用于神经移植的组织相容性灵长类诱导多能干细胞的研制

MHC克隆和测序

如前所述，在威斯康星国家灵长类动物研究中心（威斯康星大学，麦迪逊分校）进行了前瞻性MHC分型⁸。

成纤维细胞培养

印度尼西亚CM的皮肤成纤维细胞购自Coriell Cell Repositories（新泽西州卡姆登）。从毛里求斯CM获得的3 mm真皮活检组织的外植体中生成成纤维细胞。真皮片在37°C下与1000 U/ml胶原酶B（印第安纳波利斯州罗氏）孵育2小时。细胞在生长培养基[Dulbecco改良的鹰培养基（DMEM，Thermo Scientific HyClone，Waltham，MA），10%胎牛血清（FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA）]中重新培养。2周后，用0.05%胰蛋白酶传代来自外植体的成纤维细胞。

外周血单个核细胞分离

PBMC通过95%Ficoll-Paque™PLUS（GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ）梯度离心分离，并在添加10%FBS的RPMI 1640培养基（GIBCO，Invitrogen）中重新悬浮。

食蟹猴诱导多能干细胞的产生

人类OCT4、SOX2和KLF4、c-MYC逆转录病毒载体来自Addgene（马萨诸塞州剑桥）。为了产生病毒，用2.5µg逆转录病毒载体、0.25µg VSV-g载体和2.25µg Gag-Pol载体转染10-cm平板中的293T细胞。转染两天后，过滤上清液并离心。为了生产猴iPSCs，将1×10^5成纤维细胞接种在六孔板的一个孔中，并用8µg/mL聚brene（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）感染逆转录病毒（MOI=10）。感染三天后，将细胞分裂成预先接种有小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，GlobalStem，Rockville，MD）的平板。感染后5天将培养基更换为hESC培养基。CM iPSC和人ESCs根据标准方案生长¹¹所有实验均由合作伙伴胚胎干细胞研究监督委员会（ESCRO）批准，协议编号为2006-04-001A。

碱性磷酸酶检测和免疫细胞化学

根据制造商的说明，使用碱性磷酸酶检测试剂盒（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）进行碱性磷酸酶（AP）染色。免疫细胞化学方面，细胞在4%多聚甲醛中固定10分钟，用PBS冲洗，并用10%驴血清在PBST（PBS+0.1%TritonX-100）中封闭60分钟。如前所述进行免疫荧光染色¹²主要抗体包括SSEA-4（1:500，DSHB，衣阿华州爱荷华市，IA）、TRA-1-60（1:50，Chemicon）、TRA-1-81（1:50；Chemicon。

核型分析

细胞系遗传学（威斯康星州麦迪逊）进行了G显带染色体分析。

畸胎瘤的形成与分析

畸胎瘤检测由Applied Stem Cell（加利福尼亚州门洛帕克）进行。以1mg/ml的dispase收获iPSCs。通过离心收集iPSCs，并在50%Matrigel中重新悬浮。在NOD-SCID小鼠肾包膜下注射1×10^6 iPSCs。肿瘤在4-8周内发生，在处死小鼠后分离出畸胎瘤并用福尔马林固定。切片后，根据苏木精和伊红染色诊断为畸胎瘤。

体外分化

如前所述进行体外DA神经元分化¹³简单地说，神经分化是通过基质饲养细胞系（MS5）上的共培养和添加300ng/ml noggin 21天诱导的（明尼阿波利斯研发系统公司）。干细胞在血清置换培养基中培养14天【KnockOutTM DMEM补充15%KnockOutTM血清置换、1mM谷氨酰胺和1%非必需氨基酸（均来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen）】，然后在N2介质中培养7天，N2介质由DMEM/F12（Invitrogen）补充N2-A（干细胞技术；加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市）。在第21天，人工采摘玫瑰花结结构，并将其置于聚L-鸟氨酸/层粘连蛋白（Sigma-Aldrich）涂层培养皿上。通过在N2培养基中培养细胞16天来诱导DA分化，所述N2培养基含有200 ng/ml Shh的N-末端片段（R&D Systems）、100 ng/ml鼠FGF8-b（R&D Systems）、20 ng/ml BDNF（PeproTech EC Ltd.，London）和200µM抗坏血酸（Sigma-Aldrich）。在含有二丁酰cAMP（1 mM，Sigma–Aldrich）、200µM抗坏血酸、1ng/mL TGFβ3（Calbiochem，San Diego）、20 ng/mL GDNF（Sigma-Aldric）、100 ng/mL Wnt5a（R&D系统）、20 ng/mL FGF2（Invitrogen）、100 ng/mL FGF20（Peprotech）、20 nm/mL BDNF（Peproech）的N2培养基中对细胞进行5天的最终分化。

定量实时PCR

如前所述，使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）提取总RNA¹⁴每个基因的表达水平归一化为内源性β-肌动蛋白。使用2-ΔΔCT方法计算基因表达的折叠变化¹⁵所有结果均来自三个独立实验的三个技术复制。可根据要求提供引物序列。

流式细胞术分析

如前所述进行流式细胞术¹⁶使用了以下抗体及其相应的同型对照：HLA-A、B、C；HLA-DP、DQ、DR和CD16（加利福尼亚州圣地亚哥BD-Pharmingen）。使用FACSDiva软件（BD Biosciences）在荧光激活细胞分选仪FACSAria上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件（Tree Star，Ashland，OR）分析数据。在某些条件下，将25 ng/ml重组人干扰素-γ（R&D系统）添加到培养基中，2天后对细胞进行分析。

幼年大鼠和6-羟多巴胺致敏大鼠的移植

换入最终分化培养基五天后，对细胞进行胰蛋白酶解，并以100000个细胞/µL的密度重悬于含有10µg/ml GDNF的HBSS中。未受感染的大鼠接受200000个细胞作为1个沉积细胞，沉积在来自bregma的以下坐标：AP+0.4；毫升−3；DV−5.0。用4µl细胞悬液将6-OHDA损伤的大鼠移植到纹状体，作为200000个细胞的2个沉积物，使用来自bregma的以下坐标：位置1:AP+0.4；ML−3；DV−5.0；站点2:AP−0.5；ML−3.6；DV−5.0。以0.3µl/min的速率植入细胞。大鼠使用环孢菌素A（10 mg/kg/天，Sandimune，Sandoz，新泽西州东汉诺威）进行免疫抑制。在移植前2周和移植后4、8、12、16和24周，对6-OHDA致敏大鼠腹腔注射安非他明（4 mg/kg；90 min）或皮下注射阿扑吗啡（0.1 mg/kg；40 min）后的旋转不对称性进行分析。

组织学和体视学程序

如前所述进行免疫荧光染色¹³使用了以下主要抗体：绵羊/兔子抗TH（1:1000，Pel-Freez Biologicals）、兔子抗Pitx3（1:250，Chemicon）、山羊/小鼠抗Foxa2（1:100，Santa Cruz Biotechnology）、兔子/鸡抗β−TubIII（1:1000、Tuj1、Covance、Princeton、New Jersey）、兔抗GFAP（1:1000；DAKO、Carpintia、CA）、小鼠抗SSEA-4（1:500；DSHB）、小鼠抗Oct4抗体（1:100，圣克鲁斯生物技术）、小鼠抗钙结合蛋白抗体（1:2000，瑞士贝林佐纳斯旺）、兔抗Ki-67抗体（1:1000，加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）、兔防Iba1抗体（1:200，日本大阪Wako）、兔抗Girk2抗体（1:80，以色列耶路撒冷Alomone Labs Ltd）、，小鼠抗hNCAM克隆Eric1（1:100，Santa Cruz Biotechnology），小鼠抗人合成蛋白（1:50，Chemicon）。在光学显微镜下，应用生物素化二级抗体（1:300，Vector Laboratories）检测抗TH和抗hNCAM抗体，然后在链霉亲和素-生物素复合物（Vectastain ABC Kit Elite；Vector Laboratories，载体实验室）中孵育1h，并在3,3′-二氨基联苯胺（DAB，Vectors Laboratory）中孵育可视化。使用蔡司LSM510/Meta工作站（桑伍德）进行共聚焦分析。使用Stereo Investigator图像采集设备和软件（MicroBright-Field）以及蔡司Axioplan I荧光显微镜进行体视学检查。使用Cavalieri估计器探针计算移植物体积。使用误差系数评估探头精度，P<0.05被认为是可以接受的。TH细胞计数⁺用Axioplan显微镜（Zeiss）在20×透镜下对每六个（TH）切片进行神经元检测。使用Abercrombie方法校正连续切片的计数并推断出整个移植物的体积¹⁷在一系列含有移植物的所有可用切片中，在随机场中评估Ki-67/hNCAM、FOXA2/TH和Pitx3/TH的共表达。

等基因食蟹猴诱导多能干细胞的产生

通过活检从4 CM（MF 27-04、MF 25-04、NF 95-06和MF 66-02）中分离出原始皮肤细胞(补充表1). 来自印度尼西亚CM（MF 01）的皮肤成纤维细胞也被用于本研究。H1、H2和H3单倍型的IA类区域仅因信号肽中的一个氨基酸残基不同，该信号肽是从成熟的I类蛋白质中裂解出来的⁸因此，这些I类等位基因被视为功能等效⁸根据我们队列中MHC单倍型频率，我们预测从MF 66-02和MF 95-06生成iPSC将为20%的受体提供完全匹配（MHC相同），为60%的受体提供有利匹配（共享单倍型），为28%的受体提供MHC-I匹配（MHC-I相同）(补充图1). 编码人类KLF4、SOX2、OCT4和c-MYC的转基因通过水泡性口炎病毒糖蛋白（VSVg）-假型Moloney逆转录病毒导入成纤维细胞。感染后第三天，成纤维细胞出现形态学改变，并将其移植到辐照小鼠胚胎成纤维细胞饲养器（MEF）上。感染后6至8周，发现少量具有ESC样形态、核质比高、核仁突出的菌落，并手动挑选(图1A–C). 来自每口井（1×10⁵细胞），获得约5个菌落（0.005%重编程效率）。每7天人工采集一次菌落，其生长速度与人类ESC和人类iPSCs相当。这样的菌落繁殖了20代。为了在体外证明CM-iPSCs的多能性，我们对菌落进行多能性标记染色。所有克隆的Nanog、Oct4、SSEA4、TRA-1–60和TRA-1–81染色均呈阳性(图1D). 菌落碱性磷酸酶（AP）阳性(图1E). CM-iPSCs系在几代中保持了正常的核型(图1F). 使用逆转录病毒转录物特异引物进行的RT-PCR分析表明，病毒转基因完全沉默，内源性位点重新激活(图1G). 微卫星分析证实CM-iPSCs在病毒介导的重编程后保持了亲代成纤维细胞的HLA单倍型(补充图2)。

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图1

食蟹猴iPSC的产生

（A–B）MEF上显示CM-iPSC类ESC形态的相位对比图像。（C）CM iPSC的高倍图像显示高核质比和突出的核仁。（D）多能性标记物Nanog、Oct4、SSEA-4、TRA-1–60和TRA-1–81的免疫荧光染色。（E）CM-iPSC菌落碱性磷酸酶（AP）染色阳性。（F）CM-iPSCs的核型分析（第27-04行，第10代）。CM-iPSCs扩增后保持正常的42，XY核型。（G）定量RT-PCR显示Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc内源性转录物的诱导。四种重编程因子的内源性（黑色）或病毒外源性（红色）编码转录物的特异引物。用四种逆转录病毒（RV-FIB）转导四天后，猴皮肤成纤维细胞被用作病毒转基因表达的阳性对照。通过β-肌动蛋白的平均值对数值进行标准化。数值表示为3个独立实验的平均值+SEM。在每个实验中，hESCs（H9）的值设置为1。比例尺，200µm（A–B，D–E）；20微米（C）。

为了在体内证明多能性，将三种CM-iPSC细胞系（MF 01、MF 27-04、MF 25-04；1×10^6细胞）注射到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠的肾包膜下(补充表2). 所有iPSC株在4-8周内形成畸胎瘤，由所有胚胎胚层发育而成的组织构成，包括腺体和导管（内胚层）、脂肪组织、血管、骨骼肌和平滑肌（中胚层），神经玫瑰花结和色素神经上皮（外胚层）(补充图3)。

食蟹猴诱导的多能干细胞的免疫学特性

接下来，我们对未分化CM-iPSCs及其神经衍生物（包括神经前体（NP）和分化神经元）表面免疫标记物的表达进行了表征。分别使用针对CM HLA-A/B/C和CM HLA-D/DQ/DR的抗体通过流式细胞术分析MHC-I和MHC-II蛋白的表达。使用抗NK受体CD16的抗体分析自然杀伤细胞（NK）。还对人类ESCs（hESCs，H9）的免疫表型进行了分析。我们的分析表明，未分化CM-iPSCs和人类ESCs表达极低水平的MHC-I(补充图4). 未分化细胞上未检测到MHC-II和CD16(补充图4). 然后我们检查了干扰素-γ（IFN-γ）治疗对此类免疫分子表达的影响。γ干扰素是一种促炎细胞因子，属于Ⅱ型干扰素。它在先天性和适应性免疫反应过程中具有多种生物学特性，其中之一是MHC-I和-II蛋白的表达增加。用25 ng/mL IFN-γ处理CM-iPSCs和hESCs。48小时后用流式细胞仪分析MHC-I、MHC-II和CD16的表达。我们的分析表明，在IFN-γ治疗后，CM-iPSCs和hESCs都增加了MHC-I的表达(补充图4). 然而，不同iPSC系之间检测到差异(补充图4). 有趣的是，IFN-γ后MHC-I的增加在hESCs中更为明显(补充图4). IFN-γ在人胚胎干细胞中诱导CD16表达少量增加，但在CM-iPSC细胞中没有。IFN-γ治疗对任何细胞系中MHC-II的表达均无影响(补充图4)。

接下来我们研究了神经元分化是否影响MHC-I、MHC-II和CD16的表达。CM-iPSCs根据基质饲养细胞分化方案进行分化，并进行了一些修改^13,22(图2A). 采集NP[第1阶段，体外日（DIV）27]和完全分化神经元（第2阶段，DIV 42）进行FACS分析。NP和分化神经元表达的MHC-I水平高于未分化细胞(补充图5). 干扰素-γ治疗增加NP和神经元MHC-I的表达(补充图5). 不同品系对干扰素-γ的反应存在差异(补充图5). MHC-II和CD16既不受神经元分化的影响，也不受IFN-γ治疗的影响。

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图2

CM-iPSCs中DA神经元的产生

（A）体外分化方案示意图。（B）图表显示了β-TubIII和TH染色阳性的细胞相对于核Hoechst染色的百分比。数值表示为3个独立实验的平均值+SEM。（C）来自CM-iPSCs（DIV 21）的神经玫瑰花结。（D）来自CM-iPSCs的分化神经元（DIV 42）。（E–F）β-TubIII（绿色）和TH（红色）CM-iPSCs神经元培养物的免疫荧光染色。（G）β-TubIII（绿色）、TH（红色）和Foxa2（蓝色）染色神经元培养物的共焦图像。（H）定量RT-PCR分析分化iPSCs中脑转录因子、DA神经传递标记物（TH、Foxa2、VMAT、ALDH、Nurr1、En1、AADC、Pax6）和Calbindin。从分化的iPSCs中分离出cDNA，并将其值归一化为β-肌动蛋白水平。数值代表平均值+SEM。三个独立实验一式三份。比例尺：50µm（C–D）；20µm（E–G）。

CM-iPSCs体外分化为DA神经元

接下来，我们研究了4个CM iPSC系（MF 01、MF 27-04、MF 25-04和MF 95-06）在体外分化为DA神经元的潜力，使用了我们发表的研究中描述的方案，该方案显示了单性生殖灵长类ESCs产生中脑样DA神经元¹³(图2A). 分化方案（DIV 42）结束时，对培养物进行酪氨酸羟化酶（TH）和神经元特异性III类-β-微管蛋白（β-TubIII）染色⁺)标记DA神经元。CM-iPSCs在DIV 21产生神经玫瑰花结(图2C)DIV 42和DA神经元(图2D-F). 然而，我们发现β-TubIII总量存在一些差异⁺神经元与TH⁺电池（MF 01，β-TubIII⁺34±4.2%，TH⁺2.8±1.3; MF 27-04，β-TubIII⁺35±3.5%，TH⁺5.1±0.9%; MF 25-04，β-TubIII⁺29±2.1%，TH⁺2.5±1.2; MF 95-06，β-TubIII⁺36±1.4%，TH⁺4.9±2.4%) (图2B). 这种变异性与不同人类iPSC系之间的变异性一致²³分化的TH+神经元表达中脑标志物FOXA2(图2G). 定量RT-PCR进一步证实了分化培养物中中脑DA标记的表达水平，如FOXA2、囊泡单胺转运蛋白（VMAT）、钙结合蛋白、醛脱氢酶2（ALDH）、芳香-L-氨基酸脱羧酶（ADDC）和En1(图2H)。

iPSC-derived DA神经元移植入幼年大鼠纹状体

我们最近发现，来自健康受试者和特发性帕金森病患者的人iPSCs在幼年大鼠纹状体移植后存活，并揭示了移植4周后神经元生长和靶向长距离脑区的特定和可复制模式²³因此，利用这种短期体内生物测定来筛选分化的CM-iPSC神经元在移植后存活和投射的能力。如上所述对CM-iPSC进行分化，在DIV 42采集，并将200000个细胞移植到免疫抑制的幼年大鼠的右侧纹状体中（n=7）。移植后4周对大脑进行分析。人类特异性神经黏附分子（hNCAM）的免疫组织化学分析显示所有移植动物的移植物存活(图3A-C). 有趣的是，移植的神经元显示出类似于我们最近描述的人类iPSC-derived神经元的生长模式，即轴突投射到宿主纹状体(图3D)沿着白质束（如胼胝体）进入特定的近距离和远距离灰质靶区(图3E-F)²³电离钙结合适配器分子1（Iba1）的免疫染色显示移植物周围没有小胶质细胞反应(图3G). Iba1是一种在小胶质细胞/巨噬细胞中选择性表达的Ca2+结合肽，参与哺乳动物大脑中的各种致病过程和慢性移植排斥反应²⁴用淋巴细胞标记物CD3抗体进行免疫染色显示没有T细胞浸润。移植后4周未观察到移植物过度生长和肿瘤。为了评估移植物的增殖，我们检测了具有代表性的动物大脑中的Ki-67免疫反应性(图3H). 在移植物中，0.5–3%的细胞为Ki-67⁺表明移植细胞在体内4周内大部分没有增殖。10月4日所有移植物染色均为阴性，显示没有残留的未分化iPSCs(图3H)。

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图3

CM-iPSC衍生神经元移植入幼年大鼠成年纹状体

将CM-iPSCs（MF-01系）分化为DA神经元，并将200000个细胞移植到免疫抑制状态下未受损大鼠的右侧纹状体。移植后4周对移植物进行分析。（A–B）共焦重建人类/灵长类特异性神经细胞粘附分子（NCAM）（绿色）和TH（红色）的典型移植物染色。细胞核用Hoechst复染。（C）移植物放大倍数较低。（D–F）移植后4周，NCAM染色的脑切片的显微照片显示，NCAM+神经元从移植物沿白质束（胼胝体）和大脑皮层向宿主纹状体的轴突生长。（G）hNCAM（绿色）和小胶质细胞标记物Iba1（红色）的免疫染色显示没有小胶质细胞反应。（H）增殖标记Ki-67（红色）和Oct4（绿色）的免疫染色显示移植体内Ki-67+/Oct4-细胞的百分比较低。比例尺：100微米（A–B、D和F-H），200微米（C、E）。

我们要感谢塔娜·布朗、安德鲁·卡图恩、克里斯汀·李、伊丽莎白·马洛和艾莉莎·尤因提供了出色的技术帮助。本研究得到了国防部尤达尔·帕金森病卓越中心拨款P50 NS39793（WX81XWH-11-1-0069）、鲍尔·汉森家族、果园基金会、联合抗衰老基金会以及哈罗德和罗娜·库珀家族对O.I.的资助；博士后研究金HA5589/1-1来自德国老龄研究所（致G.H.），培训奖T32AG000222-17来自国家老龄研究院（致T.O.）。