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人类分子遗传学。2013年3月15日；22(6): 1193–1205.
2012年12月20日在线发布。 数字对象标识：10.1093/hmg/dds526
预防性维修识别码：项目经理3578413
PMID：23257289

FUS的RNA结合能力调节与携带ALS相关突变的FUS相关的神经退行性变、细胞质定位错误和并入应激颗粒

J.加文·戴格尔,1 小尼古拉斯·A·兰森,1 丽贝卡·史密斯,三 伊恩·卡西,1 阿斯塔·马尔塔雷,1 约翰·莫纳汉,1 查尔斯·尼科尔斯,2 德米特里·克雷杜什金,4 弗兰克·舍梅克,4和乌代班·潘迪1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种罕见的神经退行性疾病，由上下运动神经元变性引起。一些基因，包括SOD1、TDP-43、FUS、Ubiquilin 2、C9orf72和Profilin 1，与偶发和常见形式的ALS有关。FUS是一种DNA/RNA-结合蛋白（RBP），在ALS和额颞叶小叶变性（FTLD）患者的大脑和脊髓中形成细胞质内含物。然而，尚不清楚FUS的RNA结合能力是否是导致ALS发病的必要条件。在这里，我们利用了果蝇属ALS和神经元细胞系的模型，以阐明FUS的RNA结合能力在调节FUS介导的毒性、细胞质定位错误和并入应激颗粒（SG）中的作用。为了确定FUS的RNA结合能力在ALS中的作用，我们对FUS的RNA-结合位点（F305L、F341L、F359L、F368L）进行了突变，并产生了具有或不具有ALS引起突变（R518K或R521C）的RNA结合不敏感的FUS突变体。我们发现，将上述四种苯丙氨酸（F）氨基酸突变为亮氨酸（L）（4F-L）可以消除FUS RNA结合。我们观察到，与携带ALS突变的RNA-binding-competent FUS的表达相比，这些RNA-bining突变阻断了苍蝇大脑、眼睛和运动神经元中的神经退行性表型。有趣的是，RNA-binding-deficient FUS强烈定位于果蝇属运动神经元和哺乳动物神经元细胞，而携带ALS相关突变的FUS分布在细胞核和细胞质中。重要的是，我们确定突变FUS并入SG室取决于FUS的RNA-结合能力。总之，我们证明FUS的RNA结合能力对神经退行性表型至关重要体内突变型FUS（通过与RNA直接接触或与其他RBP相互作用）。

简介

在家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶小叶变性（FTLD）患者中鉴定FUS和TDP-43这两种RNA结合蛋白（RBP）的突变，表明RNA代谢的中断可能是ALS发病的关键事件(1–6). FUS和TDP-43是广泛表达的多功能蛋白质，参与调节RNA代谢的几个功能方面，例如转录、前mRNA剪接和通过RNA/DNA和蛋白质-蛋白质相互作用进行的microRNA加工(1,2,7–12). 有趣的是，这两种引起ALS的蛋白质主要存在于细胞核中，并且具有相似的结构组织(1,2,13,14). 在ALS和FTLD患者的神经元中经常观察到FUS的细胞质定位错误，并被预测为神经退行性变的诱因，这表明突变的FUS在细胞质中获得了有毒的功能(1,2).

FUS和TDP-43的RNA-结合能力被认为与ALS的发病有关，因为这两种蛋白之间的物理相互作用是RNA-依赖的，RNase的治疗阻断了哺乳动物细胞培养模型系统中TDP-43和FUS的相互作用(15,16). 最近的一项研究秀丽隐杆线虫证明了介导TDP-43 RNA结合能力的突变氨基酸残基足以阻断TDP-43介导的蠕虫毒性，表明TDP-43的RNA结合能力对ALS发病至关重要(17). 此外，最近的研究表明，RNase治疗以剂量依赖的方式减少TDP-43和Drosha之间的复合物形成(18). TDP-43调节毒性的RNA结合能力的分子机制尚不清楚。

最近结合RNA交联、免疫沉淀和高通量测序（PARCLIP/iCLIP/CLIP-seq）的方法发现了FUS和TDP-43的RNA靶点，并表明这两种蛋白都参与前mRNA剪接，由于FUS-bound RNA靶序列被发现优先定位于长内含子区域和近剪接受体(19,20). 已经证明，由RBP（如FUS和TDP-43）和microRNAs控制的转录后调节级联在mRNA成熟和基因调节中起着关键作用(20–23). FUS穿梭进入细胞质，特别是在神经元中，表明FUS还参与调节mRNA向突触的转运和突触的局部蛋白质合成，这两个过程对神经元对刺激的快速反应至关重要(13). 此外，最近有研究表明，FUS和TDP-43在细胞应激条件下并入应激颗粒（SG），这种应激条件对mRNA翻译起负控制作用，从而支持了细胞质室中的FUS与翻译机制有关的观点(24–26). SG是包含多聚腺苷化mRNA、翻译起始因子、小核糖体亚基和RBP的细胞质聚集体(24,27). 在细胞应激条件下诱导SG的形成被认为是一种短暂的保护机制，通过将能量消耗转移到细胞修复和恢复，同时阻断从头开始翻译。在氧化应激条件下，将FUS和TDP-43并入细胞质SG表明ALS患者的运动神经元可能存在从应激状态恢复的能力缺陷，这可能与ALS患者运动神经元变性有关。尽管ALS研究领域取得了巨大进展，但FUS的RNA结合能力在导致FUS相关神经变性中的作用尚不清楚。

在本研究中，我们检测了FUS的RNA-结合能力在导致神经退行性表型中的作用果蝇属FUS相关蛋白病模型。我们在RNA识别基序（RRM）结构域（本文称为4F-L）中将四种保守的苯丙氨酸突变为亮氨酸（人类FUS的氨基酸305、341、359和368），并观察到，尽管没有4F-L突变的野生型和突变型FUS都与RNA结合，但4F-L突变足以消除两者中的RNA结合，FUS 4F-L R518K和FUS 4F-L R521C。我们发现，突变FUS的这些RNA-结合残基（4F-L）会阻碍其导致神经退行性表型的能力体内此外，携带ALS的RNA-binding-in-connective FUS导致的突变主要定位于神经元细胞系和果蝇属运动神经元，表明突变FUS的细胞质定位依赖于其RNA-结合能力。我们还观察到，在应激条件下，RNA-binding-in-connective FUS并不定位于SG。总之，这些发现表明，FUS的RNA结合能力是导致ALS发病的关键。此外，当FUS携带ALS突变时，对FUS的RNA和蛋白质靶点进行调节，从而导致毒性的机制的鉴定将有助于开发针对这种毁灭性疾病的治疗干预措施。

结果

RNA-binding-in-connective FUS不结合RNA，无毒体内

为了确定将四种保守的苯丙氨酸突变为FUS的亮氨酸（4F-L）是否会干扰其RNA结合能力，我们在稳定表达人类FUS WT、FUS R518K、FUS 4F-L或FUS 4F-L R518K的神经元（N2a）细胞系中免疫沉淀HA-FUS UV-与RNA交联。在放射性标记结合的RNA之后，我们在放射自显影图上发现了RNA涂片，表明在FUS WT和FUS R518K细胞中观察到了FUS的RNA结合，但在FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K样品中几乎没有观察到RNA涂片，在未转染的细胞和用非特异性抗体下拉的细胞中也没有观察到RNA涂片（图1A） ●●●●。然后用抗HA抗体对放射自显影进行检测，结果表明HA-FUS蛋白在所有预期的通道中被拉下，表明尽管结合RNA被消除，但FUS 4F-L蛋白水平仍然保持不变。输入样本的全细胞裂解物的Western blot显示，除非转染细胞外，所有样本中都存在HA-FUS蛋白（图1A、 底部面板）。

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突变FUS的保守RNA-结合位点4F-L（F305L、F341L、F359L、F368L）会阻断其RNA-连接能力，并且不会对酵母和果蝇属. (A类)从稳定表达FUS WT、FUS 4F-L、FUS R518K或FUS 4F-L R518K的神经母细胞瘤（N2a）细胞系中，HA-tagged FUS的下拉构建与RNA的紫外线交联（顶面板）。下拉后，对RNA进行放射标记，并通过SDS-PAGE显示复合物。在FUS-WT和FUS R518K通道中可以看到表明RNA结合的RNA涂片，但在RNA-结合不敏感（FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K）样品中，RNA涂片高度减少。对照组（前三个通道）包括非转染细胞的对照组（通道1）、转染FUS WT但在下拉前未进行UV交联的细胞（通道2用抗-HA抗体探测的放射自显影显示，HA-FUS蛋白在所有预期的通道中被拉下，表明尽管结合RNA被消除，但FUS 4F-L蛋白水平仍然很高。（底部面板）输入的全细胞裂解物表明，除非转染细胞外，所有样本中都存在HA-FUS蛋白质（第一通道）.以与顶部两个面板相同的顺序加载全细胞裂解物输入样品，但样品之间没有空孔。(B类)与FUS WT和FUS R518K相比，单独过量表达RNA-binding-in-connective FUS（FUS 4F-L）或ALS-引起突变（FUS 4-L R518K）导致酵母毒性显著降低。使用半乳糖诱导物表达所有蛋白质镀锌1发起人。(C类)Western blotting表明，半乳糖诱导过表达后，FUS WT、FUS R518K和RNA-binding-infactering FUS在酵母中积累到类似水平。(D类)RNA-binding-in-competent FUS（4F-L结构）的异位表达在果蝇属（下面板）与FUS WT、FUS R518K和FUS R521C（上面板）相比。(E类)表达FUS-WT、FUS-4F-L、FUS-R521C、FUS-4 F-L R521C，FUS-R518K和FUS-4F-L R518K的两个独立转基因苍蝇的Western blot显示，苍蝇头部的FUS蛋白水平相等。(F类)我们使用先前发布的标准对眼睛表型进行了量化，发现当这些FUS蛋白呈现RNA-结合不活性（4F-L）时，正常毒性FUS突变（R518K和R521C）的毒性减轻。星号表示不同组之间的显著差异***P、 0.0001。

为了进一步确定FUS携带ALS导致突变的RNA结合中断的后果，我们在酵母细胞中表达了FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K。我们发现，与FUS WT和FUS R518K表达相比，FUS 4F-L（单突变体）和FUS 4F-L R518K（双突变体）没有引起任何显著毒性，这在同等水平表达时确实会导致酵母细胞中细胞死亡增加（图1B和C）。这些发现与之前的研究一致，FUS 4F-L自身的异位表达在酵母细胞中没有引起任何毒性(28).

我们最近开发了果蝇属FUS相关蛋白病模型，概括了ALS的几个关键特征，如突变依赖性毒性、神经变性和细胞质定位错误(29). 为了研究FUS的RNA结合能力在毒性中的作用，我们生成了果蝇属表示UAS-FUS 4F-L、UAS-FUS4F-L R518K和UAS-Fus4F-L R 521C构造的行。我们使用GMR-gal4驱动程序，将RNA-binding-in-connective突变体的表达靶向苍蝇眼睛。有趣的是，我们观察到，与FUS WT、FUS R518K和FUS R521C相比，带有或不带有ALS引起突变的RNA-binding-infactering FUS（4F-L）的表达并没有导致任何显著的眼外变性（图1C和D）。我们使用先前发布的标准对眼睛表型进行了量化，发现表达RNA-结合不敏感FUS的果蝇与表达突变FUS的动物相比，其外部眼睛退化表型存在显著差异（图1D） ●●●●。有趣的是，RNA结合残基突变并没有改变FUS蛋白水平，我们观察到，与WT和突变FUS表达株相比，RNA-结合活性株中的FUS水平相等（图1F） ●●●●。我们还研究了RRM（ΔRRM）结构域的缺失是否具有与4F-L突变体相似的效果。我们构建了表达FUSΔRRM、FUSΔ·RRM R518K和FUSΔ·RRM R521C的转基因株系。我们将这些FUSΔRRM构建体的表达靶向于果蝇属眼睛，使用GMR-gal4驱动程序。我们观察到，FUS RRM结构域的缺失强烈阻断了与ALS引起的FUS突变相关的毒性(补充材料，图S1).

带有4F-L突变的突变型FUS（RNA-binding-in-connective）的神经表达减轻了行为异常以及仅由突变型FUS-引起的较小脑容量

此前，我们发现，在FUS相关ALS的苍蝇模型中，突变FUS的运动神经元表达会导致羽化缺陷和幼虫麻痹(29). 由于ALS是一种运动神经元疾病，我们询问在神经元驱动因子Elav-gal4的控制下，FUS的RNA结合能力是否是导致表达FUS的动物羽化缺陷所必需的。我们发现，与FUS R518K和FUS R521C相比，RNA-binding-in-connective FUS表达系（FUS 4F-L）的羽化效果明显更好。FUS 4F-L株系的羽化率与表达FUS-WT的动物相似（图2A） ●●●●。

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RNA-binding-in-connective FUS的异位表达不会导致果蝇属. (A类)体外受精试验：UAS-FUS R518K或UAS-FUSR521C的运动神经元表达，而非UAS-FUS-WT，导致蛹死亡果蝇属与单独驾驶员控制和WT FUS（误差条代表标准误差）相比，运动神经元中表达RNA-binding-in-connective FUS的动物正常关闭。(B类)幼虫爬行试验：与单独驾驶相比，飞行运动神经元中突变体FUS R521C和R518K（但不是WT）的运动神经元表达导致幼虫瘫痪。与对照组相比，RNA-binding-in-competent FUS（4F-L）表达动物的爬行能力没有缺陷。(C类)体壁收缩：与FUS WT和驾驶员单独控制相比，突变FUS的表达导致身体蠕动收缩减少。然而，RNA结合不表达FUS的动物表现出与FUS WT和驾驶员单独控制相似的蠕动收缩。(D类)幼虫扶正试验：与FUS WT和驾驶员单独对照相比，突变体FUS的运动神经元表达降低了三龄幼虫的转向能力。请注意，FUS R521C幼虫完全丧失了自我矫正的能力。有趣的是，RNA-binding-in-connective FUS表达动物表现出与FUS WT和驾驶员单独控制相似的正常幼虫转向能力。星号代表组间的显著差异*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001和NS（不显著）。

为了确定RNA-binding-In-connective FUS的表达是否会导致幼虫运动功能障碍，我们进行了幼虫爬行试验(29–31). 正如预期的那样，与FUS WT或驾驶员单独对照组相比，突变FUS表达动物（UAS-FUS R518K）表现出严重的幼虫麻痹（图2B） ●●●●。有趣的是，与FUS WT或单独的驱动器对照相比，在运动神经元中表达具有或不具有ALS相关突变的RNA结合无能的FUS（4F-L）的动物不会引起幼虫麻痹，这表明FUS的RNA结合能力对于引起幼虫麻痹很重要果蝇属（图2B） ●●●●。重要的是，我们观察到突变的RNA-结合残基（4F-L）显著阻断了与FUS WT相关的毒性，与表达FUS-WT的动物相比，表达FUS 4F-L的幼虫能够更好地爬行（图2B） ●●●●。

通常情况下，果蝇属幼虫通过蠕动并伴随有节奏和协调的波浪向前爬行(32). 这些运动要求肌肉收缩沿身体-球段从后向前进行。为了研究携带ALS的FUS WT和FUS的表达对幼虫体壁收缩的影响，我们将转基因表达定位于运动神经元并进行体壁收缩分析。与FUS WT和驾驶员单独对照组相比，我们观察到表达FUS R518K和FUS R521C的动物的体壁收缩出现严重缺陷（图2C） ●●●●。有趣的是，与幼虫爬行试验一致，我们发现与FUS WT动物相比，表达FUS 4F-L的动物表现出更好的体墙收缩，这表明4F-L突变可以显著降低与FUS野生动物相关的毒性（图2C） ●●●●。

为了进一步阐明FUS表达对运动协调的影响，我们进行了幼虫扶正实验，以测量前后和背腹侧运动协调(33). 将三龄幼虫的腹侧朝上，并记录它们翻滚回背侧所需的时间（扶正试验）。我们发现FUS R518K和FUS R521C的运动神经元表达严重损害了它们自我纠正的能力（图2D） ●●●●。然而，与FUS WT相比，带有或不带有ALS引起的FUS突变的RNA-binding-in-competent FUS（4F-L）表现出更好的转向（图2D） ●●●●。值得注意的是，我们还观察到，与FUS WT动物相比，表达FUS 4F-L的动物能够变得更好，这表明RNA-结合不活跃的FUS单独可以降低与FUS野生动物相关的毒性（图2D） ●●●●。

总之，这些行为分析强烈表明，FUS的RNA结合能力对引起毒性很重要，而改变FUS的RNA-结合残基就足以消除这种毒性。

接下来，我们问果蝇属与突变FUS相关的幼虫可以用大脑毛形态的缺陷来解释。我们观察到，由于三龄幼虫的脑萎缩，运动神经元（OK371-gal4驱动器）中突变FUS的表达导致大脑较小，这表明突变FUS而非RNA-结合的FUS表达导致大脑大体形态的缺陷果蝇属幼虫（图三). 这些观察结果与最近的一项研究一致，该研究表明，一种神经退行性疾病致病蛋白的表达会导致幼虫大脑变小，类似于FUS表达突变的动物(34). 突变的FUS表达可能会导致发育缺陷，然后在发育早期导致萎缩，反之亦然。使用条件表达系统的进一步研究将有助于解决大脑体积小是由于发育缺陷或萎缩造成的可能性。

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突变型FUS的异位表达，而非RNA-结合不活跃的FUS，导致具有泛素阳性病理学的脑萎缩体内试验。(A类)FUS R518K和FUS R521C在飞行运动神经元中的异位表达导致大脑萎缩和大脑缩小。然而，RNA-binding-in-connective FUS的表达单独或与ALS引起的突变一起不会导致大脑大小的任何明显缺陷。(B类)幼虫大脑大小的量化。

RNA结合不敏感FUS主要定位于哺乳动物神经细胞的细胞核

FUS主要存在于正常细胞的细胞核中，在细胞核和细胞质之间穿梭(1,2,35). 突变型FUS的异常细胞质定位错误在人类ALS患者的神经元以及一些动物模型中已经显示(1,2,36). 我们推断，如果FUS的RNA-binding能力参与突变FUS的细胞质定位，我们预计主要是RNA-bining-infactive FUS的核定位。我们在神经母细胞瘤N2a细胞系中稳定表达FUS WT、FUS R518K、FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K（均为HA标记）。我们发现稳定转染的神经元细胞与预期的FUS表达相同(补充材料，图S2). 接下来，我们用抗HA（绿色）和DRAQ5（蓝色；核染色）对稳定转染的细胞进行免疫染色，并用共焦显微镜进行检查。正如预期和先前报道的那样，FUS WT主要定位于细胞核，而FUS R518K则同时存在于细胞质和细胞核中（图4A） ●●●●。令人惊讶的是，我们观察到在细胞核中存在或不存在引起ALS突变的RNA结合无能的FUS的主要定位（图4A） ●●●●。我们对FUS的核和细胞质分布进行了量化，发现与FUS R518K相比，RNA-binding-in-conceptive FUS的分布模式存在显著差异（图4B） ●●●●。这些观察结果表明，突变FUS的细胞质定位错误是通过FUS的RNA结合能力介导的，突变的RNA结合残基限制FUS蛋白进入细胞核。然而，在血清饥饿条件下进行的XTT试验中，我们没有发现瞬时转染FUS WT或FUS R518K的N2a细胞以及正常血清中的明显毒性(补充材料，图S3).

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携带ALS-引起突变R518K的FUS单独分布在哺乳动物神经元细胞的细胞核和细胞质中，但RNA-结合不活跃的FUS（4F-L单独和4F-L R518K）定位在细胞核中，类似于WT-FUS。(A类)FUS WT（抗HA：绿色）主要定位于细胞核（DRAQ5：蓝色）(B类)而FUS R518K分布于细胞核和细胞质(D类). 有趣的是，RNA-binding-in-competent FUS 4F-L(C类)自身或ALS相关突变FUS 4F-L R518K(E类)仅定位于神经元（N2a）细胞的细胞核。(F类)FUS细胞质和细胞核分布的定量。星号表示不同组之间的显著差异***P、 0.0001。

RNA-binding-in-competent FUS主要定位于细胞核果蝇属运动神经元

为了研究FUS在飞行运动神经元中的亚细胞分布，我们使用OK371-gal4驱动程序，靶向运动神经元表达UAS FUS WT、UAS FUSR518K、UAS VUS R521C和UAS Fus4F-L R521C。我们对细胞进行免疫染色，将拉明作为核标记，以突出核膜，因此拉明环内的染色为核染色，环外的染色为细胞质染色(29). 正如预期的那样，WT FUS主要定位于细胞核，而UAS-FUS R518K和FUS R521C则分布于细胞质和细胞核，如FUS（绿色）和Lamin（红色）的免疫荧光所示（图5). 可以清楚地看到WT FUS定位于细胞核，而突变FUS R518K和FUS R521C染色（图5C和E，箭头所示）可见于细胞核和细胞质中，位于拉明环外（图5A） ●●●●。有趣的是，我们发现RNA-binding-in-competent FUS（UAS FUS 4F-L、UAS FUS 4F-L R518K和UAS FUS-4F-L R521C）主要定位于细胞核，这表明突变FUS的细胞质定位错误依赖于FUS的RNA-bining能力，而突变FUS细胞质定位对导致ALS发病至关重要。

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携带ALS的FUS引起突变（R518K和R521C）的细胞质定位错误果蝇属运动神经元通过使FUS RNA-结合丧失活性而被逆转。(A类)FUS WT（抗HA：绿色）主要定位于果蝇属运动神经元(B类)而FUS R518K或FUS R521C同时分布于细胞核和细胞质(D类和F类). 有趣的是，RNA-binding-in-competent FUS本身(C类)或与ALS相关的突变主要是核(E类和G公司).

RNA-binding-infactering FUS不并入细胞质SG

以前已经证明，在应激条件下，携带ALS引起突变的FUS并入细胞质SG，对ALS的发病至关重要(24). 我们询问这种突变FUS的掺入是否依赖于FUS的RNA结合能力。为了解决这个问题，我们用亚砷酸钠刺激稳定表达FUS WT、FUS R518K、FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K（均为HA标记）的神经元N2a细胞株1小时，如前所述(24). 我们用抗HA（绿色，FUS）、抗TIAR（红色，SG标记）和DRAQ5（蓝色，核标记）对细胞进行免疫染色，并用共焦显微镜进行检查。我们观察到FUS R518K，而不是WT FUS，在应激条件下并入细胞质SG（图6). 重要的是，逆境条件下，RNA-binding-infactering FUS（FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K）没有并入细胞质SG。我们在无应力条件下进行了类似物实验，没有发现FUS与SG共定位的任何证据(补充材料，图S4). 我们对显示FUS在细胞质SG中定位的细胞进行了量化，并发现FUS R518K和RNA-结合不活跃的FUS R5128K在胞质SG的结合中存在显著差异(补充材料，图S5).

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突变体FUS并入SGs依赖于其RNA-结合能力。每个HA-FUS稳定的N2a细胞系用0.5 m米亚砷酸钠1小时，用核染料DRAQ5（蓝色）、抗HA（绿色）和抗TIAR（红色）染色。(A类)在未转染的N2a细胞中诱导SGs。(B类)抗-HA染色显示HA-FUS主要为核，不并入SG。(C类)RNA结合缺失突变不会导致HA-FUS并入SG。(D类)HA-FUS R518K与SG标记TIAR共定位。(E类)携带ALS致突变FUS R518K的RNA-binding-in-connective FUS被排除在TIAR SGs之外。

讨论

FUS和TDP-43是与ALS和其他几种神经退行性疾病相关的两个关键RBP(1–三). 最近的研究表明，FUS和TDP-43与大量RNA靶点相互作用，表明这些蛋白质与RNA的相互作用可能在神经退行性疾病的途径中发挥重要作用(19,20). 有趣的是，FUS中的致病突变并没有破坏FUS的RNA-结合能力，这表明突变FUS可能与不同的mRNAs或与相同的具有不同亲和力的RNAs相互作用(1). 大量RNAs结合到WT和突变型FUS上，这表明FUS是一个大型RNA-蛋白质网络的一部分，因此，由于疾病相关突变，该网络的轻微破坏可能足以导致ALS中观察到的运动神经元变性(19,20).

我们发现，在FUS的RRM中将保守的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸（4F-L）会损害FUS 4F-L和FUS 4F-L R518K的RNA-结合能力，表明这些残基对于介导RNA-蛋白质相互作用至关重要，而不会破坏FUS蛋白的表达。以前，已经证明FUS 4F-L的表达在酵母细胞中不会引起任何明显的毒性(28). 我们观察到FUS 4F-L与ALS引起突变（R518K或R521C）的异位表达不会在酵母细胞中引起毒性（图1A） 这表明，带有ALS引起突变的RNA-binding-in-connective FUS在酵母细胞中变得与FUS 4F-L类似无毒。我们还研究了带有或不带有ALS导致突变的RNA-binding-infonnectives FUS在整个动物模型系统中是否变得无毒。为了解决这个问题，我们使用了果蝇属FUS相关蛋白病模型，再现了ALS的几个关键特征，例如分别在苍蝇眼睛和运动神经元中表达的突变依赖性毒性和运动功能障碍。我们发现RNA-binding-in-connective FUS在果蝇属眼睛不会导致任何明显的外部眼睛退化，这表明FUS的RNA结合能力对引起神经退化很重要体内.

接下来，我们询问突变FUS的RNA结合能力是否也可以阻断与突变FUS运动神经元表达相关的运动功能障碍。以前，我们证明突变FUS的运动神经元表达导致羽化率缺陷和幼虫麻痹果蝇属(29). 我们观察到，与表达FUS WT-、FUS R518K-或FUS R521C-的动物相比，带有或不带有ALS引起突变的RNA-结合缺失FUS不会导致羽化率缺陷或幼虫麻痹。此外，FUS的RNA结合能力突变也强烈抑制了与携带ALS的FUS表达相关的体球收缩减少和幼虫转向表型。这些结果进一步支持了我们的假设，即破坏FUS的RNA结合特性足以使携带FUS的ALS突变无毒。

由于携带ALS引起突变的FUS的细胞质定位错误是人类患者和几种动物模型中ALS的病理标志，我们希望确定哺乳动物神经元细胞培养模型系统中RNA结合无能的FUS的亚细胞分布。我们观察到，与WT FUS类似，具有或不具有ALS引起突变的RNA-binding-infactering FUS主要位于细胞核中，这表明与致病突变相关的FUS细胞质定位错误依赖于FUS的RNA-结合能力。我们进一步研究了在运动神经元中表达RNA-binding-infactive FUS的果蝇中的这个问题。我们发现RNA-binding-in-connective FUS主要定位于细胞核，进一步支持了我们的假说，即突变FUS的细胞质定位是通过FUS的RNA-bining能力介导的。通过其RNA结合能力调节FUS的亚细胞分布可能对ALS的发病机制很重要，突变FUS的细胞质定位错误可能由RNA结合介导。沿着这条路线，FUS蛋白可以在被运输到细胞质之前形成FUS–RNA复合物，突变4F-L残基可能会破坏这种复合物的形成，这反过来导致RNA-结合不敏感FUS的主要核定位。或者，携带ALS的FUS突变可能通过其他RBP转运到细胞质，沿着这些路线，4F-L突变可能破坏FUS与其他RBP的复合物，从而阻断向细胞质的转运。此外，突变FUS可能参与维持核功能的关键蛋白质或RNA的细胞质隔离，这种非特异性转运可能导致ALS患者的运动神经元退行性病变。

细胞质SG是暴露于细胞应激（如感染、高温、氧化损伤和缺氧）时产生的短暂结构。SG被认为是对抗不利细胞条件的保护性反应，储存对维持细胞内环境稳定至关重要的mRNA。SG是一种非膜结构，它隔离编码负责分类、降解和翻译重新启动的管家蛋白的信使核糖核酸(37). 一方面，SG选择性下调管家mRNA的翻译，以保存能量以应对应激介导的损伤，另一方面，它上调DNA修复蛋白、伴侣蛋白和各种转录因子等蛋白质的合成。除mRNAs外，SG还包含一些RBP，如TDP-43、FUS、聚（A）结合蛋白1和T细胞内抗原1。先前的研究表明，标记SG的标记蛋白与ALS和FTLD死后大脑中病理性FUS内含物共定位(26,38).

FUS与ALS相关突变并入SG的分子机制仍然是一个谜。我们观察到，在应激条件下，具有ALS引起突变的RNA结合无能的FUS不会与神经元细胞中的SG共定位，这表明突变FUS掺入SG是RNA依赖性的。突变FUS的转运可能直接或间接受FUS的RNA-结合能力或通过其他RBP调节，FUS的RNA结合残基突变可能会削弱FUS在细胞应激条件下定位为SG的能力。最近的一项研究支持了我们的观察，即FUS和TDP-43的RNA结合能力在SG形成中起着重要作用(26). 此外，本特曼的研究等. (39)也表明FUS结构域不结合人工RNA（UG-rich RNA）在体外分析也有助于SG组装。Bentmann进行的实验等。(39)依赖于FUS不同功能域的缺失，这可能会破坏FUS蛋白的三维结构，与我们的研究相比，我们将保守的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸（4F-L）；因此，很难断定FUS的非RNA-binding结构域也有助于SG的形成。此外，我们的研究和Bentmann之间可能存在差异等。(39)是由于使用不同的细胞系进行分析。

我们的数据证明了FUS的RNA结合能力在ALS发病机制中的作用，并支持突变FUS并入细胞质SG对FUS介导的ALS发病至关重要的观点。我们的研究不能排除由于RNA结合残基突变导致FUS蛋白结构改变的可能性。然而，进一步的研究将有助于确定4F-L突变是否也会导致FUS蛋白结构的结构改变，从而阻断毒性。根据我们的结果，我们预计突变型FUS的RNA结合能力将成为治疗ALS患者的潜在药物的合理靶点。

材料和方法

抗体、质粒和细胞培养

人类FUS cDNA质粒（pDONR-FUS-RRM-4F-L）包含FUS RRM域中的四个苯丙氨酸到亮氨酸突变（人类FUS的氨基酸305、341、359和368），这是Aaron Gitler博士的慷慨捐赠(28). 在密切相关的TDP-43蛋白中，四种苯丙氨酸与亮氨酸的类似突变被证明可以消除RNA结合(40). 在用限制性内切酶双重消化后，分离出跨越4F-L突变的713 bp片段Bsu公司36I和Ppu公司I（美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室），并插入到类似制备的基于pUAST的载体中(果蝇属表达载体pUAST-FUS-WT、pUAST-FUS-R518K和pUAST-FUS-R521C）。使用标准方法进行亚克隆，并通过限制性内切酶分析和DNA测序验证分离克隆的正确性。这些pUAST构建物（pUAST FUS 4F-L、pUAST福斯4F-L R518K和pUAST福斯4F-L R521C）被送往BestGene（美国加利福尼亚州奇诺山），以产生转基因苍蝇。

为了将三个FUS构建物中的每一个转移到pCIneo真核表达载体中，用Xho公司我和Xba公司I.将分离的片段亚克隆到类似制备的pCIneo载体中，以生成pCIneo-FUS 4F-L和pCIneo-FUS-4F-L R518K。通过限制性内切酶分析验证了分离克隆。然后，按照制造商建议的方案，使用TurboFect（Fermentas，MD，USA）将上述两个4F-L克隆以及pCIneo FUS-WT和pCIneo-FUS-R518K转染到小鼠神经-N2a细胞系。通过在培养基中加入500μg G418/ml筛选并保持阳性克隆。培养基中添加了先进的DMEM，以包含10%的FBS和1×GlutaMax（均来自美国纽约州格兰德岛Life Technologies）。

XTT法测定细胞毒性

为了测量Neuro2a细胞的细胞增殖差异，构建了一条标准曲线来确定该测定检测范围内的细胞数量。标准品一式三份。为了进行检测，将50000个细胞一式三份接种在96周的组织培养板中，并等待24小时粘附。添加含有5%FBS的新鲜DMEM培养基，并按照制造商的说明使用ATCC XTT细胞增殖检测试剂盒（类别号30-1011k）进行3小时的检测。收集了三个试验的数据，每个试验包含三个重复的样本。

为了通过XTT测定测量细胞活力，将细胞在不含FBS的DMEM培养基中进行血清饥饿，并用阿西德林（400 ng/ml，Calbiochem）处理48小时。将两个包含三份每个样品的独立试验平均在一起。使用ANOVA分析数据事后（post-hoc）使用Tukey's进行α水平为0.05的分析。

RNA结合分析

使用的协议改编自Chi中使用的HITS-CLIP协议等., 2009 (http://ago.rockefeller.edu/ago_HITS_CLIP_Protocol_June_2009.pdf). 简单地说，细胞悬浮在PXL裂解缓冲液中并均质，然后添加1:2500稀释的RNase I（Ambion，AM2295）和1:250稀释的Turbo DNase。然后将样品在37°C下培养3分钟，然后转移到冰中。细胞裂解物在4°C温度22 500下旋转克30分钟，仔细收集上清液。将上清液与预先与单克隆抗HA抗体HA-7结合的蛋白G Dynabeads孵育，然后在4°C下旋转4 h。在珠状物上，用小牛肠碱性磷酸盐处理蛋白结合RNA，然后用放射性标记的3′RNA连接子连接。严格清洗后，样品在NuPage 4–12%Bis–Tris凝胶上运行，并转移到硝酸纤维素膜上进行放射自显影曝光，以检测结合RNA，然后使用Li-COR Odyssey系统用抗HA探针检测蛋白质水平。

酵母表达和免疫印迹

FUS-GFP融合蛋白在酿酒酵母应变W303，如前所述(41). 酵母细胞在30°C下在含有2%葡萄糖或2%半乳糖（用于诱导蛋白质表达）的标准合成培养基中生长。FUS蛋白用镀锌1来自pFPS298质粒的启动子(欧洲标准化委员会,URA3公司). 质粒命名如下：pDK346（FUS-GFP），pDK400（FUS 4F-L-GFP），pDK405（FUS R518K-GFP），pDK518K 406（FUS 4F-L R518K-GFP）。高拷贝质粒DK248(2μ，URA3，FUS-GFP）用作免疫印迹过程中的附加对照。

蛋白质表达水平通过western blotting进行确认，使用培养物在2%半乳糖中培养6小时，收获后用水冲洗一次。细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中[50 m米Tris–HCl，pH 7.5，200 m米氯化钠，3米米EDTA，5%甘油，5 m米DTT和完整蛋白酶抑制剂混合物（罗氏，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）]。通过在4°C下用酸洗玻璃珠剧烈搅拌3分钟，对细胞进行物理破坏。通过低速离心（1500℃下10分钟）去除细胞碎片克). BCA试剂（Pierce，Rockford，IL，USA）用于使蛋白质浓度正常化。酵母裂解物经过SDS/PAGE（任何kD凝胶，Bio-Rad）并转移到PVDF膜（Bio-Ra德）。根据标准方案进行免疫印迹。使用以下抗体：小鼠单克隆α-GFP（Roche）、小鼠单克隆α-PK1和二次AP偶联的α-小鼠（Invitrogen）。

果蝇属培养、光学显微镜和量化

前面描述了FUS WT、FUS R518K和FUS R521C转基因果蝇以及GMR-gal4和OK371-gal4驱动因子(29). 用徕卡M205C体视显微镜分析1日龄苍蝇的眼睛表型，并用徕卡DFC420数码相机拍照。对于每种基因型和条件，评估了25只以上的苍蝇，并如前所述对眼睛表型进行了量化(29).

幼虫脑大小测定

使用相同的距离和放大倍数，用解剖镜（徕卡M205C）对所有分离出的苍蝇大脑进行分离和拍照。所有图像均在相同条件下使用NIH ImageJ进行分析。在每个大脑的周边画一条线。确定了相对面积。对于每个大脑，这是一式三份的，平均值用作大脑的相对面积。这是针对每个基因型的多个大脑进行的。然后对这些累积数据进行分析。

果蝇属行为分析

外渗试验

采用之前公布的方法进行体外试验(29).

爬行试验

我们使用先前公布的方法进行了幼虫爬行试验(29,30). 在开始分析之前，将装有幼虫的小瓶在室温下保存20分钟。从食物小瓶中取出三龄幼虫后，将其在PBS中清洗，以去除任何残留食物，并允许其在1%琼脂平板上爬行1分钟，如前所述(29).

校正分析

为了进行翻正试验，将三龄游荡幼虫置于琼脂平板上，并在室温下驯化5分钟。然后将幼虫腹侧朝上放置，并记录返回爬行位置/背侧朝上所需的时间。每个基因型使用20到25只幼虫，所用时间以秒为单位记录。

收缩试验

在收缩试验中，将幼虫放在琼脂平板上，让其适应5分钟。记录30秒内全身蠕动收缩的次数(31). 请注意，FUS R521C幼虫完全丧失了自我矫正的能力。有趣的是，RNA-binding-in-connective FUS表达动物表现出与FUS WT和驾驶员单独控制相似的正常幼虫转向能力。星号代表组间的显著差异*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001和NS（不显著）。

统计分析

对于所有行为分析，使用单向方差分析对数据进行分析。Tukey的事后（post-hoc）然后在α水平为0.05的情况下，对各组进行多次比较。当P（P）< 0.05; 然而，我们确实报告了P（P）<0.001和P（P）< 0.0001.

免疫组织化学

亚细胞定位

将游荡的三龄幼虫解剖并固定在4%甲醛中15–25分钟。使用的抗体包括抗FUS抗体（Bethyl Labs，cat.#A300–302A，1:1000），抗层粘连蛋白DmO（ADL67/1:10，1:100，由Paul Fisher开发，从NICHD赞助开发的发育研究杂交瘤库获得，由美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学生物系维护）。为了进行二次染色，使用了抗兔Alexa Fluor 488（Invitrogen，cat.#A-11008，1:500）和抗鼠Alexa Fuor 546（Invit罗gen，cat.#A-11003，1:500。染色后，在ProLong Gold（Invitrogen，猫）中安装具有完整CNS的幼虫角质层#第36930页). 使用徕卡SP2-TCS共焦显微镜拍摄图像。所有运动神经元均位于腹神经节背中线。

在检测前5天，从G418选择中取出稳定的Neuro2a细胞系。总共允许100000个细胞粘附在预先涂有0.01%聚乙烯的盖玻片上-我-赖氨酸（Sigma，目录号P4832）。改变培养基以含有DRAQ5[Abcam，cat.#ab108410（5 m米)，1:1000]，37℃孵育o个C培养15分钟。取出培养基，用PBS清洗细胞，用4%甲醛固定15分钟。使用的抗体包括抗HA[Y11]（Santa Cruz，cat.#sc-805，1:200）和抗兔Alexa Fluor 488（Invitrogen，cat.#A-11008，1:500）。盖玻片安装在ProLong Gold（Invitrogen，cat）上#第36930页).

对于亚细胞定位分析，只考虑FUS阳性的细胞。为了量化亚细胞定位，当像素强度至少为背景荧光的10倍时，细胞质染色被视为存在。使用ImageJ确定像素强度(http://rsbweb.nih.gov/ij/).

SG感应

在检测前5天，从G418选择中取出稳定的Neuro2a细胞系。总共有10万个细胞被允许粘附在涂有0.01%聚乙烯的盖玻片上-我-赖氨酸（Sigma，目录号P4832）。将培养基改为含有0.5 m米亚砷酸钠（Ricca Chemical Co.，产品目录号7142-16），如前所述(24). 然后改变培养基，使其含有DRAQ5[Abcam cat.，#ab108410（5 m米），1:1000]，37℃孵育o个用pH 7.0的无菌PBS清洗细胞15分钟，用4%甲醛固定15分钟。使用的抗体包括抗HA[Y11]（Santa Cruz，cat.#sc-805，1:200）、抗TIAR（BD Transduction Labs，cat#610352，1:250）、抗兔Alexa Fluor 488（Invitrogen，cat.#A-11008，1:500）和抗鼠Alexa Fluor 568（Invitrogen，目录号A-11004）。盖玻片安装在ProLong Gold上。

为了量化FUS并入SG的数量，分析中只考虑了FUS染色阳性且含有细胞质SG的细胞（60个细胞）。当像素强度至少为背景荧光的10倍时，细胞质染色被视为存在。使用ImageJ确定像素强度(http://rsbweb.nih.gov/ij/). 当FUS与SG标记物TIAR直接共定位时，FUS并入SG被认为是阳性。

基金

我们非常感谢约翰·霍普金斯大学罗伯特·帕卡德ALS研究中心、肌萎缩侧索硬化症协会和国家健康神经科学研究所1P30GM103340-01A1科布雷（U.B.P.）慷慨支持我们的ALS研究。

补充材料

补充数据：

致谢

作者感谢J Paul Taylor博士（圣犹德儿童研究医院）对手稿提出的宝贵建议。

利益冲突声明。未声明。

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文章来自人类分子遗传学由以下人员提供牛津大学出版社