美国国家科学院院刊。2001年6月19日；98(13): 7469–7474.
血管糜蛋白酶的条件性和靶向过度表达导致转基因小鼠高血压
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海松居
*心血管研究部、研究所、病童医院和†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
罗伯特·格罗斯
*心血管研究部、研究所、病童医院和†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
你小莽
*心血管研究部、研究所、病童医院和†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
莎拉·曾荫权（Sarah Tsang）
*心血管研究部、研究所、病童医院和†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
曼苏尔·侯赛因
*患病儿童医院研究所心血管研究部†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
玛琳·拉宾诺维奇
*心血管研究部、研究所、病童医院和†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
*心血管研究部、研究所、病童医院和†加拿大安大略省多伦多市多伦多大学多伦多综合科多伦多医院心血管研究中心儿科、实验医学和病理生物学及医学系M5G 1X8
由加利福尼亚大学洛杉矶医学院Louis J.Ignarro编辑，2001年4月20日批准
摘要
我们从平滑肌细胞（SMC）克隆了一种大鼠血管糜酶（RVCH），该酶将血管紧张素I转换为II，并且在自发性高血压大鼠与正常血压大鼠的SMC中上调。为了确定RVCH活性的增加是否足以导致高血压，使用四环素控制的反式激活剂（tTA），利用RVCH对SMC的靶向条件表达制备转基因小鼠。我们通过mRNA、蛋白质和乳糜酶活性证实了在无多西环素的情况下（但不存在）RVCH的条件表达。tTA+/RVCH+小鼠在10-12周龄时通过颈动脉插管测量的收缩压（mmHg）高于非二元转基因鼠（136±4 vs.109±3）(P（P）<0.05），以及舒张压和平均压。强力霉素可完全逆转高血压，提示与糜蛋白酶表达存在因果关系。tTA+/RVCH+小鼠与窝友肠系膜动脉内侧增厚（0.82±0.1 vs.0.42±0.02）(P（P）<0.05）与SMC增殖增加有关，根据阳性免疫反应判断，使用增殖细胞核抗原抗体。这些结构变化被强力霉素阻止。tTA+/RVCH+小鼠肠系膜动脉的灌注肌电图也显示，与窝友对照组或多西林治疗组相比，苯肾上腺素引起的血管收缩增加，异丙胆碱诱导的血管扩张受损。我们的研究表明，这种血管糜蛋白酶的上调足以导致高血压动脉病，RVCH可能是高血压患者的候选基因和治疗靶点。
关键词：平滑肌细胞
糜蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，被认为只由血管和心肌中的肥大细胞产生。这些酶在大血管和阻力血管中生成血管紧张素（Ang）II(1–三)在心里(4)也可以将大内皮素-1转化为内皮素-1在体外(5)并使血管扩张剂缓激肽失活(6). 从狒狒的研究中可以明显看出，在完整的动物中可以发生糜蛋白酶依赖性Ang II的形成，其中表明Ang转换酶抑制剂不能阻止对[Pro11，Da1a12]Ang I的血液动力学反应，Ang I在与糜蛋白酶孵育后产生Ang II(7). 除了血压调节外，血管紧张素II和内皮素-1还参与刺激血管平滑肌细胞（SMC）的生长和增殖、血管重塑和心肌肥厚(8,9). 糜蛋白酶还可以通过降解细胞外基质蛋白，包括纤维连接蛋白和IV型胶原，可能通过激活基质金属蛋白酶（MMPs）（MMP-1、MMP-3和MMP-9），影响结构重塑(10–12). 糜蛋白酶还通过I型前胶原的裂解刺激胶原纤维的生成(13).
几项研究提供了令人信服的数据，表明乳糜酶在心血管疾病中起着重要作用。例如，在球囊损伤的狗颈动脉中，糜蛋白酶mRNA水平和糜蛋白酶样活性分别增加了≈10倍和≈5倍(14,15). 曲尼司特（肥大细胞稳定剂）完全阻止了类糜蛋白酶活性的增加，使糜蛋白酶mRNA水平降低约40%，并使颈动脉内膜/中层比率降低约60%。动脉粥样硬化病变中肥大细胞数量增加，糜蛋白酶免疫反应性和mRNA水平增强(三,16,17). 抑制糜蛋白酶活性也可以减少犬静脉移植物中新生内膜的形成(18). 虽然先前的大多数研究表明肥大细胞是糜蛋白酶的来源，但血管平滑肌细胞也可能产生这种酶活性。我们小组最近刚刚从SMC中克隆了一种编码大鼠血管糜蛋白酶（RVCH）的cDNA。我们已经证明重组RVCH将Ang I转化为Ang II在体外此外，与正常血压大鼠相比，自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞中这种糜蛋白酶的表达增强(19).
这些研究表明，这种酶可能是高血压的遗传形式的原因。为了确定血管糜蛋白酶（RVCH）的过度表达是否足以导致系统性高血压，我们使用动脉SMC限制性（SM22α启动子驱动）四环素控制的反式激活子（tTA）生成转基因小鼠，以影响编码RVCH的tTA依赖性转基因基因的条件表达。与非二元转基因小鼠相比，tTA+/RVCH+转基因小鼠的血压升高且强力霉素不可逆。肠系膜动脉内侧增厚与SMC增殖相关，灌注肌电图显示苯肾上腺素诱导的血管收缩增强，而甲胆碱诱导的血管扩张受损。
材料和方法
RVCH的表位标记和条件载体的构建。
为了区分重组RVCH和内源性RVCH，血凝素（HA）标签（YPYDVPDYA）是一种来自人类流感HA蛋白的肽(20)添加到成熟RVCH的C末端。共使用4个PCR引物添加HA：引物1，5′-GCGATCCGAAGACCTCCTGC-3′；底漆2，5′-TCAAGCGTAGTCTGTGGACGTCGTTATGGTAGCTA公司CTTTCCCTTAAGACTGT-3′；底漆3，5′-TACCATACGTCCCAGACTACGCT公司TGAAAAGCTTGACCTGCCTGC-3′；引物4，5′-CGCTCTAGAGGAAAATTATGTG-3′。（HA序列下划线。）将最终PCR产物克隆到四环素反应（Tet-Off）载体pTRE2（CLONTECH）中巴姆HI（高）/Xba公司I位点（pTRE2-RVCH-HA）。对获得的结构进行测序，以验证阅读框架的完整性和序列的保真度。
细胞培养和转染。
大鼠A10 SMC细胞系取自美国型培养物收集中心，CHO-AA8 Tet-Off细胞系购自CLONTECH。A10和CHO-AA8 Tet-Off细胞分别在含有10%FBS、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和250 ng/ml真菌酮的DMEM和α-MEM（100μg/ml G418）中培养。按照制造商的说明，用SuperFect或Effectene（Qiagen，Mississauga，ON）瞬时或稳定地转染所有细胞。使用G418进行选择后，通过将pTet-Off-tTA载体稳定整合到基因组中，生成A10 Tet-Off细胞。然后用（pTRE2-RVCH-HA）瞬时转染这些细胞以及CHO-AA8-Tet-Off细胞。通过使用或不使用强力霉素（1 ng/ml）（CLONTECH）处理的细胞裂解物的Western免疫印迹来评估RVCH的条件表达。使用无插入物的pTRE2载体转染A10 pTet-Off-tTA和CHO-AA8 Tet-Off细胞作为对照。
西方印迹法.
转染后收集A10 Tet-Off和CHO-AA8 Tet-Offs细胞，并在含有0.5 mM EDTA、1μg/ml亮氨酸肽和0.5μg/ml胃蛋白酶抑制素A的20 mM Tris-HCl中制备细胞裂解物。在预制的8–16%聚胺Tris-甘氨酸凝胶（圣地亚哥NOVEX）上分解20毫克蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜上。封闭后，将膜与抗HA的高亲和力大鼠单克隆抗体（克隆3F10，1:1000；罗氏分子生物化学公司）孵育。用与过氧化物酶（1:10000）结合的抗鼠IgG二级抗体清洗膜并孵育。根据制造商的说明，通过增强化学发光（ECL试剂盒；Amersham Pharmacia）检测和可视化靶蛋白。
转基因小鼠的产生和基因分型。
生成了两个转基因小鼠系。第一个转基因系是在SJL/B6背景下（Charles River育种实验室）通过显微注射pTRE2 RVCH HA的标准技术生产的。第二个转基因小鼠系是在C57/B6背景下，在3-kb SM22α启动子（得克萨斯大学西南医学中心Eric N.Olson的馈赠，达拉斯）的控制下，使用微量注射tTA获得的（参考文献。21和图。). pT可再生能源2-然后将RVCH-HA转基因小鼠系与C57/B6进行回交，得到的F三后代用SM22a-tTA小鼠系繁殖，以特异性激活SMC中RVCH的表达。因此，RVCH只在同时具有tTA和RVCH的二元动物（tTA+/RVCH+）中表达，而在只有tTA或RVCH的单个动物中不表达。为了抑制RVCH的表达，在含有2.5%蔗糖的饮用水瓶中以200μg/ml的剂量给予强力霉素，并用铝箔包裹。含多西环素的水每3天更换一次，以避免沉淀。最初使用Southern blot和dot blot对转基因小鼠进行基因分型。这些分析与PCR密切相关，PCR随后用于对小鼠进行基因分型。用苯酚/氯仿从尾部提取基因组DNA。对于Southern blot分析，用巴姆你好。消化后的DNA在0.8%琼脂糖凝胶上分离，转移到Hybond-N+膜上，并与32P-标记的3-kb pTRE2-RVCH-HA结构。用相同结构的未消化DNA进行斑点杂交分析。根据制造商的说明，使用QuickHyb（Stratagene）进行杂交。设计特异性引物，通过PCR扩增RVCH和tTA。为扩增RVCH，正向引物为5′-GAGGCCTTGAAATCTATAGAC-3′，反向引物为5'-TGTGTTTGAGCCTCAA-3′。为扩增tTA，正向引物为5′-GCTTGCTTAATGAGGTCGG-3′，反向引物为5'-CTCTGACCTGGTGATC-3′。PCR使用的条件包括94°C变性3分钟，然后94°C 35次循环45秒，57°C 45秒，72°C 1分钟。
为了记录转基因小鼠SMC中RVCH的条件和靶向表达，我们使用Tet-Off二进制系统。制作了一种转基因小鼠系，其中RVCH-HA构建物由一个复合启动子（TRE-PminCMV）控制，该启动子沉默，不与四环素反式激活子（tTA）结合。在动脉SMC特异性启动子SM22α的控制下，设计第二个转基因小鼠系来表达tTA。当这两个品系繁殖时，产生了双转基因小鼠tTA+/RVCH+，其中RVCH仅在动脉SMC中表达。为了有条件地关闭RVCH的表达，在饮用水中给小鼠注射改变tTA构象的多西林。
大鼠血管糜蛋白酶的RT-PCR表达。
为了评估RVCH的表达是否局限于动脉，对10至12周龄tTA/RVCH小鼠和非二元窝鼠的主动脉以外的不同组织进行了RT-PCR，包括心脏、肺、肾、膀胱、胃和肠。提取RNA前，一组二元小鼠服用强力霉素（200μg/ml）1周。根据制造商的说明，使用三唑（GIBCO/BRL）提取总RNA。用SuperScript预扩增系统（GIBCO）合成第一链cDNA，然后对RVCH进行PCR扩增。PCR条件与上述条件相同。
RVCH免疫沉淀。
使用Pellet杵电机（VWR Canlab，Mississauga，on）将来自tTA+/RVCH+或10-12周龄的对照小鼠或一组年龄匹配的服用强力霉素（200μg/ml）1周的二元小鼠的10个合并主动脉在含有0.5mM EDTA、1μg/ml亮蛋白肽和0.5μg/ml他汀类肽A的20mM Tris·HCl中匀浆。根据制造商的说明，使用罗氏分子生物化学试剂盒对HA标记的RVCH进行免疫沉淀。用组织匀浆培养高亲和力抗HA单克隆抗体（2μg/ml）。然后加入G蛋白琼脂糖，通过离心收集免疫复合物并进行蛋白质印迹分析。
主动脉外植体和淀粉酶活性测定。
平滑肌细胞取自10周龄小鼠主动脉的外植体。培养条件与A10细胞的培养条件相似，并在第2代检测细胞的糜蛋白酶活性。为了测试RVCH活性的条件调节，细胞在没有或存在1 ng/ml多西环素的情况下培养。SMC在含有0.5 mM EDTA、1μg/ml亮氨酸肽和0.5μg/ml胃蛋白酶抑制素A的20 mM Tris●HCl缓冲液（pH 8.0）中被破坏。使用合成荧光底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素来测量裂解物中的糜蛋白酶活性，定义为每mg蛋白质的荧光单位/min(22).
血压测量.
在10-12周龄时，将来自二组或单组的转基因小鼠随机分组进行血压测量，以避免由于昼夜节律变化而产生的偏差。每组中包含相同数量的雄性和雌性小鼠。简单地说，用氯胺酮和甲苯噻嗪（100 mg/kg和10 mg/kg，i.p.）麻醉小鼠，并将其置于仰卧位。使用1.4-F高保真微压计Millar导管（型号SPR-671；Millar Instruments，德克萨斯州休斯顿）准备右颈动脉插管。将导管插入颈动脉，当读数稳定时（通常在5-10分钟内）记录全身血压。然后将导管进一步插入左心室腔，记录左心室压力，以计算±数据保护程序/日期最大值在强力霉素治疗组中，从6周龄开始在饮用水中给予强力霉素（200μg/ml），直到进行血压测量。
形态测量评估。
小鼠被固定就地通过左心室注射4%多聚甲醛。取肠系膜动脉，用4%多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋。肌腱测微计切片用莫瓦特五色法染色。使用图像pro-plus项目（媒体控制论，马里兰州银泉）。
免疫组织化学染色。
将10～12周龄tTA+/RVCH+小鼠和对照小鼠的肠系膜动脉用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，免疫组化染色。用正常血清封闭后，用小鼠单克隆抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（1:100；Amersham Pharmacia）孵育组织切片。根据制造商的说明，使用Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories），用免疫过氧化物酶法对切片进行染色。切片用曙红复染。为了确保染色的特异性，使用正常IgG作为阴性对照，并将一级抗体与抗原预先孵育。
压力肌电图。
解剖肠系膜动脉，并立即将其置于含有（mmol/L）130 NaCl、14.9 NaHCO的冰镇生理盐溶液（PSS）中三，10.0葡萄糖，4.70 KCl，1.17 MgSO4，1.18千赫2人事军官4，1.60氯化钙2和0.027 EDTA（pH 7.4），并用12%O充气2，5%一氧化碳2和83%氮2将肠系膜动脉安装在压力肌电图仪上（弗吉尼亚州伯灵顿市Living Systems Instrumentation），并通过视频显微镜测量其直径。所有实验均在37°C下进行。将肠系膜动脉加压至60毫米汞柱，并使其平衡30分钟，生理盐水溶液每10分钟刷新一次。平衡后，获得基底直径。为了评估肠系膜动脉的收缩反应，绘制了苯肾上腺素（1 nmol/L至30μmol/L）的累积剂量-反应曲线。为了评估甲胆碱介导的舒张作用，用苯肾上腺素（1μmol/L）对肠系膜动脉进行次最大预收缩，并绘制甲胆碱的累积剂量-反应曲线（1 nmol/l至10μmol/l）。剂量之间有3-5分钟的平衡期。
统计分析。
所有数据均表示为平均值±SEM。每组每次测量的动物数量在图例中给出。采用单因素方差分析和Bonferroni分析比较各组之间的差异。A类P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
血管糜酶在培养细胞系中的靶向和条件表达。
我们首先测试了RVCH在A10 Tet-Off和CHO-AA8 Tet-Off细胞中条件表达的构建。Western blot分析使用高亲和力大鼠单克隆抗HA抗体，在A10和CHO Tet-Off细胞中检测到预测分子量为31 kDa的条带（数据未显示）。我们确认添加HA标签剂量不会影响糜蛋白酶活性（数据未显示）。多西环素完全消除了这些细胞中糜蛋白酶的表达，表明成功的条件调控表达。在没有tTA的转染A10细胞中未检测到HA标记的糜蛋白酶蛋白，表明RVCH表达没有泄漏。
转基因小鼠的产生和杂交。
如图所示。，我们用杂合tTA小鼠繁殖杂合RVCH，并观察预期的孟德尔遗传模式；即，25%的后代（测试的61/244）是双转基因tTA+/RVCH+。这一结果也表明缺乏与乳糜酶转基因相关的胎儿毒性。所有组（8-10只幼崽）的子代产仔数也正常且相似。tTA+/RVCH+小鼠的体重与同窝小鼠的体重相似，进一步表明糜蛋白酶的表达并不会对外部阻碍胎儿的发育和生长。
为了确定RVCH表达是否选择性靶向血管平滑肌细胞，使用不同组织的RNA进行RT-PCR。RVCH转录物仅在tTA+/RVCH+转基因小鼠的主动脉中检测到，但在心脏、肺、肾、膀胱、肠和胃中未检测到（图。A类). 在tTA+/RVCH+小鼠开始强力霉素治疗1周后评估RVCH表达时，RVCH的表达完全关闭，表明RVCH的条件调节（图。B类). 利用抗HA标签的高亲和力抗体在RVCH免疫沉淀的蛋白质水平上进一步证实了糜蛋白酶的条件调节（图。C类). 此外，与非二元对照小鼠相比，来自tTA+/RVCH+小鼠的SMC显示出更高的糜蛋白酶活性，这也受到强力霉素的条件性调节（图。).
RVCH的条件性和靶向表达。(A类)通过RT-PCR评估RVCH的靶向表达，如材料和方法RVCH mRNA主要在tTA+/RVCH+小鼠的主动脉（AO）中发现，而在同窝对照的AO中未发现。RVCH mRNA低于心脏（HT）、肺（LU）、肾（KD）、膀胱（BL）、肠（IT）和胃（ST）的检测水平。(B类)为了证实RVCH在转基因小鼠中的条件表达，我们使用RT-PCR显示，通过在饮用水中喂养转基因小鼠多西环素（Dox）（200μg/ml）1周，RVCH mRNA的表达受到抑制。(C类)每组共收集10条主动脉，使用抗HA标记RVCH的高亲和力鼠单克隆抗体进行免疫沉淀。在tTA+/RVCH+小鼠中检测到RVCH蛋白，但在tTA-/RVCH+小鼠中未检测到。在Dox治疗的tTA+/RVCH+小鼠中，RVCH表达完全消失。
SMC中RVCH酶活性的条件调节。使用特定的荧光底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素来测量乳糜酶活性。与同窝对照组（tTA−/RVCH+）相比，来自乳糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）的SMC中的乳糜酸酶活性显著升高。强力霉素（Dox）（200μg/ml）完全逆转了tTA+/RVCH+小鼠糜酶活性的增加，而对tTA-/RVCH+小鼠SMC糜酶的活性没有影响。数据描述为六个独立实验的平均值±SEM。*，P（P）与所有其他组相比<0.05。
血压和心脏功能。
使用Millar导管通过右侧颈动脉插管测量氯胺酮/唑嗪麻醉小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压。将来自四个不同组的小鼠随机分组，由一名经验丰富的研究人员测量血压。与室友对照组相比，tTA+/RVCH+小鼠的收缩压平均增加了27 mmHg。同样，双转基因小鼠与单转基因小鼠相比，舒张压增加了24%（图。). 非二进制对照组小鼠的平均动脉压从82 mmHg增加到tTA+/RVCH+小鼠的103 mmHg。与非转基因同窝小鼠相比，单只小鼠的血压相似，这表明二元小鼠的高血压不是由RVCH或tTA插入引起的。多西环素治疗对单个小鼠的血压没有影响，但可将tTA+/RVCH+小鼠的血压完全逆转至正常水平，表明糜蛋白酶表达与高血压之间存在因果关系。在以下方面没有显著差异+dP/dt（磅/日）最大值（6495±721 vs.6363±975 mmHg/s）或英寸-dP/dt（磅/日）（6026±700 vs.6070±665 mmHg/s）。tTA+/RVCH+小鼠的心率（330±17次/min）与室友对照组（329±16次/min。与室友对照组（3.31±0.02）相比，在糜蛋白酶过度表达的小鼠中观察到左心室与体重的比率略有增加（3.53±0.04）(P（P）< 0.05).
在10-12周龄转基因小鼠右颈动脉使用Millar导管插管测量血压（mmHg）。收缩压显示为开杆，舒张压显示为实心杆，平均动脉压显示为条纹杆。tTA+/RVCH+组的所有三个数值均高于对照窝友。在6~12周龄的饮用水中以200μg/ml的剂量给予强力霉素（Dox）的tTA+/RVCH+小鼠亚组中，其值与对照鼠±Dox的值无明显区别。数值表示为8-20个独立实验的平均值±SEM。*，P（P）与所有其他组相比<0.05。
肠系膜动脉内侧增厚.
接下来，我们确定了由糜蛋白酶表达引起的血压升高是否与血管壁的结构变化有关，如材料和方法与单个小鼠相比，tTA+/RVCH+二元小鼠的内腔与内腔比率增加了93%，例如，tTA-/RVCH+（图。). 我们还发现，tTA+/RVCH+小鼠的肠系膜动脉中层中有大量PCNA阳性细胞表达，这表明SMC的增殖可能有助于中层增厚（图。b条). 多西环素治疗完全逆转了中腔比的增加以及PCNA阳性，表明这些结构异常是糜蛋白酶表达的结果。我们还检查了这些小鼠的主动脉，并确定与单个小鼠相比，二元转基因小鼠的中腔比有类似的增加，但弹性层的数量相似（数据未显示）。
10至12周龄小鼠肠系膜动脉内侧增厚。(A类)代表性的Movat五色染色显示tTA+/RVCH+小鼠肠系膜动脉中层增厚。(一)tTA−/RVCH+；(b条)tTA+/RVCH+；(c（c）)tTA−/RVCH+与强力霉素（Dox）；。(d日)tTA+/RVCH+带Dox。(B类)中腔比定量显示，与同窝对照组相比，糜蛋白酶过度表达的小鼠肠系膜动脉增加了93%。通过在6-10周龄的小鼠饮用水中以200μg/ml的剂量给高表达糜蛋白酶的小鼠喂食Dox，可以完全防止肠系膜动脉的内侧增厚。Dox对室友对照组的中腔比没有影响。数据描述为8-10个独立实验的平均值±SEM。*，P（P）与所有其他组相比<0.05。
用抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体进行免疫组织化学染色。(一)tTA−/RVCH+。(b条)tTA+/RVCH+。(c（c）)tTA−/RVCH+与强力霉素（Dox）。(d日)tTA+/RVCH+带Dox。我们在糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）肠系膜动脉的中层发现大量PCNA阳性细胞（箭头所示），而在对照组的室友中，或在6–12周大的Dox后的任何一组中，PCNA阳性都很少见。
肠系膜动脉的功能分析。
为了确定来自二元转基因小鼠的结构异常血管是否也存在功能异常，使用灌注肌电图研究在分离的肠系膜动脉（100–200μm）中对苯肾上腺素和甲胆碱的反应。与单只小鼠（如tTA−/RVCH+）相比，从tTA+/RVCH+小鼠获得的肠系膜动脉中，苯肾上腺素介导的收缩作用显著增强（图。). 苯肾上腺素EC50tTA+/RVCH+和tTA−/RVCH+小鼠的浓度分别为36±8和131±19 nM。经过6周多西环素治疗后，在tTA+/RVCH+小鼠中未观察到这种增强的苯肾上腺素介导的收缩作用，而EC50强力霉素处理的tTA+/RVCH+小鼠的苯肾上腺素为183±21 nM。为了评估内皮依赖性舒张，所有四组的肠系膜动脉同样用苯肾上腺素（1μM）进行次最大预狭窄。与tTA−/RVCH+小鼠相比，tTA+/RVCH+小鼠肠系膜动脉中的甲胆碱介导的舒张功能受损（图。). 在接受强力霉素治疗的tTA+/RVCH+小鼠中，元胆碱介导的舒张功能受损被消除。由于单剂量硝普钠（10μM）在tTA+/RVCH+、tTA−/RVCH+和强力霉素治疗的tTA+/RVCH+小鼠（分别为106±3%、97±6%和96±3%）中介导了类似的完全舒张，因此，甲胆碱介导的舒张损伤似乎是内皮特异性的。
苯肾上腺素诱导转基因小鼠肠系膜动脉收缩。在tTA−/RVCH+小鼠中观察到剂量依赖性苯肾上腺素诱导的血管收缩。在糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）中观察到对苯肾上腺素的反应性增强，并通过强力霉素（Dox）治疗（200μg/ml）完全阻止。数据描述为4-5个独立实验的平均值±SEM。*，P（P）与所有其他组相比<0.05。
在转基因小鼠中，甲胆碱介导的苯肾上腺素预闭塞肠系膜动脉的舒张。对照tTA−/RVCH+小鼠肠系膜动脉中的甲胆碱诱导的剂量依赖性舒张。与窝友对照组相比，在糜蛋白酶过度表达小鼠（tTA+/RVCH+）肠系膜动脉中观察到血管扩张受损。多西环素（Dox）（200μg/ml）完全消除了tTA+/RVCH+小鼠受损的血管舒张反应。数据描述为3-5个独立实验的平均值±SEM。*，P（P）<0.05和**，P（P）与所有其他组相比<0.001。
讨论
高血压仍然是冠心病和中风的主要危险因素，但关于这种相对常见疾病的分子基础的信息很少(23). 此外，在很大一部分患者中，目前可用的治疗方法仍然难以控制高血压。糜酶是已知的能将血管紧张素I转化为血管紧张素II和大内皮素-1转化为内皮素-1的酶，这些酶还具有与血管重塑有关的其他性质，例如增强基质金属蛋白酶活性，这也可能与高血压有关(24). 我们小组最近从大鼠血管平滑肌细胞中克隆了一种糜蛋白酶（RVCH），该酶在自发性高血压大鼠和正常血压大鼠的血管中升高(19). 为了确定这种乳糜酶的过度表达是否足以导致高血压，我们制作了转基因小鼠，在该转基因小鼠中，我们利用SM22α启动子驱动的tTA，将RVCH的条件表达靶向SMC。我们通过RT-PCR、免疫沉淀和tTA+/RVCH+小鼠的糜蛋白酶活性证实了RVCH在SMC中的条件表达。与非二元转基因小鼠相比，tTA+/RVCH+小鼠的血压升高，并且多西环素可逆，这表明与糜蛋白酶的表达存在因果关系。肠系膜动脉内侧增厚与SMC增殖相关，还观察到功能异常，即苯肾上腺素诱导的血管收缩增强，而甲胆碱诱导的血管扩张减弱。这些研究不仅提供了高血压的动物模型，而且还提供了基因与重要病理状态之间的联系。
利用β-半乳糖苷酶作为报告基因，先前的研究发现，由3-kb SM22α启动子控制的转基因表达仅限于动脉中的血管平滑肌细胞，而不限于内脏器官中的平滑肌细胞(21). 通过RT-PCR，我们检测到了主动脉中RVCH mRNA的表达，但心脏、肺、肝、肾、膀胱、肠和胃中没有RVCH的mRNA表达。虽然在二元转基因小鼠中对主动脉进行HA免疫染色不成功，表明其表达水平较低，但我们能够通过免疫沉淀法检测主动脉组织中的RVCH-HA，从相对较大的样本（10条主动脉）开始。然而，这些结果与最近使用Tet-Off在靶器官中成功表达另一个转基因的研究中获得的结果具有可比性(25). 尽管表达水平相对较低，但我们能够证明，当感兴趣的基因在血管平滑肌细胞中有条件地表达时，可以产生表型。
我们发现，雄性和雌性tTA+/RVCH+小鼠在10-12周龄时血压都升高。目前研究中的血压升高幅度与人肾素和血管紧张素原过表达转基因小鼠的血压升高程度相当(26). 高血压的严重程度也与缺乏内皮型一氧化氮合酶的小鼠相似(27)或钙激活的钾通道(28). 通过用强力霉素治疗6周龄的tTA+/RVCH+小鼠，我们成功建立了糜蛋白酶表达与高血压之间的因果关系。我们选择这个时间点是因为有报道称，自发性高血压大鼠从5-6周龄开始血压升高(29). 通过RT-PCR和免疫沉淀，仅在强力霉素治疗1周后，RVCH受到明显抑制。由于强力霉素治疗的tTA+/RVCH+小鼠的收缩压和舒张压均已完全恢复正常，我们证实RVCH的过度表达是高血压的原因，强力霉素对血压没有直接影响。
在系统性高血压的遗传形式中，血管的结构重塑以及SMC的增殖被认为是高血压发生的基础(30). 在这个模型中，我们发现高血压与大动脉（主动脉）和阻力动脉（肠系膜）的中层增厚显著增加有关。这一观察结果表明，糜蛋白酶过度表达可导致结构重塑导致高血压。事实上，在6周时开始使用强力霉素足以消除重塑以及在10-12周时观察到的高血压。可能上调糜蛋白酶表达并导致重塑和高血压的因素尚不清楚，但我们已经观察到RVCH的诱导与SMC的增殖有关(19)注射内皮毒素野百合碱导致肺动脉肥大和高血压(31).
有文献表明，高血压与阻力动脉的结构和功能异常有关(32). 肠系膜动脉对苯肾上腺素诱导的血管收缩反应增强可能并不奇怪，这可能是tTA+/RVCH+与单个小鼠相比动脉肌张力增加的结果。然而，非常有趣的是，我们还发现tTA+/RVCH+小鼠中元甲胆碱介导的血管舒张功能受损，对硝普钠（10μM）具有正常的血管舒张反应，表明内皮功能障碍。尽管我们不知道为什么RVCH在SMC中的表达会导致内皮功能障碍，但可以合理地推测，表达RVCH的SMC可以抑制内皮NO信号通路，因为据报道，SMC调节内皮一氧化氮合酶的表达(33). 此外，内皮细胞功能障碍也可能继发于高血压引起的内皮细胞损伤，这在文献中已有详细记录(34).
我们已经证明RVCH可以将Ang I转化为II，但这种糜蛋白酶的其他潜在性质也可能影响血压和结构重塑。在初步研究中，我们发现与单个小鼠相比，双体小鼠肠系膜动脉中的Ang II和内皮素-1免疫反应增强。RVCH可增加Ang II和内皮素-1的表达，符合肥大细胞糜蛋白酶的特性。此外，糜蛋白酶可以激活MMPs，从而促进SMC增殖(35,36). 此外，稳定转染RVCH的细胞具有较高的胶原蛋白生成（未公开数据）。
我们发现心率、心脏收缩功能没有明显变化(dP/dt（磅/日）最大值)与同窝对照组相比，tTA+/RVCH+小鼠的舒张功能（数据未显示），tTA+/RVCH+小鼠的心脏重量与体重比仅略有增加。因此，心率和心脏功能的变化都不会导致血压的反射性升高，严重程度的高血压也不会导致心脏功能异常。然而，压力或运动可能会导致更严重的表型。
总之，我们建立了一个系统性高血压模型，该模型有助于进一步解决病理生理学问题，并研究该风险因素对导致正常和基因工程实验动物心血管疾病的其他变量的作用。这些研究还鼓励追求将糜蛋白酶活性升高作为临床系统性高血压的特征，并开发糜酶抑制剂作为降压治疗策略。
致谢
我们感谢Eric N.Olson（达拉斯德克萨斯大学西南医学中心）提供SM22α启动子。我们还感谢朱迪·爱德华兹、奥尔加·马努克、朱迪·马修斯和明达·石提供的秘书和技术援助。我们感谢病童医院的转基因核心设施为转基因小鼠的产生。M.R.是安大略省心脏与中风基金会的研究捐赠主席，也是加拿大卫生研究所的杰出科学家。H.J.、R.G.和X.Y.是加拿大卫生研究所和加拿大心脏与中风基金会的研究员。这项研究得到了加拿大心脏与中风基金会（T6.T4144）的资助。
缩写
| RVCH公司 | 大鼠血管糜酶 |
| 安（Ang） | 血管紧张素 |
| SMC公司 | 平滑肌细胞 |
| tTA公司 | 四环素控制的反式激活剂 |
| 基质金属蛋白酶 | 基质金属蛋白酶 |
| 哈 | 血凝素 |
| PCNA公司 | 增殖细胞核抗原 |
| 逆转录聚合酶链反应 | 逆转录-PCR |
工具书类
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