双酚A在体外破坏血睾屏障完整性：这是研究血睾障碍动力学的合适模型吗？

双酚A对幼年和成年大鼠的治疗

BPA溶于无水乙醇并在玉米油（Sigma-Aldrich）中稀释，通过灌胃给Wistar大鼠喂食，因为据报道口服是人类接触BPA的主要途径(2008年国家毒理学计划). 在不同的方案中，每天以相应的剂量对大鼠进行连续5或6天的治疗（参见图1). 由于BPA在啮齿动物和灵长类动物（包括人类和猴子）中的生物半衰期较短，因此对大鼠进行了多次剂量的BPA治疗(2008年国家毒理学计划). 在这项研究中，由于在一些终点观察到的非单调反应，BPA治疗涵盖了0.02至50毫克/千克体重/天的范围(Vandenberg等人，2009年). 给药的第一天被指定为第1天。在每个方案中的特定时间点终止大鼠实验（参见图1)与n个= 4-7. 在人类中，BPA的日摄入量估计为~2.5-4μg/人/天(Lakind和Naiman，2008年). 因此，我们研究中使用的方案模拟了急性短期或意外接触BPA。由于在先导性实验中，每日5次喂食BPA的大鼠未表现出任何肾小管损伤的迹象，因此，如图1只有未经治疗的对照组（参见图1)用于避免不必要的动物屠杀。然而，研究中包括了一个载体对照组，以检查BPA对未成熟大鼠BTB完整性的影响，前提是根据初步实验检测到具有统计学意义的影响。

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图1

评估双酚A对成年大鼠体重、睾丸重量和精子发生状态影响的研究

本研究中使用的五种方案以及每个方案的大鼠数量如（A）所示。成年Wistar大鼠体重从275克到350克，用玉米油中的双酚a以每只大鼠约600微升的理想浓度灌胃。正常未经处理的大鼠作为对照。（B） 记录并分析体重和睾丸重量。对照组和治疗组的两个参数均无统计学意义的变化。（C） 通过用曙红和苏木精对治疗组和正常大鼠选定时间点的睾丸石蜡切片进行染色进行形态学研究，如（C:a–h）所示。C:a和C:f中的方框区域分别放大并显示在C:b和C:g中。通过小管管腔中生殖细胞（包括伸长精子细胞、圆形精子细胞和精母细胞）的存在来评估受损小管的百分比，不包括发生精子形成的第八阶段（C:i）。在每个时间点评估每个睾丸的整个横截面上的生精小管。C中的比例尺：a=300μm，适用于C:C–f和h；比例尺，C:b=150μm，适用于C:g。

原始支持细胞培养

如上所述，支持细胞是从20天大的Sprague-Dawley大鼠的睾丸中分离出来的(Cheng等人，1986年). 将新分离的Sertoli细胞以0.5–1.0×10的浓度放置在Matrigel（BD Biosciences）涂层的双腔单元或6至24孔培养皿上⁶细胞/厘米²在含有不同生长因子和抗生素的无血清F12/DMEM培养基（Sigma-Aldrich）中(Li等人，2009年). 大约36小时后，按照说明用20 mM Tris（pH 7.4）对培养物进行低渗处理2.5分钟(Galdieri等人，1981年)以裂解残留的生殖细胞。因此，这些培养物中的Sertoli细胞纯度大于98%，生殖细胞（例如，伸长和伸长精子细胞）或Leydig细胞的污染可以忽略不计，早期的特征是使用RT-PCR、免疫印迹和电子显微镜(Lee等人，2003年). 在该培养系统中，在第3-4天建立了功能性TJ通透性屏障，在形态和功能上模拟体内BTB。这是通过细胞上皮的TER进行评估的(Lui等人，2001年)并通过电子显微镜进行监测，其中观察到TJ、ES和桥粒样连接的超微结构(Siu等人，2005年). 由于在低渗处理步骤中去除了伸长和伸长的精子细胞，所以原始支持细胞培养中没有尖端ES。在培养的Sertoli细胞中形成功能性TJ屏障后的第3-5天，用载体对照（0.1%乙醇）、40μM或200μM的BPA处理细胞。这些浓度的BPA被选择用于体外实验，因为据报道，40μM的BPA可诱导SerW3 Sertoli细胞系的连接中断(Fiorini等人，2004年)在体内动物研究中，200μM BPA相当于约45 mg/kg体重，假设大鼠体重为300 g，体积约0.3 L。

免疫印迹分析

按照NP-40裂解缓冲液[50 mM Tris，pH 8.0，含0.15 M NaCl，10%甘油（v/v），1%NP-40（v/v），2 mM EGTA]中的描述制备蛋白质裂解物，并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（~10μl/ml）和磷酸酶抑制剂鸡尾液1和2（~20μl/ml，Sigma Aldrich）。使用直流蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories）。蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并用相应的抗体通过免疫印迹分析对目标蛋白进行检测。抗体的来源及其用于各种实验的工作稀释液如所示表1免疫印迹分析如前所述(Yan等人，2008年). 细胞骨架蛋白，即肌动蛋白和波形蛋白，是蛋白质负荷的控制因素。

荧光显微镜和双标记免疫荧光分析

使用一级抗体和二级抗体的不同组合进行双标记免疫荧光分析（参见表1). 使用带有DAPI（Invitrogen）的ProLong金防伪试剂作为安装介质。使用奥林巴斯BX61荧光显微镜进行荧光和亮场显微镜检查，并使用奥林匹斯DP71数码相机拍摄图像。所有图像文件均使用MicroSuite Five成像软件包（1224版，Olympus Soft imaging Solutions Corp，Lakewood，CO）采集并以TIFF格式保存。使用Adobe PhotoShop CS3扩展版（10.0版）对荧光图像进行分析和合并。对于培养的Sertoli细胞的免疫染色实验，从每组10个随机选择的区域中检测了~500个细胞。对于使用睾丸横切面进行的研究，从每个切面上随机选择的10-20个区域检查约80个生精小管，以评估小管损伤。

体内BTB完整性检测

体内BTB完整性检测如所述进行(Li等人，2006年)使用菊糖-FITC（Mr 4500）（Sigma-Aldrich）作为示踪剂。该分析基于BTB阻止分子探针（如菊糖-FITC）在间质体循环中扩散穿过BTB的能力。当示踪剂能够穿过TJ屏障从生精上皮的基底部到顶端室时，BTB将被视为泄漏(Li等人，2006年). 将菊粉-FITC溶解在PBS中，并通过28号针头将约200μl（含约1 mg荧光探针）注入每只大鼠的颈静脉，静脉注射氯胺酮HCl/二甲苯嗪（60/10 mg/kg体重）作为麻醉剂和镇痛剂。CO示踪剂给药后约30分钟将大鼠处死₂窒息。收集睾丸并在液氮中冷冻。在-20°C的低温恒温器中获得睾丸冷冻切片（约10μm厚）。如上所述，使用荧光显微镜监测示踪剂在生精上皮中的扩散。大鼠接受单剂量氯化镉（5 mg/kg体重，腹腔注射）治疗约3天，已知这会破坏BTB(Wong等人，2004年)，作为阳性对照，未经任何药物治疗的大鼠作为阴性对照。

支持细胞BTB完整性的体外评估

众所周知，在Matrigel-coated双腔单元和/或培养皿上体外培养的支持细胞能够组装TJ通透性屏障，在生理和超微结构上模拟体内BTB(Grima等人，1992年;Janecki等人，1992年)已被该领域的研究人员广泛用于研究BTB动力学。为了评估支持细胞TJ-屏障的建立，在支持细胞电镀后，每天监测BPA存在或不存在时支持细胞上皮的TER(Grima等人，1992年;Janecki等人，1992年;Lui等人，2003年). 为了评估BPA诱导的TJ屏障破坏的特异性和可逆性，BPA（或CdCl₂)用新鲜的F12/DMEM冲洗Sertoli细胞（2次，每次5分钟）。

电子显微镜

在洛克菲勒大学生物成像资源中心进行了电子显微镜检查，以评估双酚A对BTB完整性的影响。将从20天龄大鼠睾丸分离的支持细胞以0.5×10的比例放置在Matrigel-coated 60-mm培养皿上⁶细胞/厘米²之后约36小时，按照上述方法对细胞进行低张处理，以溶解残余生殖细胞(Galdieri等人，1981年). 第5天，将细胞固定在2.5%（v/v）戊二醛/2.5%（w/v）多聚甲醛的0.1 M二羧酸缓冲液（22°C时pH值为7.5）中1小时。细胞后固定在1%OsO中₄（v/v）在0.1 M二甲氨基甲酸盐缓冲液中，并用2%（w/v）乙酸铀酰染色。在升序乙醇中脱水后，通过环氧丙烷处理从60mm培养皿中分离细胞，并将其嵌入EPON（Electron Microscopy Sciences，Fort Washington，PA）块中，如前所述(Brown和Farquhar，1989年). 银切片在Reichert Ultracult II超微切片机（ReichertInc.，Depew，NY）中获得，电子显微照片在80 kV下用JEOL 100CXII电子显微镜（JEOL USA Inc.，Peabody，MA）获得。

细胞毒性测试

支持细胞培养在0.5×10⁶厘米²在Matrigel涂层96-well板上。用相应浓度的毒物处理细胞24小时。使用从Roche Diagnostics获得的XTT（钠3'-[1-（苯氨基羰基）-3,4-四唑]-双（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸氢盐）检测试剂盒（细胞增殖试剂盒II）监测BPA的细胞毒性。该分析量化了活细胞中线粒体脱热原酶在35°C下将黄色四氮唑盐XTT裂解为橙色甲氧基氮染料的能力。除对照孔外，将XTT标记试剂混合物添加到每个孔中，以获得由含F12/DMEM的酚红引起的背景吸光度。然后将平板放回35°C培养箱中，在吸光度饱和之前，使用BioRad 680微孔板阅读器在450 nm和参考波长655 nm处测量多次吸光度。

细胞表面蛋白生物素化用于评估细胞表面蛋白的周转率

在4°C下，使用磺化NHS-SS-生物素（Pierce，Thermo Fisher Scientific）在4℃下对含有完整细胞上皮的单独培养3-4天的Sertoli细胞表面的蛋白质进行生物素化处理30分钟。用50 mM氯化铵溶液对非结合生物素进行淬火(Wachtel等人，1999年). 然后将细胞在200μM BPA或0.1%乙醇中在35°C下孵育1、2或4小时，以允许生物素化细胞表面蛋白的内吞和细胞内降解。细胞裂解物收集在NP40裂解缓冲液中。使用UltraLink固定化中性抗生物素蛋白Plus从细胞裂解液中分离生物素化蛋白，并在SDS-PAGE中进行解析，以使用相应的特异抗体进行免疫印迹，以评估细胞生物素化蛋白质的水平。使用这种方法，定量了生物素化支持细胞表面蛋白，即闭塞素和N-钙粘蛋白在缺乏（载体对照）或存在BPA的情况下特定时间在BTB处的命运，它代表了蛋白质内吞、内吞体介导的降解、再循环和转胞作用的净结果。

BPA没有破坏成年大鼠的BTB完整性

接下来使用从方案5中获得的样本（50 mg/kg体重，5天剂量）检查急性剂量BPA对BTB完整性的可能影响(图1A)治疗后4周(图3A、B). 双标记免疫荧光分析(图3A)结果表明，基础ES整合膜蛋白N-钙粘蛋白（绿色）和TJ-整合膜蛋白闭塞素（红色）共同定位于基底室附近生精上皮的同一部位。这些观察结果与他们在BTB的定位一致(Lee等人，2003年;Wong等人，2004年) (图3A电子-小时和百万英镑). 闭塞素（而非N-钙粘蛋白）从BTB位点表现出轻微损失(图3An与f)与免疫印迹结果一致(图2). 其他两种BTB蛋白的相对定位和/或分布，即基础ES衔接蛋白β-连环蛋白（绿色）和TJ-整合膜蛋白JAM-A（红色）在BTB没有改变(图3B). 在方案4和方案5的选定时间点，F-actin在生精上皮中的分布（见图1)与对照组无明显差异(图4A). 这些发现表明，BPA治疗后，BTB完整性没有受到损害。

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图3

双酚A治疗后睾丸BTB连接蛋白分布的免疫荧光显微镜研究

使用免疫荧光显微镜研究BTB连接蛋白的定位。在首次使用BPA（50 mg/kg体重）治疗4周后处死的大鼠睾丸横切面上的荧光染色与未治疗的对照组进行了比较。（A） 在对照组（A:A–h）的生精上皮周期的几乎所有阶段，检测到N-钙粘蛋白（FITC）和闭塞素（CY3），并在BTB共同定位。在BPA治疗组（A:i–p）中未发现明显差异。闭塞素染色在整个生精小管周围的BTB处呈环状（a:b）。然而，在BPA治疗组中，其强度减弱，似乎略有中断（A:n与f） ●●●●。（B） 治疗组和对照组的β-连环蛋白（FITC）和JAM-A（CY3）部分共同定位于BTB（B:A–h与i–p）。虽然在几乎所有阶段（B:a，d）的BTB都检测到β-catenin，但从第八阶段晚期到第十四阶段（B:B，d），JAM-a在BTB大量表达。JAM-A还被发现与脱落的细长精子细胞（即精子）有关（参见B:B，d，注意小管管腔中的JAM-A荧光染色）。这里显示的显微照片是一个典型实验的结果。每组用3只不同的大鼠重复此实验三次。A:A和B:A=120μm中的比例尺，适用于A:B–d、i–l和B:B–d、i–1；A:e和B:e=25μm中的比例尺，适用于A:e–h、m–p和B:e–h、m–p。

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图4

双酚A治疗后体内BTB完整性检测的研究

BTB的完整性通过（A）生精上皮中丝状肌动蛋白（F-actin）的定位和（B）BTB阻止荧光示踪剂进入管腔室的能力来评估。（A） 正常大鼠上皮细胞中F-actin在BTB的定位（A:A，b）与使用BPA（A:c–l）治疗的大鼠没有发现明显差异。（B） BTB的完整性通过其阻止菊糖-FITC（约4.5 kDa）从体循环扩散至心尖室并限制其扩散至BTB区域（B:a）的能力进行评估。当BTB在CdCl后损坏时₂治疗（5mg/kg体重，静脉注射，持续4天），几乎在整个上皮细胞（b:g）中检测到荧光示踪剂（阳性对照）。在BPA治疗组（10 mg/kg体重和50 mg/kg体重）（b:b–f）中，荧光示踪剂也受到BTB的限制，无法进入上皮细胞的顶端室，与对照组（b:a）相似。这里显示的显微照片是两个实验的代表性结果，其中n个=每个治疗组3只大鼠。对于BPA（10 mg/kg体重）治疗组，所示数据是每个时间点使用一只大鼠的结果。使用2 mg/kg体重的治疗组也获得了类似的观察结果（参见图1)与n个=每个时间点2只大鼠。A中的比例尺：A=100μm，适用于（A:b–l）；B中的比例尺：a=200μm，适用于B:B-g。

为了验证这些发现，按照说明进行了体内BTB完整性分析(Li等人，2006年). BTB的完整性通过其限制小荧光示踪剂菊糖-FITC从生精上皮的基底室向顶端室扩散的能力来评估。如所示图4B，在方案4和方案5中接受急性剂量BPA的大鼠(图1)显示正常BTB功能。菊粉-FITC通过TJ屏障的扩散受到限制（见图4Bb-f与a). 这与用氯化镉治疗4天的大鼠截然不同₂（5毫克/千克体重，静脉注射）(图4B克)是成年大鼠体内BTB的已知干扰物(Wong等人，2004年).

BPA破坏幼年大鼠的BTB完整性

众所周知，只有体内循环中的游离双酚A具有生物活性。当成年哺乳动物（包括大鼠和人类）摄入双酚A时，它在肝脏中迅速代谢为无毒的BPA-葡萄糖醛酸盐形式，然后由肾脏排出。然而，未成熟大鼠代谢BPA的能力效率较低(Chapin等人，2008年;2008年国家毒理学计划). 然后检测BPA对幼年大鼠BTB的影响。在治疗组中，每天用双酚A（50 mg/kg体重）或17β-雌二醇（E₂0.2 mg/kg体重），持续6天。对照组大鼠用玉米油（阴性对照）或氯化镉治疗5天₂（5 mg/kg体重）。在28天大鼠时评估BTB完整性。值得注意的是，经双酚a处理的幼鼠表现出BTB完整性的破坏(图5c与a). 急性剂量下，E₂也被证明会破坏BTB的完整性(图5d与a). 因此，当给幼年大鼠服用BPA时，能够损害BTB的完整性。

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图5

双酚A对幼年大鼠BTB完整性的影响

大鼠从20日龄到25日龄每天灌胃给予BPA（50 mg/kg体重）、17β-雌二醇（E₂0.2 mg/kg体重）或玉米油中的乙醇（2.5%）（溶媒对照）连续服用6次。对于阳性对照，大鼠接受单剂量氯化镉治疗₂（5 mg/kg体重，i.p.），当他们25天大时，已知在随后的第3天诱导BTB破坏(Wong等人，2004年). 当大鼠28天大时，使用菊糖-FITC作为示踪剂评估BTB的完整性。白色括号表示示踪剂从基底膜扩散到生精上皮的距离。在BPA（c）和CdCl中观察到菊糖-FTIC向生精上皮的管腔室扩散₂（b） 和E₂（d） 治疗组与溶媒对照组进行比较（a）。这表明幼犬的BTB更容易接触BPA。a中的比例尺=75μm，适用于b–d。

BPA通过细胞-细胞界面蛋白质的重新分布扰乱了Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能

当支持细胞在体外培养时，在第3天建立了功能性TJ渗透屏障。这表现为细胞上皮抵抗短脉冲电流通过的能力，通过跨上皮电阻（TER）进行量化(图6A). 该体外系统已被该领域的研究人员广泛用于研究BTB动力学(Byers等人，1986年;Grima等人，1992年;Janecki等人，1992年;Okanlawon和Dym，1996年). 40μM浓度的BPA对Sertoli细胞的TJ-屏障功能没有明显影响，而200μM浓度下的BPA则可逆地干扰了TJ-壁垒。在第4天去除双酚A后，被破坏的TJ-屏障在第5天“重新密封”(图6A). 这与CdCl形成对比₂，不可逆地破坏了支持细胞TJ屏障(图6A)类似于其体内破坏作用(Wong等人，2004年).

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图6

BPA对体外支持细胞紧密连接通透性屏障功能和连接蛋白定位影响的研究

（A） Sertoli细胞在1.0×10⁶细胞/厘米²通过TER测量监测Matrigel-coated双腔装置和TJ-barrier组件。第3天，用0.1%乙醇（载体对照，VeCtrl）、BPA或CdCl处理细胞₂对于BPA（200μM）和CdCl₂治疗组在24小时后清洗细胞，并补充无毒物的F12/DMEM。CdCl处理的细胞₂显示出明显且不可逆的TJ屏障破坏。BPA在200μM时对TJ屏障造成轻微的可逆损伤，但在40μM时没有，P（P）< 0.01. （B） 使用0.1−0.2×10培养的Sertoli细胞进行免疫荧光显微镜检查⁶细胞/厘米²第3天，用200μM BPA或载体对照处理细胞24小时。显示连接蛋白43（Cx43，FITC）和ZO-1（CY3）（B:a–f）、N-钙粘蛋白（FITC）以及闭塞蛋白（CY3:g–l）的定位。白色箭头表示细胞-细胞界面上相应的连接蛋白消失。BPA治疗后，细胞-细胞界面的连接蛋白，即连接蛋白43、ZO-1、N-钙粘蛋白和闭塞蛋白水平下降（B:A–c和g–i）与。d–f和j–l）。（A）和（B）中显示的结果是三个实验的代表性结果。（C） 使用电子显微镜评估第5天用0.1%乙醇（C:a和b）或200μM BPA（C:C和d）处理24小时的细胞中细胞-细胞界面的超微结构。（C:a）建立了细胞-细胞连接和模拟体内生精上皮的完整细胞上皮。微绒毛（见星号）是培养的支持细胞顶端的典型细胞结构。Nu，支持细胞核；LD，脂滴。（C:b）这是在培养的支持细胞之间发现的BTB的放大视图。紧密连接表现为两个相邻支持细胞（SC）之间的“接吻”（见白色箭头）。基底ES的典型特征是肌动蛋白纤维束（见黑箭头）夹在内质网（ER）和SC质膜之间。（C:C）显示了BPA治疗后支持细胞之间细胞-细胞界面的典型超微结构。放大（C:C）中的方框区域，如（C:d）所示。值得注意的是，用BPA处理支持细胞后，SC之间的细胞间隙变宽（见“+”），典型的TJ“吻”消失。相反，出现了细胞连接中断的迹象（见灰色箭头）。比例尺，单位为B:a=20μm，适用于B:B–l；C中的比例尺：a=2μm；C中的比例尺：b=0.2μm，适用于C:d；C中的比例尺：C=0.5μm。

然后通过双重免疫荧光研究检测BPA对支持细胞界面连接蛋白分布的影响(图6B). 培养3天的支持细胞用200μM双酚A处理24小时(图6Ba-f型)、N-钙粘蛋白（绿色）和闭塞素（红色）(图6Bg-l公司)进行了检查。结果表明，BPA治疗导致支持细胞界面上Cx43、N-钙粘蛋白和闭塞素的下降，但ZO-1没有下降（见d、j和k中的白色箭头）图6B). 这些来自TJ纤维的蛋白质在该位点的错误定位会影响细胞粘附，从而损害TJ屏障功能，如图6A.

使用电子显微镜进一步验证了这些观察结果(图6C). 值得注意的是，体外培养的支持细胞显示出特征性微绒毛（参见一)和BTB的超微结构(图6Cb条). 这些包括TJ的出现（参见b条)和基底ES，以肌动蛋白丝的存在为代表（参见b条)夹在内质网池之间（ER，inb条)和支持细胞质膜。BPA治疗后，在某些区域未观察到典型的TJ和基底ES超微结构(图6Cc、 d日). 相反，两个相邻的支持细胞之间有大量加宽的细胞间隙（参见图6Cd日). 因此，这些发现表明BPA能够在体外可逆地破坏支持细胞BTB。

非细胞毒性剂量下BPA对体外培养的Sertoli细胞中BTB-相关蛋白的影响

当BPA在0.01至800μM的大范围浓度下应用于体外培养的具有既定TJ屏障的支持细胞时，0.01至500μM的剂量对支持细胞没有细胞毒性(图7A). 这说明了图4不是细胞毒性的结果。免疫印迹分析表明，BPA导致几个连接蛋白的剂量依赖性减少。这些蛋白包括TJ蛋白，即闭塞素、JAM-A和ZO-1，基础ES蛋白，即N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素，GJ蛋白Cx43，半桥粒蛋白β1-整合素和信号蛋白激酶c-Src(图7B、C). 此外，BPA激活了pERK1/2，而没有改变总ERK1/2的水平(图7B、Cd日).

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图7

利用培养的原代支持细胞评估BPA对连接蛋白的影响

（A） BPA对0.5×10培养的Sertoli细胞的细胞毒性⁶细胞/厘米²被评估。在第5天将BPA以所需浓度添加到细胞培养物中。XTT细胞毒性试验按照材料和方法本研究表明，BPA在40μM和200μM时无细胞毒性。（B） 对大鼠BTB中发现的选定靶蛋白进行免疫印迹分析，以验证BPA对原代支持细胞培养物中TJ屏障功能的剂量依赖性影响。免疫印迹结果分析并绘制在（C）中。研究了不同连接类型及其相关适配器的完整膜蛋白的蛋白质水平。在所有研究的标记物中都可以检测到显著下降（C:a–C）。还研究了所选信号激酶的蛋白质水平。磷酸化ERK1（C:d）水平显著增加。（A）和（B）中的结果是三个独立实验的代表性数据n个=3表示（C）。使用单向方差分析测试和Tukey/Kramer程序进行统计分析。除非另有规定，否则所有治疗组均无显著差异。a、，P（P）< 0.05与车辆控制和40μM BPA；b、，P（P）< 0.05与车辆控制和P（P）< 0.01与40μM双酚A；c中，P（P）< 0.01与车辆控制和P（P）< 0.05与40μM双酚A；日期：，P（P）< 0.01与车辆控制和40μM BPA。

我们要感谢洛克菲勒大学生物成像资源中心的Eleana Sphicas女士，她在电子显微镜方面提供了卓越的技术援助。

这项工作得到了国家卫生研究院（NICHD、R01 HD056034、R03 HD051512和U54 HD029990项目5）对CYC的资助。