髓母细胞瘤外体序列发现亚型特异性体细胞突变

摘要

髓母细胞瘤是起源于原始神经外胚层的侵袭性肿瘤。超过三分之一的髓母细胞瘤患者在5年内死于疾病⁶目前的治疗方法通常会对存活患者产生显著的长期不良影响。确定髓母细胞瘤的潜在遗传事件有助于指导更有效的治疗方法的开发，并改进现有化疗和放疗的选择。最近对髓母细胞瘤转录和DNA拷贝数变化的研究为深入了解这些肿瘤的生物学过程提供了线索，并强调了这种疾病的分子异质性^2–4根据这些数据，已经建立了四个广泛的亚组，根据公认的命名法称为SHH、WNT、Group 3和Group 4⁵.

最近，Parsons等人报道了第一个髓母细胞瘤蛋白质编码区的基因组规模测序⁷他们在20%的病例中发现了组蛋白修饰蛋白编码基因的改变，最显著的是MLL2级和MLL3级⁷该初始调查受到发现样本量较小（22名患者）、缺乏亚型特异性分析以及桑格测序技术对低等位基因片段中存在的变异不敏感的使用的限制。在这里，我们调查了92对髓母细胞瘤/正常配对的更大队列中覆盖范围更广的编码体细胞突变，并在特定分子亚型的背景下评估这些突变(补充表1).

总共在18863个基因中的1671个测序到中位数106X覆盖率的基因中检测到1908个突变(补充表2). 选定基因中20个候选突变的确认(CTNNB1、DDX3X、SMARCA4、TP53、，和CTDNEP1公司)使用微流控PCR设备（Fluidigm）扩增48个外显子，然后进行单分子实时测序（SMRT，Pacific Biosciences）(补充文本). 序列数据不可用DDX3X系列样本PCR扩增不良导致突变。其余19个突变均通过该正交方法得到确认（中位73个冗余亚读，范围3–287，补充图1).

每个肿瘤中有16个体细胞突变（12个非沉默，4个沉默），对应于每兆基可调用序列中0.35个非沉默突变的突变率，少于大多数成人实体肿瘤，并且与Parsons等人的结果一致⁷十二种最常见的突变肿瘤中有六种来自年龄最大的患者（诊断时为16–31岁），这与成人与儿童髓母细胞瘤的突变频率增加一致（p=7.7×10⁻⁵、Wilcoxon秩和检验、，补充图2).

为了识别整个队列中以统计显著频率突变的基因，我们使用了MutSig算法⁸它考虑了基因大小、样本特异性突变率、非沉默到沉默突变比率、基因内的聚类和物种间的碱基保守性。在我们的92个样本的队列中，我们鉴定了12个显著突变的基因（q<0.1，表1,补充表3). 引人注目的是，这些基因在c5（第3组）和c4（第4组）肿瘤中没有发生突变，并且存在广泛的体细胞拷贝数改变(图1)这表明这些亚型主要由结构变异驱动，而非碱基突变。不出所料，CTNNB1公司（β-catenin）和PTCH1型是两个最显著的突变基因（参见表1,图1). 点突变CTNNB1公司在所有WNT亚组肿瘤中发现6号染色体缺失，并与其他几个复发突变基因同时存在，即CSNK2B型,DDX3X、TP53和SMARCA4系统.涉及的突变PTCH1型仅发生在SHH亚组肿瘤中，与Hedgehog（Hh）通路相关的基因突变也仅限于该亚组(第页<0.0001，Fisher精确测试）。除了一个肿瘤PTCH1型突变导致9q的体细胞丢失，导致突变等位基因的半合子性。其余肿瘤表现为明显的9q22拷贝中性异位缺失。Hh途径成员的其他体细胞突变包括苏福，中的帧内删除WNT6、，和错义突变GLI2、SMO、PRKACA、WNT2、，和WNT2B型。

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图1

92例髓母细胞瘤患者的人口学特征、分子亚型、选择性拷贝数改变和体细胞突变

描述92例髓母细胞瘤病例的数据轨迹。标识符：用于表示每个案例的唯一名称。标识符还将样本与Cho等人分析的样本联系起来。性别：雄性穿蓝色，雌性穿粉红色。年龄：诊断年龄分为婴儿、儿童或成人。组织学：原发组织标本的病理学回顾。子类型：基于来自序列或微阵列数据的拷贝数分布。Taylor等人发表的公认亚型。Cho等人发表的亚型。副本编号更改：用于将肿瘤指定给子类型的所选拷贝号更改。损失是蓝色的。收益是红色的。体细胞突变：按功能类别分组的基因名称（HUGO符号）。MutSig基因名称以粗体显示。错义突变为黑色，无义/剪接位点/indel突变为橙色，无义突变为紫色，生殖系变体为绿色。

两名SHH亚组肿瘤患者在PTCH1型，一个具有9q的体细胞缺失，导致功能缺失种系等位基因（MD-085，c.3030delC，p.Asn1011Thrfs*38）的半合性，另一个具有先前报道的无前脑畸形患者的替代（MD-286，p.T1052M⁹). 另外两例患者（MD-097和MD-335）在SUFU公司（1个移码缺失和1个无义）在生殖系中以杂合子开始，在肿瘤中变成半合子，这是由于一例10号染色体的体细胞丢失，而另一例复制中性异合子丢失。

MLL2级也受到反复失活突变的影响，这与Parsons等人的研究结果一致⁷为髓母细胞瘤组蛋白修饰失调提供了进一步证据。事实上，十二个最显著突变的基因中有六个与组蛋白修饰和/或相关染色质重塑复合物有关(MLL2、GPS2、KDM6A、BCOR、SMARCA4、，和低密度脂蛋白B1; 看见表1). 作为一个基因集，组蛋白甲基转移酶（HMT）富含体细胞突变，其中21个肿瘤具有明显的HMT突变（q=5.8×10⁻⁹；图2,补充表4).

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图2

组蛋白甲基转移酶、RNA解旋酶和N-CoR复合物相关基因突变的位置

髓母细胞瘤中频繁突变的基因组的线性蛋白域模型上的体细胞突变位置。所有域注释均来自UniProt和InterPro注释。使用领域图（DOG）构建图表²⁸2.0版。a。组蛋白甲基转移酶域：红色=SET，绿色=线圈，蓝色=锌指，青色=其他。b。N-CoR络合物相关域：紫色=GPS2/NCOR2（SMRT）相互作用所需的反平行线圈域¹²，黄色=标记的其他相互作用域：SANT域结合DNA；CoRNR结构域结合核受体；ANK重复序列介导多种蛋白质相互作用，LIM结合域结合一个共同的蛋白质结构基序。c。RNA解旋酶结构域：青色=解旋酶和解旋酶相关（InterPro），红色=RNA-结合和RNA聚合酶σ因子（InterPro），蓝色=ATP结合位点，绿色=DEAD或DExH盒基序。请参见补充表1用于UniProt蛋白质模型标识符。

亚型特异性MutSig分析发现组蛋白修饰基因的其他显著突变，MLL3级和HDAC2、，在第4组肿瘤中KDM6A系列突变（q=0.039和0.066，参见补充表3). 有趣的是，KDM6A突变仅发生在i17q为唯一常染色体改变的肿瘤中(第页=0.0023，Fisher精确检验）KDM6A系列突变还导致X染色体缺失。值得注意的是，这两个“仅i17q”肿瘤没有KDM6A系列突变导致其他组蛋白修饰酶发生突变，即THUMPD3、ZMYM3和MLL3、，这可能表明这种核型的肿瘤具有独特的生物学特性。

在编码核辅阻遏物（N-CoR）复合物成分的几个基因中，观察到具有统计学意义的突变频率：BCOR公司在3个肿瘤中，全球采购服务体系2在3个肿瘤中，以及低密度脂蛋白B12例肿瘤。BCOR公司最近有报道称视网膜母细胞瘤的突变频率很高¹⁰和“复制中性”急性髓细胞白血病¹¹.BCOR公司位于X染色体上，在男性肿瘤中发现两个半合子移码突变（等位基因分数0.90和0.92）。在一名男性中也发现了第三个无义突变，但等位基因比例较低（0.12），这表明存在亚克隆事件。三分之二BCOR公司SHH亚组肿瘤发生突变。低密度脂蛋白B1在另外两个SHH肿瘤中发现了错义和无义突变，均因10q缺失和10号染色体完全缺失而出现半合子（等位基因分数分别为0.81和0.78）。两者都有BCOR公司和低密度脂蛋白B1促进抑制性N-CoR复合物的组装¹²并有明显的功能缺失突变。全球采购服务体系2，编码N-CoR复合物的一个关键亚单位，该复合物是通过与组蛋白去乙酰化酶的合作实现JNK/MAPK信号传导的阻遏物¹²，在两个第3组肿瘤中发生突变。这个全球采购服务体系2突变簇位于氨基酸53-90内，该结构域对异源二聚体至关重要NCOR2号机组（SMRT）并与TBL1-NTD四聚体相互作用以组装N-CoR阻遏复合物¹²最后，在NCOR2号机组在单个SHH亚组肿瘤中发现，强调了N-CoR失调在髓母细胞瘤发展中的中心作用，尤其是在SHH亚群中。

在我们的队列中，编码SWI/SNF-like染色质重塑复合物亚单位的几个基因也发生了突变，包括SMARCA4（轴承/BAF190）编码具有ATP酶活性的DNA解旋酶¹³据报道在肺癌、卵巢癌和胰腺癌中发生突变¹⁴还有髓母细胞瘤¹⁵在我们的队列中，SMARCA4（轴承/BAF190）突变集中在解旋酶结构域，发生在三个第3组肿瘤（在c1亚型中显著，q=0.019）和一个WNT肿瘤中。此外，在选择性ATP酶亚基中发现突变SMARCD2（溴）（在高度保守的残基上错义）和SWI/SNF复合体的其他两个成员，ARID1B（BAF250b）（2 bp移码删除）和SMARCC2（BAF170）（拼接位置）。这些都是明显的功能丧失突变，发生在SHH肿瘤中。因此，髓母细胞瘤中这种复合物的破坏很常见。

在CTDNEP1公司(以前称为达拉德），一种具有以下作用的磷酸酶爪蟾通过调节BMP受体实现神经发育¹⁶作为LIPIN的直接调节器，LIPIN是mTOR复合物的一个组成部分¹⁷.CTDNEP1公司在两个第3组肿瘤中发现了突变（在亚型中显著，q=0.0087），一个2 bp的移码缺失和一个剪接位点的替换破坏。这两种肿瘤都有i17q染色体，导致17p13处野生型等位基因丢失。

中的突变DDX3X系列，一种依赖ATP的RNA解旋酶，具有转录、剪接、RNA运输和翻译功能¹⁸在7个肿瘤中发现，包括一半的WNT途径肿瘤(第页=0.005，Fisher精确检验）和几个SHH亚组肿瘤。DDX3X系列最近有报道称，其他五种肿瘤类型发生了低频突变（癌症体细胞突变目录，COSMIC¹⁵)但这些突变对DDX3X功能的意义尚不清楚。为了了解观察到的点突变对DDX3X物理结构的影响，我们将突变映射到之前报道的DDX3X晶体结构上¹⁹及其直系Vasa/DDX4²⁰(图3a；补充图3；补充表5). 突变似乎聚集在两个结构域中，一个解旋酶ATP结合域（残基211-403）和一个解磷酶C末端域（残基414-575）。这些突变的位置表明它们可能改变DDX3X-RNA的相互作用(图3a；补充表5).

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图3

DDX3X点突变的功能后果

a、，人类DDX3X与单链RNA和Mg-ATP类似物复合物中两个recA-like结构域的三维模型。显示了N末端recA-like结构域（R276K、D354H、R376C）和C末端recA-loke结构域中突变的残基（D506Y、R528H、R534H、P568L）。着色：DDX3X残留166–405（浅蓝色）；DDX3X残留物406–582（深蓝色）；单链RNA（青色）；Mg-ATP模拟（洋红色和绿色）。分子图形图像是使用旧金山大学Chimera软件包生成的²⁹(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera网站).b条，突变体DDX3X增强TOPflash启动子的突变体β-catenin反式激活。所示为与TOPflash报告基因、FOPflash对照基因以及野生型或突变DDX3Xs与野生型或突变体β-catenin联合转染的293T细胞中的相对荧光素酶活性。DDX3X的一维模型显示了条形图，以说明突变的位置。c（c），用野生型或突变型DDX3X慢病毒与野生型或变异型β-连环蛋白慢病毒联合稳定转导的髓母细胞瘤D425细胞的细胞活力测定。

对于b和c，误差条描述了针对每个条件进行的5次重复实验的平均值的标准偏差。学生的t检验用于评估TOPflash强度或细胞增殖值分布差异的显著性，如下所示：单独使用DDX3X与空载体相比增加，单独使用wtBetaCat与DDX3X相比增加，使用mutBetaCat与DDX3X相比增加，以及使用mutBetaCat与wtBeta Cat相比增加。

由于一半的β-连环蛋白突变肿瘤同时含有DDX3X系列我们研究了DDX3X是否能增强β-catenin对TCF4-luciferase报告子（TOPflash）的反式作用，以及DDX3X/beta-catenin的联合表达是否对细胞活力/增殖有可测量的影响。与野生型β-连环蛋白结合，无论是野生型还是突变体DDX3X单独都不能显著地反式激活TOPflash报告基因。然而，结合突变的β-catenin（S33Y替代），我们队列中的大多数DDX3X点突变增强了报告活性(图3b; p<0.05）。这种增强作用在HeLa（数据未显示）和D425髓母细胞瘤细胞系的细胞活力测定中也很明显(图3c; p<0.05）。

鉴于DDX3X系列髓母细胞瘤突变，我们搜索了RNA螺旋酶数据库中列出的基因³⁰髓母细胞瘤的低频突变。我们发现五种肿瘤的RNA解旋酶或RNA结合域发生突变DHX9型,DHX32型,DHX57型,风扇控制模块和SKIV2L系列(图2,补充表6). 错义突变位于保守残基，SIFT、AlignGVGD和PolyPhen2预测其有害。此外，在SETX公司发生在其RNA解旋酶结构域的上游，并可能破坏其RNA解旋酶结构域。总的来说，15%的髓母细胞瘤似乎有RNA解旋酶活性的破坏。

总之，我们报告了髓母细胞瘤（儿童最常见的恶性脑肿瘤）的下一代序列分析。我们的结果揭示了一些已知途径的突变，如组蛋白甲基化(MLL2级和其他），声音刺猬(PTCH1型,SUFU公司和其他）和Wnt(CTNNB1公司以及新基因的突变，包括DDX3X系列,BCOR公司,低密度脂蛋白B1、和全球采购服务体系2我们的初步功能研究表明DDX3X是致病性WNT/β-catenin信号的候选成分。在更广泛的意义上，DDX3X系列最近有报道慢性淋巴细胞白血病发生突变²¹头颈癌²²两者都有WNT信号失调的肿瘤亚群。研究突变型DDX3X在这些环境中是否与β-catenin协同作用的研究，将为这一多层面的分子提供更多的见解，并为新的治疗开辟潜在途径。最后，髓母细胞瘤中核受体辅阻遏物复合物分子改变的描述为这一致命儿童疾病的发病机制提供了新的见解。

方法总结

在波士顿儿童医院、多伦多儿童医院和儿童肿瘤小组/合作人类组织网络的捐助机构治疗的髓母细胞瘤患者的家属在各自的内部审查委员会的批准和监督下，提供了知情同意书。所有肿瘤都是在首次手术切除时获得的，我们的分析排除了复发肿瘤。病理学家对肿瘤样本的苏木精和伊红染色切片进行了审查，以确认髓母细胞瘤的诊断，在可能的情况下确定组织学亚型，并评估肿瘤纯度。如前所述，从肿瘤标本和匹配的外周血中分离DNA²使用18863个miRNA-和蛋白编码基因的193094个外显子的溶液中杂交片段，对92个肿瘤/正常对的DNA进行外显子测序，然后使用Illumina测序-逐合成技术对76 bp的配对序列进行测序²³读数与人类基因组构建GRCh37一致²⁴使用Burrows-Wheeler校准器²⁵将每个样本中的~33 Mb靶区测序为平均覆盖率的106倍（范围73-234）。使用基因表达数据和拷贝数谱（来源于SNP微阵列或序列数据），使用已公布的标准将每个肿瘤分为一个亚组²我们的队列包括6个WNT（c6）、23个SHH（c3）、33个组3（12 c1、21 c5）和30个组4（12 c2、18 c4）肿瘤（参见补充表1用于案例注释）。使用muTect检测突变，并使用Oncotator注释²⁶，并使用集成基因组查看器（IGV）手动审查²⁷为了进行验证，按照制造商的说明，对Access Array微流控芯片（Fluidigm）进行PCR，然后进行单分子实时测序（Pacific Biosciences）。使用制造商和定制软件提取亚基并分配给样本，并使用BWA-SW与人类参考基因组序列的hg19（GRCh37）构建相一致²⁵。候选突变通过使用IGV的人工审查得到确认²⁷(补充图1). 请参见补充信息和http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/获取材料和方法的完整描述。

补充材料

致谢

脚注

工具书类