货物泛素化对多泡体管腔内小泡的形成至关重要

摘要

引言

膜蛋白的溶酶体降解是通过其与泛素（Ub）的结合来介导的，泛素是进入内胚体限制膜上萌发的管腔内小泡（ILV）的分类标记[1–3]。ILV在晚期内体/多泡体（MVBs）中积累，后者与溶酶体融合，从而将泛素化的囊泡结合膜蛋白输送到溶酶体腔中进行降解。ESCRT（运输所需的内体分选复合物）包含一组相互作用的蛋白质复合物，可识别泛素化膜蛋白（Ub-cargo）并促进其分选为ILV。ESCRT-0和ESCRT-I捕获货物并启动ILV的形成，然后ESCRT-II和最终ESCRT-III被招募到ESCRT装置中，以完成囊泡的形成和内体限制膜的裂变。在ESCRT-0、-I和II中发现了多个Ub-binding域（UBD）。单个UBD失活会导致Ub-cargo分选为MVB时出现特定缺陷，而不会损害其他ESCRT功能，例如维持内吞体形态和内吞体与转高尔基体网络（TGN）之间的蛋白质再循环。然而，当多个UBD丢失，或UBD丢失是在突变的背景下发生的，这种突变削弱了ESCRT相互结合的能力，ESCRT途径就会受到更广泛的损害[4–6]。这表明UBD在控制ESCRT活动中起着密切的作用。一种可能的解释是，UBD可能不仅仅是ESCRT收集货物的一种手段，还使Ub-cargo能够与ESCRT进行通信并对其进行管理。因此，Ub-cargo本身可以通过促进或协调ESCRT的组装来积极刺激ESCRT的功能，而不是被动地并入组成的囊泡中。

结果和讨论

为了确定Ub货物是否在ESCRT介导的ILV形成中发挥作用，我们检查了消除内体Ub货物的后果。为此，我们表达了一种显性作用蛋白，其中ESCRT-0亚单位Hse1（哺乳动物STAM的同源物）与疱疹病毒UL36的氘化肽酶结构域的催化域融合，从而形成Hse1-DUb嵌合蛋白(图1A). 我们以前的研究表明，当Hse1-DUb在野生型细胞中表达时，无论是作为Hse1的唯一拷贝还是除了内源性Hse1，它都能在MVB分拣过程中有效地从货物中去除Ub，并阻止各种货物的分拣，而这些货物通常会经历Ub依赖分拣进入MVB ILV[7]。作为进一步测量Hse1-DUb阻止泛素化货物MVB分类的有效性，我们追踪了绿色荧光蛋白（GFP）标记的Ub（GFP-Ub[8]). 早期的研究表明，GFP-Ub可以用作监测多种货物进入MVB路径的交付的代理。例如，野生型细胞在液泡中积累GFP-Ub，而后期作用的Doa4 DUb的丢失，是在MVB货物进入ILV之前清除大部分Ub所必需的，会导致GFP-Ub在液泡内过度积累[8]。正如预期的那样，我们发现GFP-Ub有效地进入了Ub的总库，因为它很容易与多种蛋白质结合(图1B)，它也以加工形式积聚在Pep+细胞的液泡腔中(补充图S1在线）。图1C表明，尽管野生型细胞在液泡中积累GFP-Ub，但表达Hse1-Dub的细胞中GFP-Ub却被排除在液泡之外，这表明多种Ub货物被MVB分拣阻断。重要的是，在表达Hse1 Dub的细胞中，液泡形态是正常的，这与酵母中任何ESCRT基因缺失时观察到的扩大的内体（称为E类区室）的形成形成形成对比。先前的实验还表明，与ESCRT阴性菌株相比，Hse1-DUb的表达不会导致空泡蛋白酶羧肽酶Y（CPY）的分泌，进一步表明内吞系统通常具有功能性[7]。此外，Hse1-DUb不会阻止框架内融合到Ub氨基末端的货物的MVB分拣；在这个方向上，Ub抵抗UL36的羧基末端特异性水解酶活性的去除[7]。为了研究Hse1-DUb是否能在内体内氘化蛋白质，我们分析了GFP-Ub在内体中的分布第4版Δ突变体。AAA-ATP酶Vps4的缺失阻断了ESCRT功能，导致ESCRT和其他内体蛋白在扩大的“E类隔室”内体上积聚[9]。GFP-Ub也聚集在E类内体室第4版Δ细胞，与之前在酵母和哺乳动物细胞中的研究一致，该研究证明了ESCRT功能丧失后泛素化蛋白的积累[8]。在内部表达Hse1-DUb第4版Δ细胞逆转了GFP-Ub在内体中的积累(图1C、D). 值得注意的是，Hse1 DUb的表达并不能抑制由内吞示踪剂FM4-64鉴定的E类内体的形成。这些数据以及使用Hse1-DUb的已发表研究表明，Hse1-DUb是一种有效的工具，可以耗尽内体上的泛素化货物。

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图1

Hse1融合到一种去泛素酶，阻止泛素化蛋白质的MVB分类。(A类)Hse1-DUb融合蛋白示意图，显示了ESCRT-0的Hse1亚基的关键功能域与氘化酶UL36的催化域融合。VHS（Vps27，Hrs，STAM），UIM（Ub-相互作用基序）和SH3（Src-同源性3）。(B类)第四人民党表达空载体（−）或GFP-Ub（+）的Δ细胞生长到对数期，并用三个5分钟脉冲（³⁵球化和裂解前的S-蛋氨酸；然后使用抗GFP抗体对裂解产物进行免疫沉淀。(C类)GFP-Ub在携带整合蛋白的WT细胞或WT细胞中的定位杯1-Hse1-DUb（上部面板）。用CuCl培养细胞₂显微镜检查前7小时。下部面板显示GFP-Ub在第4版Δ有或无Hse1-DUb表达。用脂质结合内吞示踪剂FM4-64对细胞进行反标记（在30°C下30分钟），然后在富培养基中追踪15分钟第4版Δ突变体。比例尺，5μm。(天)275个突变株的E类舱室内体（通过FM4-64的积累鉴定）第4版Δ电池或101虚拟产品4表达Hse1-DUb的Δ细胞与GFP-Ub共定位进行评分。条形代表平均和误差条形s.d.ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；MVB，多泡体；Ub，泛素；WT，野生型。

接下来，我们使用电子显微镜来评估MVB ILV在第四人民党Δ第8天Δ突变酵母细胞(图2). 突变体第四人民党Δ细胞缺乏可溶的液泡水解酶Pep4，不能降解ILV，使其积聚在液泡腔内[10]。Atg8是自噬所需的LC3同源物，缺乏Atg8可以确保所观察到的任何管腔内结构都来自于ESCRT依赖的MVB通路，而不是自噬[11]。这个第四人民党Δ第8天Δ细胞将货物Mup1-GFP正确分类到液泡腔中(图2B). Mup1是一种多面体蛋氨酸转运体，在生长介质中的蛋氨酸作用下，通过Ub依赖性分选进入MVB ILV[12]。表达Mup1-GFP的细胞被球状化，能量耗尽，使电子致密的磷酸盐和金属从液泡内部消散，并嵌入以进行透射电子显微镜检查。正如预期的那样，这些细胞含有丰富的液泡内小泡(图2C). 相反，Hse1-DUb在第四人民党Δ第8天Δ细胞阻断了Mup1-GFP在液泡腔中的积聚，并显著减少了液泡中发现的ILV数量。ILV数量的量化显示，当Hse1-DUb表达时，这些结构实际上不存在(图3A). 此外，低温透射电镜分析证实ILV在第四人民党Δ第8天Δ单元，但不在第四人民党Δ第8天表达Hse1 DUb的Δ细胞(图1D). 正如预期的那样，表达Hse1-DUb的催化失活版本对ILV在液泡中的积累没有影响(图3C). 最后，我们发现Hse1-DUb也耗尽了来自vma4型球形成形前固定的细胞中的Δ突变细胞分析(图3B). 突变体vma4型Δ细胞缺乏V-ATP酶，并且不积累针孔内代谢物，从而模糊了液泡内ILV的可视化[10]。结合不同的电子显微镜方法获得的这些结果支持这样的观点，即Ub-cargo的丢失阻碍了ILV的形成，而不是简单地耗尽蛋白质货物的ILV。

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图2

失去泛素化的货物可消除腔内水泡的生成。(A类)示意图显示了在每个实验组中使用的与Ub融合或不融合的货物形式（Mup1-GFP），以及与UL36 DUb酶融合或未融合的ESCRT-0亚单位Hse1形式。(B类)Mup1-GFP在pep4Δatg8Δ不表达Hse1-DUb或表达Hse1-DUb的细胞。Mup1-GFP-Ub在中的定位第四人民党Δ第8天还显示了ΔHse1-DUb单元（右侧面板）。细胞在富含CuCl的培养基（充满蛋氨酸的YPD）中培养12小时₂.比例尺，5μm。(C类)基于TEM的细胞分析，如B类细胞经球状成形、固定、染色并进行TEM分析。五、 标记M和N。比例尺，1μm。(天)基于冷冻电子显微镜的细胞分析B类.比例尺，1μm。(电子)MVB定位ILV的冷冻电子显微镜图像放大天。比例尺，50纳米。DUb，氘化；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；ILV，腔内小泡；M、 线粒体；MVB，多泡体；N、 细胞核；透射电镜；Ub，泛素；五、 液泡。

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图3

额外的泛素化货物补充了ILV的积累。(A类)中描述的TEM实验的形态计量分析图2C。通过计算24个野生型细胞、52个表达Hse1-DUb的野生型细胞和36个同时表达Hse1-DUb和Mup1-GFP-Ub的野生细胞液泡内的ILV，计算出ILV的平均数量（每个细胞每段）。误差棒=s.d.通过测量野生型细胞中的329个ILV和共表达Hse1-DUb和Mup1-GFP-Ub的细胞中的333个ILV，计算平均囊泡大小。误差线=s.d(B类)的TEM图像vma4型Δ细胞有和没有Hse1-DUb表达。在球状成形、包埋和电镜分析之前固定细胞。(C类)单独表达Mup1-GFP-Ub或表达Mup1-GFP和Hse1-dub的WT细胞的荧光定位和TEM分析^*其中DUb携带失活突变，表达Hse1-DUb（活性）的细胞与Ste3-GFP-Ub或Ub-GFP-Cps1共存。DUb，氘化；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；ILV，腔内小泡；透射电镜；Ub，泛素；五、 液泡。

如果Hse1-DUb通过消除Ub-cargo而不是干扰ESCRT功能的其他方面来阻止ILV的形成，那么表达对Hse1-DUb氘化有抵抗力的货物应恢复ILV的生成。图2表明Mup1-GFP-Ub融合于Ub的N末端，正常分选到Hse1-DUb表达细胞的空泡腔中。由于DUb结构域（UL36）是一种Ub C末端水解酶，因此Mup1-GFP-Ub中Ub的取向对Hse1-DUb的裂解免疫。透射电镜和冷冻电镜均显示，Mup1-GFP-Ub的表达恢复了Hse1-DUb表达细胞内ILV的积累。定量分析表明，引入抗DUb的货物在很大程度上恢复了ILV的数量，ILV的平均直径与野生型细胞中的ILV相同(图3A). ILV也通过表达其他DUb-resistant Ub-cargo（包括Ste3-GFP-Ub和Ub-GFP-Cps1）恢复到Hse1-DUb表达细胞，这表明Ub-cargo的作用不仅限于基于Mup1的融合蛋白(图3C). 总之，这些结果表明Ub-cargo在ILV编队中起着至关重要的作用。此外，它们意味着通过MVB途径的流量可以通过提供更多的Ub货物在很大程度上进行调节。

ILV的形成依赖于Ub-cargo的存在，这表明货物和ESCRT设备内的UBD之间可能存在相互作用，这有助于将分拣机械组织成生产路径。这种相互作用的作用可能是稳定内胚体上的ESCRT，直到它们开始形成囊泡的后期阶段。为了检验这种可能性，我们评估了消除Ub-cargo是否改变了ESCRT向内胚层膜募集的程度。在野生型细胞中，GFP标记的ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II亚基定位于点状结构，与其公认的内体功能一致(图4A). GFP标记的ESCRT亚单位都是功能性的，当它们作为各自亚单位的唯一拷贝存在时，它们介导MVB排序和适当的CPY排序(图5A、B). Hse1-DUb表达将ESCRT-I（用Vps23-GFP和Vps28-GFP可视化）和ESCRT-II（用Vps 22-GFP及Vps36-GFP显示）的分布转移到细胞液中。然而，Hse1-DUb并没有改变ESCRT-0的分布，这进一步证明了Hse1-DUb的活性集中在内体上。值得注意的是，Mup1-RFP-Ub（一种非氘化物）的表达恢复了ESCRT-I和ESCRT-II的内胚体定位(图4A).

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图4

Ub-cargo对内吞体ESCRT定位的影响。(A类)GFP标记的ESCRT-0（Vps27）、ESCRT-I（Vps 23和Vps 28）和ESCRT-II（Vps 22和Vps36）亚单位在缺乏或存在Hse1-DUb的野生型细胞中的定位。细胞在存在CuCl的最小培养基中生长₂在显微镜检查之前保持7小时。还描述了GFP标记的ESCRT在共表达Mup1-RFP-Ub的Hse1-亚表达细胞中的定位（右侧柱）。比例尺，5μm。(B类)GFP标记的ESCRT亚单位在第4版Δ细胞中是否存在Hse1-DUb表达。比例尺，5μm。DUb，氘化；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；Ub，泛素；WT，野生型。

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图5

GFP标记ESCRT的功能和功能建模。(A类)对WT细胞或表达GFP标记的ESCRT亚单位的细胞进行分析，将其作为该蛋白的唯一来源，以便将Sna3-RFP的MVB正确分拣到液泡内部。还显示了对缺乏Vps28-GFP和Vps36-GFP细胞的相同分析虚拟产品4. (B类)CPY是从细胞内和分泌的细胞外部分进行免疫沉淀的，这些部分来自脉冲标记的细胞³⁵S-蛋氨酸10分钟，在30°C下追逐50分钟。(C类)Ub-cargo如何推动ESCRT招募或保留以及后续ILV形成的模型。在没有货物的情况下，ESCRT迅速从内体中回收，无法形成生产复合物。在有货物的情况下，ESCRT得到更好的保留，使其能够正确组织并完成ILV的形成，同时将Ub-cargo分类到这些囊泡中。羧肽酶Y；E、 细胞外；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；一、 细胞内；ILV，腔内小泡；MVB，多泡体；RFP，红色荧光蛋白；Ub，泛素；WT，野生型。

ESCRT在膜上和膜外循环的能力取决于Vps4，这是一种AAA-ATP酶，可以分解从ESCRT-III亚单位形成的膜结合聚合物。Vps4的损失基本上将ESCRT锁定在它们积聚的膜上。接下来，我们评估了Vps4活性的阻断是否仍然会导致ESCRT积聚到表达Hse1-DUb的细胞的内体上。图4说明了这一点第4版Δ突变体按预期在内胚体上积累GFP标记的ESCRT-I和ESCRT-II亚基。此外，ESCRT仍在第4版Δ内体，即使表达Hse1-DUb(图4B)尽管发现Ub-cargo没有在这些内体上积聚(图1C).

Hse1-DUb消除了Ub-cargo，导致了ILV累积的损失，再加上在表达DUb-resistant Ub-cargo后ILV的恢复，有力地证明了ILV的形成需要Ub-cardo。我们的检测检测到液泡腔内存在ILV，它们在缺乏活性液泡蛋白酶的野生型细胞中正常积累。重要的是，Hse1-DUb不会干扰内吞途径的其他方面，包括液泡和内吞体形态或可溶性液泡水解酶的分类。因此，液泡中ILV的丢失表明了内体中ILV形成的缺陷，而不是内体无法将其内容物输送到液泡。酵母中任何ESCRT的缺失都会导致多种表型，其中不仅包括ILV形成的缺失和Ub-cargo的MVB分类，还包括积累循环蛋白（例如Kex2和Vps10）的大的异常内体以及真空膜蛋白（例如V-ATP酶复合物）的积累。目前尚不清楚这些表型如何相互关联；然而，Hse1-DUb表达在MVB排序和ILV生成中引起的严重缺陷，没有在ESCRT空突变体中观察到的其他伴随缺陷，这表明这些表型可以分离，并表明它们代表ESCRT的不同功能。我们还发现Hse1-DUb没有抑制E类虚拟专用交换机'表型，当表达于第4版Δ细胞，即使Hse1-DUb能够有效去除泛素化蛋白，否则泛素化蛋白质会积聚在扩大的E类内胚体室中。因此，ESCRT突变体的异常内体功能似乎不是由泛素化蛋白的积累所驱动的，泛素化蛋白质的积累可能由调节内体成熟的因子所感知。

Ub-cargo明显促进ESCRT与膜的结合。一种可能性是，在没有货物的情况下，ESCRT永远不会与内体结合。或者，ESCRT可能只是在没有货物的情况下快速回收膜，无法稳定地结合，导致产生ILV。我们赞成后一种模式(图5C)由于Hse1-DUb表达细胞中的ESCRT仍然可以被捕获到内胚体中，而Vps4的丢失阻止了ESCRT的释放。我们的发现是，需要Ub-cargo将ESCRT招募到内吞体中，这意味着ESCRT本身之间的相互作用以及ESCRT和cargo之间的相互影响协同工作，以创建丰富的内吞体亚结构域，随后形成ILV。然而，他们并不排除Ub-cargo可能在配置和/或激活ESCRT设备以触发囊泡形成方面发挥更积极作用的可能性。此外，ILV在没有Ub货物的情况下消失，这表明很少（如果有的话）将Ub独立货物归类为ILV。我们的研究结果也对除ILV以外的运输囊泡的生物发生有意义。许多体内和在体外研究表明，货物丰度影响COPI、COPI和氯氰菊酯包被囊泡的组装动力学[13–15;. 从概念上讲，所有运输囊泡生物发生的机制都有一个共同的反馈机制，以防止空囊泡的形成和积累，这是不言而喻的。因此，这里揭示的ILV生物生成中对Ub-cargo的严格要求，以及货物和囊泡涂层机械协作的需要，可能是各种囊泡运输步骤的基础。

方法

描述了酵母菌株和质粒(表1和​和2）。2). 用于电子显微镜分析的细胞在含有100μM CuCl的富酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中生长₂，在2%的NaN存在下球形_三并固定在2%戊二醛和100 mM碳酸钠中[4]。细胞用钌红和四氧化锇染色，包埋、切片并用柠檬酸铅/醋酸铀酰染色，或冷冻在2.3 M蔗糖中，切片并用醋酸铀酰着色。在Hse1-D亚表达中也进行了电子显微镜分析vma4型使用前面描述的电子显微镜程序的Δ细胞[10,18]。存在和不存在Hse1-DUb时ESCRT的定位（由CUP1大学启动子）在携带VPS27系列-绿色荧光粉低拷贝表达质粒，或GFP在细胞中稳定整合在VPS22系列,VPS23、VPS28或虚拟专用交换机36根据所述方法的开放阅读框[19]。制作Vps27-GFP蛋白，使Vps27的最后25个残基是GFP的C末端，以便与氯氰菊酯结合。为了观察ESCRT-GFP，细胞生长在最小的培养基中，盖在玻璃载玻片上，并在激发光照射的前3 s拍摄照片，以避免光漂白。如前所述，通过脉冲/追逐免疫沉淀法测量新合成的CPY的分泌[4].

补充信息EMBO提供报告联机(http://www.emboreports.org).

补充材料

致谢

脚注

工具书类