gavalas等人，2003年)，在RARγ中丢失^−/−ES细胞。Anxa5、Anxa2、F2r、F2rl1和Gap43水平降低表明RARγ损伤伤口愈合^−/−老鼠。此外，一些P450细胞色素（Cyp1b1、Cyp26a1和Cyp7b1）的转录水平在RARγ中降低^−/−细胞，表明代谢异常。最后，RARγ中Col4a1、Col4a2、Ccnd2、Lama1、Pik3r1、PDGFRα和Zyxin的表达减少^−/−与WT的对比表明，RARγ中的局灶粘附可能受损^−/−ES细胞，这可能导致细胞流动性和/或侵袭性增加。

RARγ调节RA介导的维甲酸代谢相关基因转录水平的变化，包括Stra6系列,Cyp26a1细胞,拉特和螃蟹2，在ES细胞中

因为我们之前观察到在ES分化过程中参与视黄醇代谢的几个基因的表达发生了变化(兰顿和古达斯，2008年)，我们通过实时RT-PCR评估了在维甲酸代谢途径中起作用的几个基因的mRNA水平，以确定它们是否受到RARγ的调节。RA显著增加了WT细胞中Stra6、Lrat、Crabp2和Cyp26a1的转录水平，但RARγ中没有^−/−RARγ在维甲酸代谢调控中的作用(图。 2). Stra6是一种膜结合受体，与血清视黄醇结合蛋白（RBP4）结合，RBP4是血液中视黄醇的载体，Stra6通过STAT5促进视黄醇和细胞信号的摄取(Berry等人，2011年;Kawaguchi等人，2007年). Stra6基因突变可导致广泛的缺陷，包括无眼症、肺发育不全、膈疝、胰腺畸形、智力低下和先天性心脏缺陷(Golzio等人，2007年;Pasutto等人，2007年). Lrat是一种将细胞内视黄醇转化为视黄醇酯的酶；这些酯是维甲酸在细胞中的储存形式(Amengual等人，2012年;Batten等人，2004年;郭和古达斯，1998;刘和古达斯，2005年;O'Byrne等人，2005年;Zolfaghari和Ross，2000年). Crabp2参与将RA从细胞质运输到细胞核(诺伊，2000年)，Cyp26a1在ES细胞中将RA代谢为极性代谢产物(兰顿和古达斯，2008年;怀特等人，1997年). 实时PCR验证表明，RA介导的Stra6、Crabp2和Cyp26a1转录水平增加的动力学相似(图。 2B–D型). 所有三份成绩单最早在8月增加 添加RA后h，48小时表达增加 WT ES细胞中RA处理h(图。 2A–E型). 相反，Stra6、Crabp2和Cyp26a1转录物在RARγ^−/−单元格(图。 2A–E型). WT ES细胞Lrat mRNA水平早在8 添加RA后h，在24时达到最大值 RA治疗h后，Lrat mRNA水平下降(图。 2A，黑色方形). 在RARγ中，Lrat转录水平没有增加^−/−RA处理的细胞(图。 2A，开口三角形). 作为内部对照，测量参考基因36B4（Rplp0）的mRNA水平，并与RA治疗保持不变(图。 第二版).

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图2。

RA调节维甲酸代谢基因的诱导。(A–E)WT和RARγ中Lrat、Stra6、Cyp26a1、Crabp2和36B4（对照）的转录水平^−/−ES细胞。实验使用独立的RNA样本进行了三次(▪ 重量；△ RARγ^−/−); 误差条表示平均值的标准误差（标准误差）。(F类)Lrat基因组区域的ChIP芯片热图，显示WT和RARγ中的H3K9/14ac、H3K27me3和H3K4me3组蛋白标记^−/−增加RA暴露次数（0、1、8和24 h、 黑色三角形）。颜色表示日志₂-ChIP-ChIP数据集中转化的ChIP富集（复制方法）。列显示基因组位点，行显示IP状态。统计显著性：*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.005. 日志的色标₂富集显示在ChIP-ChIP数据面板下方。Lrat的基因组位置（蓝色调）示意性地显示在底部。

RA治疗使Lrat基因发生表观遗传学改变

RA的转录诱导通常与转录允许标记水平的增加有关，如H3K9/14ac和H3K4me3，而转录抑制标记水平，如沉积的多梳（PcG）H3K27me3，则降低(Gillespie和Gudas，2007年b;Kashyap和Gudas，2010年;Wu等人，2009年). RA治疗24 h导致WT ES细胞中Lrat转录水平增加约10倍(图。 2安培)然而，H3K9/14ac标记水平在RA反应中没有显著增加(图。 2楼). 表观遗传标记H3K4me3在WT和RARγ中的水平相似^−/−ES细胞(图。 2楼). 我们还发现，未经治疗的WT和RARγ中Lrat基因与抑制性H3K27me3标记相关^−/−ES细胞。虽然RA治疗导致WT ES细胞中H3K27me3标记降低，但RARγ中H3K27me3水平仍然很高^−/−事实上，24小时的H3K27me3水平 RA处理的h值高于未处理的RARγ^−/−单元格(图。 2安培). 因此，我们的数据表明RA和RARγ通过拮抗PcG介导的抑制在Lrat转录激活中发挥作用。我们还表明，RARγ不需要用于H3K4me3的定位，这是一种通常与转录活性染色质相关的表观遗传标记(Sims和Reinberg，2006年)并且该标记的存在不足以在RA处理的RARγ中激活Lrat的转录^−/−细胞。

RARγ调节转录因子的转录水平

我们进一步验证了几个转录因子的转录水平，这些转录因子在发育过程中分化的不同方面起着关键作用，并且在WT和RARγ中差异表达^−/−单元格(图。 3A–E级). Meis1和Pbx1是同源域转录因子，作为Hox蛋白的辅因子发挥作用，并调节分化的不同方面(Chang等人，1996年;费瑟斯通，2003;Shanmugam等人，1999年;Shen等人，1996年;Shen等人，1997年;Soprano等人，2007年). 在不同类型的白血病中观察到这些辅助因子与Hox蛋白的联合失调表达(埃克伦德，2007年;Wang等人，2006年). Pbx1是胚胎发生过程中骨骼形态形成、肾上腺和胰腺发育、泌尿生殖器官分化、肾发生和发育中胎儿肝脏造血维持所必需的(Moens和Selleri，2006年). 小鼠的Meis1破坏是胚胎致死性的，而Meis1缺陷的胚胎在眼睛、血管生成和造血方面存在缺陷(Azcoitia等人，2005年;Hisa等人，2004年). Meis1在急性髓系白血病中的表达升高，在含有与MLL（混合谱系白血病）家族成员易位的融合蛋白的白血病中，Meis1具有致癌潜力(Kawagoe等人，1999年;Wong等人，2007年). Pbx1和Meis1 mRNA水平在24小时后增加 WT细胞中RA处理的h，转录水平继续增加至48 RA治疗h(图。 3A、B). 相反，RA没有增加RARγ中Pbx1和Meis1转录水平^−/−单元格(图。 3A、B).

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图3。

RA调节转录因子的诱导。(A–E)WT和RARγ的转录水平^−/−Meis1、Pbx1、Wt1、Gbx2和Barx1的ES细胞。使用独立的RNA样本（填充正方形、WT、开放三角形、RARγ）进行三次实验^−/−); 误差线表示标准误差(F类)Meis1近端启动子区的ChIP-ChIP热图显示WT和RARγ中的H3K9/14ac、H3K27me3和H3K4me3组蛋白标记^−/−增加RA暴露次数（0、1、8和24 h、 黑色三角形）。颜色表示日志₂-ChIP-ChIP数据集中转化的ChIP富集（复制方法）。DS1和DS2表示下游站点1和2；PP表示近端启动子区域。列显示基因组位点，行显示IP状态。统计显著性：P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.005. 日志的色标₂富集显示在ChIP-ChIP数据面板下方。Meis1外显子（宽）和内含子（窄）的位置（蓝色调）以示意图的形式显示在底部。

Wt1（Wilm’s tumor gene）编码一种转录因子，该转录因子在泌尿生殖系统的正常发育中起重要作用，并且在肾肿瘤Wilm’sTumor的一种患者亚群中发生突变(Kreidberg等人，1993年;Pelletier等人，1991a;Pelletier等人，1991b). RA在48小时时增加Wt1 mRNA水平 WT细胞中出现h，但RARγ中Wt1 mRNA水平无RA依赖性增加^−/−单元格(图。 3C公司).

Gbx2（原肠胚形成脑同源盒2）是大脑中/后脑区域正常发育和内耳形态发生所必需的(Lin等人，2005年;Wassarman等人，1997年). 在WT细胞中，RA处理导致Gbx2 mRNA水平增加不到两倍。RARγ中Gbx2 mRNA水平持续降低^−/−细胞与WT细胞的比较(图。 三维).

Barx1是一种同源域转录因子，在胃间质和间质来源的磨牙牙细胞中表达(Makarenkova和Meech，2012年). 未经处理的WT细胞中Barx1 mRNA水平比未经处理RARγ低70倍^−/−单元格(图。 第3页). 48岁 RA治疗h后，RARγ中Barx1 mRNA水平下降约25%^−/−细胞，而WT细胞中Barx1转录水平没有改变(图。 第3页). 因此，RA介导需要RARγ的多个分化和发育相关基因转录水平的变化。为什么RA在分化WT ES细胞时高度调控这些特异性基因尚不清楚。

RA诱导WT细胞Meis1基因RARγ依赖性表观基因组重组

因为Meis1的异常调节与白血病有关(Kawagoe等人，1999年;Wong等人，2007年)我们对癌症的分化治疗感兴趣，接下来我们进一步详细研究了RA诱导Meis1转录水平增加的动力学。我们假设RA信号会导致Meis1基因的表观遗传改变，RARγ的丢失会阻止该基因的染色质改变。在WT细胞中，RA在近端启动子和位于Meis1基因转录起始位点（TSS）下游的特定区域（DS1和DS2）诱导H3K9/14ac水平快速增加(图。 3F，箭头； 图。 4A级). H3K9/14ac表观遗传标记通常与转录活性基因相关(Jenuwein和Allis，2001年). 相反，与WT细胞相比，RARγ细胞中Meis1基因启动子和下游基因内区域的H3K9/14ac水平要低得多(图。 3英尺;图。 4A级)与WT和RARγ中Meis1转录水平相关^−/−单元格(图。 3A级). 在未经治疗和RA治疗的WT和RARγ中，Meis1基因启动子周围的区域H3K4me3标记升高^−/−单元格(图。 3英尺;图。 4摄氏度).

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图4。

H3K9/14ac、Suz12和H3K4me3与特定的Meis1元素相关。Meis1 P的ChIP分析_参考序列WT和RARγ中的（pp）和Meis1下游元素（DS1和DS2）^−/−ES细胞评估(A类)H3K9/14ac；(B)Suz12；和(C类)H3K4me3与三个Meis1元素中的每一个相关。(天)IgG用作阴性对照。每个实验至少重复三次，从新鲜的细胞开始，并通过定量PCR进行评估。数据绘制为相对于IgG背景的褶皱富集。请注意，每个面板中的y轴不同。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差。统计显著性：*P（P）<0.05; 不另作说明，不重要。未经处理的灰色条；RA治疗24天 h、 黑色条。

Meis1位于二价染色质结构域中，例如与PcG蛋白沉积的抑制性H3K27me3标记相关(Boyer等人，2006年)以及上述允许的H3K4me3标记。到24 RA治疗h后H3K27me3标记降低(图。 3英尺)以及Suz12蛋白水平(图。 4B类)在WT细胞的启动子和Meis1基因体中。然而，在RARγ中^−/−细胞H3K27me3标记和Suz12水平保持在24 RA治疗h(图。 3英尺;图。 4B类). 因此，通过RARγ的RA信号可对抗PcG介导的Meis1基因的抑制，RARγ缺乏可阻止从Meis1基因组中去除H3K27me3标记(图。 3英尺).

综上所述，这些数据表明，在Meis1基因中，RARγ（或其下游靶点）是RA诱导的表观遗传结构变化（包括H3K9/14ac标记）所必需的。然而，在Meis1启动子处沉积H3K4me3标记并不需要RARγ，并且H3K4me3标记与RA处理的RARγ中Meis1的转录无关^−/−单元格(图。 3英尺).

Meis1启动子近端区域缺乏功能性维甲酸反应元件（RARE）

RA的作用是通过RARE介导的，因此表观基因组结构对RA的反应发生了巨大变化，在ChIP-ChIP图中产生了热点。我们评估了Meis1近端启动子区域（定义为TSS−/+40 kb），并确定了三个在RA反应中表现出显著表观遗传变化的位点(图。 3F，箭头). 鉴于RARγ在调节Meis1基因中的关键作用，我们进一步确定了这三个位点的维甲酸受体γ（RARγ）和维甲酸受体α（RXRα）水平(图。 5A、B级). 与RARγ相比，WT中的RARγ水平略有升高^−/−所有评估区域的细胞，但在任何一个特定区域都没有表现出特异性富集。所有这些区域的RXRα水平与IgG相似(图。 5A、B级对图5F). 我们检测到RXRα在Cyp26a1启动子上的结合，我们的阳性对照(补充材料图S1)与我们之前的研究一致，表明Cyp26a1是RA的直接靶基因(Kashyap等人，2011年). 因此，Meis1近端启动子区域似乎缺乏功能性RARE。

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图5。

RARγ、RXRα、H3K27ac、p300和PolII-CTD与特定Meis1元素的关联。Meis1 P的ChIP分析_参考序列WT和RARγ中的（pp）和Meis1下游元素（DS1和DS2）^−/−ES细胞评估(A类)RARγ(B)RXRα(C类)H3K27ac(天)第300页，和(E类)PolII-CTD和三个Meis1元素中的每一个。(F类)IgG用作阴性对照。每个实验至少重复三次，从新鲜的细胞开始，并通过一式三份的定量PCR进行评估。数据绘制为IgG背景上的褶皱富集。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差。统计显著性：*P（P）<0.05; 不另作说明，不重要。未经处理的灰色条；接受RA治疗24小时 h、 黑色条。

与WT细胞相比，RARγ基因敲除细胞中的Pol II、p300和组蛋白乙酰化降低

在WT细胞中，我们检测到RA诱导的Pol II富集，最显著的是在Meis1的启动子近端区域。与WT细胞相比，我们在未经治疗和RA治疗的RARγ中检测到低水平的Pol II^−/−细胞，表明RA不能增加RARγ中Pol II的水平^−/−单元格(图。 5摄氏度).

我们还评估了H3K27ac标记与WT和RARγ中共激活物p300（KAT3B）的招募的相关性^−/−ChIP的ES细胞。H3K27ac标记与活性增强子和启动子相关，该表观遗传标记对抗与PcG沉默相关的抑制性H3K17me3标记(Creyghton等人，2010年;Pasini等人，2010年;Vernimmen等人，2011年). 此外，转录共激活物p300具有组蛋白乙酰转移酶活性，并被招募到基因组中的调节增强子元件中(Heintzman等人，2009年;Visel等人，2009年;Wang等人，2005年). RA处理WT后，Meis1基因近端启动子和DS1和DS2下游位点的H3K27ac标记水平增加，但RARγ没有增加^−/−单元格(图。 第五天). 我们在未经处理的WT细胞中观察到p300在近端启动子和两个下游区域的低水平富集。RA治疗后，Meis1基因的p300水平没有显著增加，但WT中H3K27ac和p300关联的水平始终高于RARγ^−/−单元格(图。 第五天,​，EE类).

RARγ与转录因子和多梳抑制复合物的相互作用

干细胞中RARs和多梳群（PcG）蛋白调节转录之间的拮抗性功能性串扰，引发了许多关于维甲酸调节基因中PcG蛋白募集和置换的机制细节的问题。值得注意的是，PcG蛋白EZH2也已被证明与雌激素受体活性阻遏物（REA）、雌激素受体联合阻遏剂以及一位报道者的EZH2-抑制雌激素诱导的转录直接相关(Hwang等人，2008年). 这些发现要求鉴定RAR介导的转录的共同调节因子，该调节因子可能将PcG蛋白与干细胞中RA靶基因结合并靶向。我们发现，在ES细胞中没有RA的情况下，多梳蛋白Suz12与RARγ相互作用，并且这种相互作用在添加RA后被消除；然而，这种相互作用可能不是通过直接结合，而是通过与其他转录调控因子（如共同阻遏物）的联系来桥接(Amat和Gudas，2011年). 重要的是，通过使用RARγ^−/−我们已经证明，缺乏RARγ不会干扰Hoxa和Hoxb簇上PcG介导的H3K27me3标记和其他RA靶点（如Cyp26a1）的基础关联(Kashyap等人，2011年)和梅斯1(图。 3英尺).

给出不同细胞系的不同染色质特征和转录谱(Kashyap和Gudas，2010年)RAR可能以细胞类型依赖的方式与其他转录因子发生串扰。事实上，RAR的细胞特异性功能可能与在其各自谱系的生物功能中起关键作用的转录因子一起执行。RAR与其他转录因子（如Foxa1）的相互作用(Hua等人，2009年)，要求询问和鉴定可能调节ES细胞中RAR功能的其他转录因子。我们已经确定的一些转录因子被RARγ转录激活(图 1,​,3)三)在胚胎干细胞中对RA的反应是扮演这种角色的候选者。

RARγ是Lrat基因RA-相关表观遗传变化所必需的

我们的数据显示RA增加了WT中Lrat转录水平，但不增加RARγ^−/−单元格(图。 2安培). 我们证明，从Lrat基因中去除H3K27me3标记需要RARγ，而不能去除Lrat近端启动子区特异性抑制性H3K17me3标记与RA在RARγ中缺乏转录激活有关^−/−单元格(图。 2楼). H3K4me3标记的位置不需要RARγ，且该标记的存在不足以激活RARγ中的Lrat转录^−/−单元格(图。 2楼). 我们在2内未检测到DR2或DR5 RARE Lrat转录起始位点的kb 5′或3′，表明Lrat可能在距离编码区一定距离处具有RARE，或者Lrat是一个次级RAR靶基因。Lrat近端启动子区缺少H3K9/14ac标记表明，Lrat的RA诱导主要由H3K27me3抑制标记的分离调节，这是WT中观察到的特征，但RARγ中没有^−/−单元格(图。 2楼).

RA对Meis1转录激活涉及PcG介导的抑制和RARγ介导的表观遗传激活的丧失

WT ES细胞中的RA信号导致Meis1基因转录激活标记H3K9/14ac的相关性增加，同时Pol II水平增加(图 三——​5).5). 这些依赖RA的表观遗传变化在RARγ中减弱或缺失^−/−与RA处理的RARγ中Meis1转录水平显著降低相一致^−/−单元格(图 三——​5).5). 重要的是，我们没有发现H3K4me3标记的位置与RA对Meis1的转录激活之间有任何相关性。与H3K27me3标记一样，H3K4me3标记是独立于RARγ招募的，因此产生了一个二价结构域(图。 3英尺). 在WT细胞的这种环境中，RA激活RARγ会导致H3K27me3标记的局部缺失，从而改变抑制性和允许性H3K4me3组蛋白标记之间的平衡。此外，RA诱导的共激活物招募有利于组蛋白乙酰化，进一步增强转录诱导。我们确认了通过shRARγ耗尽RARγ在诱导Meis1中对RARγ的需求(图。 6A级)，但我们没有在Meis1近端启动子区的DS1和DS2区域检测到RARγ或RXRα的结合(图。 3英尺;图。 5). 这表明Meis1可能是ES细胞中RARγ的间接次级靶点。或者，RAR/RXR结合可能发生在远处的增强子区域（+40 kb）。Meis1近端启动子区存在保守的Pbx1结合位点(Magnani等人，2011年)提示RARγ可能通过或可能与Pbx1协同诱导Meis1。

RARγ基因敲除细胞系的建立

病毒颗粒的产生和ES细胞的转导先前已有描述(Benoit等人，2009年). 简言之，使用Lipofectamine 2000（目录号11668，Invitrogen，CA）将敲除载体pLKO shRARγ（hair-pin序列5′-CCCAGAGACTCTCTAT-3′）或pLKO-shLuc（对照）以及包装载体pCMVΔ8.9和pVSV-G（目录号631530，Clontech，CA）转染到HEK293T细胞中。经过一夜恢复后，用新鲜培养基替换培养基，并允许细胞产生额外的48种病毒 采集上清液前h，通过0.45过滤 µm过滤器，并辅以聚丁二烯。用病毒上清液以1∶1的比例和2×培养基转染WT ES细胞。约16 h后，用添加了最终浓度为0.5的嘌呤霉素（产品目录号P7255，Sigma Chemical Co.，MO）的培养基替换培养基 µg/ml，在选择培养基中繁殖10天。在此之后，培养基中不包括嘌呤霉素。

稳定克隆的生成

pRosa26-SV40 mRARγ₂将表达载体稳定导入RARγ^−/−ES细胞。简而言之，将含有Hygromycin表达盒的pRosa26表达载体转染到RARγ^−/−根据制造商的说明，使用LTX Plus试剂（目录号15338，Invitrogen，CA）的ES细胞。使用最终浓度为100的潮霉素（目录号10687，Invitrogen，CA）进行稳定克隆的选择 µg/ml，持续10天。用mRARγE7（+）/mRARγE8（−）引物对克隆进行PCR筛选。334例患者的gDNA纯化成功 bp PCR产物，而241个额外的PCR产物证明了转基因的整合 bp。阳性克隆中的转基因表达通过162 使用rβ-珠蛋白5′C/rβ-球蛋白3′B引物对的bp PCR产物，该引物对跨越pRosa26-SV40载体的β-珠蛋白质内含子。此外，通过western blotting验证了RARγ蛋白的生成（数据未显示）。

RNA分离和反转录

使用Trizol试剂（目录号15596，Invitrogen，CA）提取总RNA。在260℃时通过光密度对RNA进行定量 纳米。RNA（1 µg）被使用Quanta逆转录混合物（产品目录号95048，Quanta Biosciences，MD）逆转录到cDNA。将获得的cDNA稀释10倍 使用微升稀释cDNA进行定量PCR反应。

实时PCR和引物

实时PCR总体积为20 根据Kashyap等人(Kashyap等人，2011年). 使用UCSC基因组浏览器设计引物(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPc)所有实时PCR引物均围绕内含子设计。引物序列可以在补充材料表S1.

染色质免疫沉淀

用RA处理细胞24 h、 交联（1%甲醛，10 最小值），淬火（200 mM甘氨酸，5 min），用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，然后刮取。ChIP根据Gillespie和Gudas进行(Gillespie和Gudas，2007年a;Gillespie和Gudas，2007年b). 至少进行了三次生物复制ChIP实验。

抗体和化学物质

抗-H3K27ac（07-360）、抗H3K4me3（07-473）和抗H3K9/14ac（06-599）抗体购自Millipore（Billerica，MA）。抗-RXRα（D-20，sc-553）、抗p300（N-15，sc-584）和抗IgG（sc-2030）抗体购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。RNA聚合酶II（pCTDser5）的抗磷酸Ser-5羧基末端结构域（CTD）购自Covance Research Products（加利福尼亚州里士满）。抗-RARγ（ab12012）和抗-H3K27me3（ab6002）购自Abcam Inc.（马萨诸塞州剑桥）。

我们感谢古达斯实验室成员对这项研究的有益讨论。我们感谢Pierre Chambon博士提供的RARγ基因敲除小鼠。我们感谢塔玛拉·韦斯曼在编写这份手稿时提供的编辑协助。