摩尔药理学。2012年3月；81(3): 356–365.
用新型丝氨酸类似物确定丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白2（ASCT2）配体的底物和阻断剂活性
纽约宾厄姆顿宾厄姆敦大学化学系
通讯作者。通信地址：Christof Grewer博士，宾厄姆顿大学化学系，地址：4400 Vestal Parkway East，Binghamton，NY 13902，电子邮箱：ude.notmahnib@rewergc 2011年9月8日收到；2011年11月23日接受。
摘要
中性氨基酸转运蛋白丙氨酸-半胱氨酸转运蛋白2（ASCT2）属于溶质转运蛋白的溶质载体1（SLC1）家族，可跨膜转运小的中性氨基酸，包括生理上重要且普遍存在的氨基酸谷氨酰胺。由于缺乏对其药理学的了解以及缺乏高亲和力抑制剂，我们对ASCT2参与谷氨酰胺的生理过程的理解受到了阻碍。在本研究中，我们将电子对接方法与结合参数的实验研究相结合，以开发新的ASCT2抑制剂和底物，一系列丝氨酸酯，并确定控制其功能效应的结构参数。该系列化合物是使用标准方法合成的，具有从抑制剂到部分底物和全底物的一系列性质。我们的结果表明，侧链体积小、侧链疏水性低的氨基酸衍生物与结合位点的闭环形式强烈相互作用，其中重入环2（底物结合位点的假定细胞外门）被关闭。然而，这些衍生物与开环形式（外门向细胞外侧开放）结合较弱，充当转运底物。相反，抑制剂优先与开环形式结合。侧链中的芳香残基是高亲和力相互作用所必需的。其中一种化合物我-丝氨酸酯-丝氨酸联苯-4-羧酸盐可逆抑制ASCT2功能，表观亲和力为30μM。
材料和方法
细胞培养和转染
大鼠ASCT2的cDNA编码由S.Bröer（德国杜宾根大学生理研究所）善意提供(Bröer等人，1999年;Bröer等人，2000年). cDNA的编码区被亚克隆到pBK-CMV载体的EcoRI位点（Stratagene，La Jolla，CA）。根据供应商的指示，使用cDNA构建物用FuGENE HD试剂（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）瞬时转染亚流人类胚胎肾（HEK）293细胞（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收集中心）。转染后第1天和第2天进行电生理记录。
电生理技术
在电压灯条件下，用Adams和List EPC7放大器（德国兰姆勒支HEKA）记录ASCT2介导的电流。使用了全细胞电流记录配置(Hamill等人，1981年). 电极电阻为2至3 MΩ，串联电阻(对S公司)为5至8 MΩ。串联电阻没有得到补偿，因为补偿对观测电流的大小没有影响。细胞外液含有140 mM甲磺酸钠（NaMes）或硫氰酸钠，2 mM Mg（GlcA）2，2 mM钙（GlcA）2和10 mM HEPES，用NaOH调节pH至7.4。移液管溶液含有130mM硫氰酸钠、2mM氯化镁210 mM EGTA、10 mM HEPES和10 mM我-丙氨酸（用NaOH调节pH至7.3）。使用这种细胞内溶液，转运蛋白在交换模式下运行，在这种模式下，在没有净转运的情况下，外部丙氨酸与内部丙氨酸交换。交换模式与未偶联阴离子电流的激活有关，该电流被用作ASCT2功能的检测。电流在3 kHz下进行低通滤波（EPC7内置滤波器），并使用数字化板（Digidata 1200；Molecular Devices，Sunnyvale，CA）以10至50 kHz的采样率进行数字化（由软件pClamp7控制）。所有实验均在室温下进行。
快速溶液交换基本上如前所述(Grewer等人，2000年;Watzke等人，2001年). 简言之，将底物和抑制剂应用于ASCT2表达的HEK293细胞，石英管（350-μm管直径）位于距细胞约0.5 mm的位置。从管子开口处流出的溶液的线性流速约为5至10 cm/s，导致全细胞电流的典型上升时间为30至50 ms（10–90%）。
数据分析
使用Origin（OriginLab Corp，Northampton，MA）或Clampfit（pClamp8软件；Molecular Devices）对实验数据进行非线性回归拟合。电流的剂量-反应关系用一个类似Michaelis-Menten的方程拟合，得出K（K）米和我最大值。每个实验用至少两个不同的细胞进行三次。除非另有说明，误差线代表平均值±S.D。
合成
所有化学品均购自VWR。根据以下程序制备化合物。
(S公司)-3-(第三种-丁氧基）-2-((第三种-丁氧羰基）氨基）-3-氧丙基环己烷羧酸盐（1b）。
在圆底烧瓶中，N个-丁氧羰基丝氨酸第三种-将丁酯（0.2 g，0.765 mmol）溶解于二氯甲烷中。环己烷酰氯（1a）然后与4-二甲氨基吡啶（9.3 mg，0.0765 mmol）和三乙胺（0.133 ml，0.956 mmol）一起添加。将反应搅拌过夜。第二天，用二氯甲烷蒸发混合物，用冰镇2 M盐酸萃取一次，用碳酸氢钠萃取两次，用盐水萃取一次。有机层通过一个装满硫酸镁的玻璃Büchner漏斗干燥。使用乙酸乙酯/二氯甲烷（1:20）通过柱色谱纯化材料。1核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl三)：5.3（s，1H），4.45（d，2H），2.53（m，1H，1.92至1.11（m，5H），1.44（s，18H）。
(S公司)-第三种-丁基-3-（2-（9H（H）-芴-3-基）乙酰氧基）-2-((第三种-丁氧羰基）氨基）丙酸酯（2b）。
丝氨酸酯(2亿)使用175 mg（0.765 mmol）的9H（H）-芴-2-羰基氯(2a个). 丝氨酸酯的纯化采用二氯甲烷/乙酸乙酯溶剂体系（10:1）通过柱层析进行。1核磁共振氢谱（300兆赫，CDCl三)：8.21（s，1H），8.05（d，1H。2厘米:1核磁共振氢谱（300 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.95至8.56（s，3H），8.37（s，1H），8.55至8.05（m，3H。
(S公司)-3-(第三种-丁氧基）-2-((第三种-丁氧羰基）氨基）-3-氧代丙基-2-萘甲酸酯（3b）。
丝氨酸酯(3亿)使用146 mg（0.765 mmol）2-萘酰氯制成(3a年). 使用二氯甲烷/乙酸乙酯（19:1）溶剂系统通过柱色谱进行纯化。1核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl三)：8.55（s，1H），8.05至7.81（m，4H），7.55（m，2），5.42（d，1H。3立方厘米:1核磁共振氢谱（300MHz，二甲基亚砜-d6)：8.91至8.62（s，3H），8.23至8.03（m，5H），7.85至7.71（m，2H），4.89至4.55（m，3H。
(S公司)-第三种-丁基-2-(第三种-丁氧羰基）氨基）-3-（异丁酰氧基）丙酸酯（4b）。
丝氨酸酯(4b个)以相同的方式制备，使用67 mg异丁酰氯（0.765 mmol）(4a类). 使用二氯甲烷/乙酸乙酯（1:1）溶剂系统使用柱色谱纯化油。1核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl三)：5.27（d，1H），4.49至4.15（m，3H），2.53（septet，1H，1.45（s，18H），1.16（d，6H）。
(S公司)-3-(第三种-丁氧基）-2-((第三种-丁氧羰基）氨基）-3-氧丙基[1,1′-联苯]-4-羧酸盐（5b）。
丝氨酸酯的制备方法与(3亿)，使用0.17 g[1,1′-联苯]-4-羰基氯（0.765 mmol）(5a级). 用于柱色谱的溶剂系统为二氯甲烷/乙酸乙酯（7:3）。1核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl三)：8.42至7.40（m，9H），5.51至5.48（s，1H），4.72至4.52（m，2H），3.97至3.83（m，1H，1.68至1.39（s，18H）。
(S公司)-第三种-丁基-2-(第三种-丁氧羰基）氨基）-3-（丙酰氧基）丙酸酯（6b）。
向溶解于二氯甲烷中的丙酸（51.45 mg，0.695 mmol）溶液中添加第三种-丁基2-((第三种-丁氧羰基）氨基）-3-羟基丙酸酯（0.2 g，0.765 mmol），N个,N个′-二环己基碳二亚胺（0.16 g，0.765 mmol）和4-二甲氨基吡啶（8.5 mg，0.0695 mmol）。将混合物在圆底烧瓶中磁力搅拌过夜。将反应混合物过滤掉N个,N个′-二环己基脲，滤液用水萃取三次，用5%柠檬酸在水中萃取三次，用水萃取三次。用二氯甲烷稀释有机层，然后用硫酸镁在Erlenmeyer烧瓶中磁力搅拌过夜，以去除微量水分。然后过滤有机层并蒸发。使用柱色谱纯化得到的黄色油。所使用的溶剂体系是二氯甲烷/乙酸乙酯（1∶10）。1核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl三)：5.28（d，1H），4.45（d，2H），4.25（m，1H），2.34（q，2H），1.45（s，18H），1.11（t，3H）。
(S公司)-1-羧基-2-（（环己烷羰基）氧基）乙胺）三（2,2,2-三氟乙酸）（1c）。
将二氯甲烷/三氟乙酸（1:10）的混合物添加到含有1亿.将混合物磁力搅拌3 h，然后蒸发三氟乙酸和二氯甲烷以生成脱保护产物三.1核磁共振氢谱（360 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.51（秒，3H），4.42（米，2H），4.15（米，1H），2.55至1.15（米、5H）。
其余化合物(2厘米–第6页c)以与1c个:
单声道((S公司)-2-(((9H（H）-芴-2-羰基）氧基）-1-羧基乙胺）三（2,2,2-三氟乙酸酯）(2厘米)1核磁共振氢谱（300 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.85至8.45(秒，3H），8.35至7.31（m，7H），4.85至4.47（m，3H，4.23至3.91（s，2H）
(S公司)-2-（（2-萘酰）氧基）-1-羧基乙胺）三（2,2,2-三氟乙酸）(3立方厘米)1核磁共振氢谱（300 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.83至8.54（3H）、8.21至7.64（m，7H）、4.82至4.51（m，3H），
(S公司)-1-羧基-2-（（异丁酰氧基）乙醇胺）三（2,2,2-三氟乙酸）(4c类)1核磁共振氢谱（300 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.62至8.43（s，3H），4.35（m，3H”），2.56（隔膜，1H），1.12（s，6H），
(S公司)-2-（（（[1,1′-联苯]-4-羰基）氧基）-1-羧基乙胺）三（2,2,2-三氟乙酸酯）(5厘米)1核磁共振氢谱（300 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.81至8.62（s，3H），8.21至7.33（m，9H），4.83至4.68（m，2H），4.62至4.50（m，1H），
(S公司)-1-羧基-2-（（丙酰氧基）乙醇胺）三（2,2,2-三氟乙酸）(第6页c)1核磁共振氢谱（300 MHz，二甲基亚砜-d6)：8.53至8.45（s，3H），4.63至4.27（m，3H。
结果
在硅对接研究中，预测基底和抑制剂的开环或闭环偏好。
为了预测与具有合理亲和力的ASCT2氨基酸结合位点相互作用的配体的结构，我们使用了配体锁定方法。对接模板是基于同源古天冬氨酸转运体Glt的晶体结构的ASCT2同源模型酸碱度(Yernool等人，2004年;Boudker等人，2007年). 尽管ASCT2和Glt之间的总体一致性酸碱度序列低（30%同源，50%相似），氨基酸结合位点（结合配体4-Å距离内的残基）非常保守，69%同源，85%相似。事实上，只有两条参与配体结合位点的侧链不保守，即Cys479（对应于Glt中的Arg397酸碱度)和Ala402（对应于Glt中的Thr314酸碱度). 跨膜结构域8中的精氨酸-半胱氨酸替代被认为是两种转运蛋白不同底物选择性的主要原因(Bendahan等人，2000年). 在Glt中酸碱度，Arg397带正电荷的侧链与天冬氨酸的β-羧酸盐形成盐桥(Yernool等人，2004年). ASCT中没有这种静电相互作用，这是因为它们倾向于结合中性氨基酸底物。
为了测试对接方法，我们首先使用已知的天冬氨酸结合的Glt晶体结构进行了控制对接研究酸碱度作为模板[PDB ID2NWX公司(Boudker等人，2007年)]. 在Autodock Vina中使用一个以C为中心的15立方盒进行对接β结合天冬氨酸分子的原子。对接算法找到了五个姿势，但只有一个姿势（束缚自由能最低的姿势0；)显示了αNH的正确方向三+和首席运营官−组。此姿势如所示A、 与晶体结构中的天然天冬氨酸配体重叠（根-平方偏差=0.73）。预测姿势和实验姿势的微小差异是由β-羧酸盐的位置略有改变引起的(A） ，而αNH的结合位置三+和首席运营官−群体保存完好。总的来说，该分析表明对接过程能够检测EAAT蛋白中结合配体的物理相关构象。
表1
使用Autodock Vina对接获得的ASCT2底物和抑制剂参数
| ASCT2同源模型
| Δ克（2NWX）/Δ克（2NWW） |
|---|
基于2NWX公司
| 基于2西北偏西
|
|---|
| 评估姿势的数量 | 带有天然α-NH的姿势数量2，首席运营官 | Δ克 | 评估姿势的数量 | 天然α-NH的姿势数2，咕咕 | Δ克 |
|---|
| | | 千卡/摩尔 | | | 千卡/摩尔 | |
| 丝氨酸 | 9 | 1 | −4.3（姿势4） | 5 | 2 | −3.7（姿势1） | 1.16 |
| 天门冬氨酸 | 9 | 1 | −4.5（姿势8） | 5 | 2 | −4.1（姿势3） | 1.10 |
| 谷氨酰胺 | 9 | 1 | −5.4（姿势2） | 5 | 2 | −4.4（姿势3） | 1.23 |
| -乙基(第6页c) | 5 | 1 | −5.8（姿势0） | 5 | 4 | −4.7（姿势0） | 1.23 |
| -异丙基(4c类) | 5 | 1 | −5.7（姿势2） | 8 | 2 | −4.3（姿势5） | 1.33 |
| -环己基(1c个) | 9 | 1 | −3.8（姿势0） | 9 | 4 | −5.3（姿势1） | 0.72 |
| -Bzl-Ser公司 | 9 | 2 | −4.6（姿势0） | 7 | 4 | −5.2（姿势1） | 0.88 |
| -萘基(3立方厘米) | 5 | 0 | | 7 | 三 | −6.1（姿势5） | |
| -联苯(5厘米) | 9 | 0 | | 9 | 2 | −6.6（姿势6） | |
| -芴(2厘米) | 6 | 0 | | 8 | 2 | −6.4（姿势5） | |
| 天冬氨酸转运体 | | | | | | | |
| 天冬氨酸盐 | 5 | 1 | −5.5（姿势0） | 5 | 1 | −4.3（姿势2） | 1.28 |
A、 Glt天然天冬氨酸配体的叠加酸碱度
2NWX公司结构（粉红色配体）我-Autodock Vina预测的天冬氨酸复合物（基于2NWX公司，绿色配体）。B、 叠加我-Ser（绿色）和我-Asn（黄色）配体与ASCT2（2NWX）同源性模型（灰色结构）对接。具有结合配体的GltPh2NWX结构；Asp（粉红色），显示为绿松石色。距离配体4Å的氨基酸侧链突出显示为线条。
然后，我们使用对接方法预测中性氨基酸衍生物与ASCT2的相互作用。我们使用了两个基于模板2NWX的独立同源模型，[称为ASCT2（2NWX）]和2NWW[称为AST2（2 NWW）](Boudker等人，2007年). 前者表示子态-束缚构象（闭合再入环，RL2；称为闭环形式)，而后者被认为更能代表转运体的无底物、载脂蛋白状态[开放RL2，称为开环形式(Boudker等人，2007年;Huang和Tajkhorshid，2008年)].我-天门冬氨酸是一种特性良好的转运底物，由于其与结合在Glt上的天门冬酰胺分子高度同源，首次被使用酸碱度模板。仅以αNH的自然方向摆姿势三+和首席运营官−对各组进行评估[其中一组为Asn，闭合RL2，ASCT2（2NWX）；]. 此姿势如所示B、 叠加在结合到Glt的天冬氨酸分子上酸碱度模板和对接丝氨酸配体。与闭环构象相比，天冬酰胺与开环构象的相互作用较小[五种姿势中的两种，开放RL2，ASCT2（2NWW）；]，在Glt中酸碱度已知为抑制剂结合形式[配体为数字图书馆-苏氨酸-β-苄氧基天冬氨酸（TBOA）]。在天然底物中观察到类似的效果我-谷氨酰胺和我-丝氨酸()据预测，谷氨酰胺与闭环形式的结合要比与开环形式的结合强一个数量级。
为了测试氨基酸底物侧链的改变对对接行为的影响，我们产生了具有不同取代基的丝氨酸衍生物，通过酯键与丝氨酸羟基连接（新化合物的结构如以及一些常见氨基酸底物）。乙基(第6页c)，异丙基(4c类)，和环己基(1c个)Autodock Vina可以将衍生物模拟为闭环结构的配体结合位点。应该注意的是，环己基(1c个)衍生模型结合亲和力得分低（Δ克=−3.8千卡/摩尔；). 带有较大芳香取代基[萘基]的丝氨酸衍生物(3立方厘米)和芴基(2厘米)]以闭环形式从绑定位置排除()，根据取代基的大小。相比之下，萘和芴衍生物模型与开环形式的结合得分较高，而具有异丙基取代基和较小侧链的化合物在这种结合构型中得分较低(). 苄基丝氨酸与开环形式结合的姿势之一（具有正确αNH的四个姿势中的两个姿势三+和首席运营官−组方向）如所示、A和B叠加在TBOA结合Glt上酸碱度结构，2NWW(Boudker等人，2007年). 很明显，与TBOA相比，苄基丝氨酸中芳香基团的取向略有不同，这可能是因为缺失的β-羧酸盐缺乏盐桥相互作用。
总结了本研究中使用的氨基酸底物和抑制剂的结构，并总结了合成程序。
A、 Glt天然TBOA配体的叠加酸碱度
2西北偏西结构（绿松石配体）我-Autodock Vina预测的Bzl-Ser复合物（姿势5）（基于2西北偏西同源模型，灰色配体）。B、 预测抑制剂结合位点的表面表征。
正如将在下一节中讨论的那样，我们的实验结果表明，与闭环形式结合得分高，而与开环形式结合得分低的化合物是底物，而对开环而非闭环结合具有相反偏好的化合物是抑制剂。为了量化这种底物/抑制剂偏好，Δ克（2NWX模型）/Δ克（2NWW型号）比率列于（最后一列）。比率低于1的化合物被预测为抑制剂，而比率>1的化合物被预测为底物。
对接结果的实验分析。
我们的下一个目标是合成对接研究预测的化合物并分析其生物活性。根据标准程序通过冷凝αNH进行合成2和使用二环己基碳二亚胺方法用取代基羧酸保护的COOH丝氨酸(Sheehan等人，1956年)或酸性氯化物()然后对氨基酸进行脱保护。测试了这些化合物在HEK293细胞中异源表达的ASCT2中激活阴离子电流或抑制泄漏阴离子电流的能力。先前的研究表明，转运体介导的阴离子电流可以用来测量转运活性(Bröer等人，2000年;Grewer和Grabsch，2004年). 这一事实对于同源谷氨酸转运体也得到了很好的证实(Watzke和Grewer，2001年)具有更严格的药理学(Shimamoto等人，1998年;Bridges等人，1999年;Dunlop等人，2003年;Bridges and Esslinger，2005年;Dunlop和Butera，2006年;Luethi等人，2010年). 转运电流不能用作ASCT2底物/抑制剂功能的分析，因为ASCT2是氨基酸交换器，因此不能观察到稳态转运电流(Zerangue和Kavanaugh，1996年;Bröer等人，2000年). 然而，我们的结果表明，抑制剂阻止了由跨膜转运底物的电压依赖性运动诱导的电荷运动（未显示），这表明阴离子电流分析反映了交换活性。
已知转移的底物在应用于ASCT2时会诱发阴离子电流(Bröer等人，2000年;Grewer和Grabsch，2004年)，如所示A代表我-丙氨酸。虽然乙酰丝氨酸酯(第6页c)是一种全底物，引发的阴离子电流与丙氨酸（异丁酯）的阴离子电流大小相同(4c类)取代基体积越大，疏水性越强，部分底物的丙氨酸诱导电流最大值为26±10%（饱和浓度下；B类；). 活化底物的动力学特性，包括其表观K（K）米根据剂量反应曲线估算的值(B） ，列在中.丝氨酸环己烷羧酸盐的应用未诱发可测量的阴离子电流(1c个)至ASCT2（高达5 mM），表明该化合物在测试浓度下不与ASCT2结合，或其结合但不是活化底物。前一种可能性更大，因为1c个在高达2mM的浓度下不能抑制由ASCT2丙氨酸交换介导的丙氨酸诱导的内向阴离子电流（数据未显示）。
A、 在灰色条指示的时间和浓度下，将全部和部分底物应用于ASCT2所引发的内向阴离子电流的原始痕迹。减去基线电流。膜电位为0mV，细胞内溶液含有10mM丙氨酸和135mM NaSCN。细胞外溶液含有140 mM NaMes。B、 两种基质的剂量响应曲线（■，4c类，异丙基-；○,第6页c，乙基-）。实线表示根据Michaelis-Menten方程进行的拟合。
表2
ASCT2底物和抑制剂的动力学特性
列出了的所有值V（V）米=0 mV。列出了与丙氨酸饱和浓度引起的阴离子电流相关的电流。
| K（K）米 | 相对电流 |
|---|
| μM（M） | |
| 我-丙氨酸 | 40 ± 6 | 1 |
| 我-谷氨酰胺 | 25 ± 1 | 0.98 ± 0.04 |
| -乙基(第6页c) | 280 ± 30 | 1.1 ± 0.06 |
| -异丙基(4c类) | 4700 ± 500 | 0.26 ± 0.1 |
| -环己基(1c个) | 未注明。 | 0 |
| -Bzl-Ser公司 | 900 ± 400 | −0.27 ± 0.1 |
| -萘(3立方厘米) | 107 ± 29 | −0.22 ± 0.03 |
| -联苯(5厘米) | 30 ± 6 | −0.43 ± 0.07 |
| -芴(2厘米) | 40 ± 12 | −0.29 ± 0.04 |
接下来，我们测试了对接研究中预测为抑制剂的化合物。与运输的底物相反，抑制剂的应用在表达ASCT2的HEK293细胞中介导了明显的外向电流（代表性的原始痕迹如A） ●●●●。先前的研究表明，这种外向电流是由向内泄漏的阴离子电流受到抑制引起的(Grewer和Grabsch，2004年)与竞争性抑制剂TBOA抑制同源谷氨酸转运体（EAAT）的结果一致(Grewer等人，2000年,2005). 表观外向电流是剂量依赖性的，可以用Michaelis-Menten型方程进行分析(B） ，屈服K（K）米中列出的值.抑制剂在饱和浓度下诱导的最大电流(我最大值值）为最大丙氨酸诱导电流的−25至30%，表明ASCT2的泄漏阴离子电导携带大约30%的底物诱导阴离子电导电流，与先前获得的苄基丝氨酸的结果一致(Grewer和Grabsch，2004年). 表观亲和力最高的抑制剂是联苯丝氨酸酯(5厘米)，带有K（K）米30±6μM。这种亲和力明显高于任何已知的ASCT2抑制剂(Grewer和Grabsch，2004年;Esslinger等人，2005年).
A、 在灰条指示的时间和浓度下，应用丙氨酸引起的向内阴离子电流的原始迹线（左迹线）和应用抑制剂抑制ASCT2的泄漏阴离子电流。减去基线电流。膜电位为0 mV，细胞内溶液含有10 mM丙氨酸和135 mM NaSCN。细胞外溶液含有140 mM NaMes。B、 两种抑制剂的剂量反应曲线(2厘米和3立方厘米). 实线表示根据Michaelis-Menten方程进行的拟合。C、，3立方厘米抑制对200μM丙氨酸的电流响应（如A中的离子条件）。D、 抑制常数，K（K）我，用于丝氨酸联苯-4-羧酸盐(5厘米)不同浓度的丙氨酸。根据等式1。显示的两行反映了K（K）米测定丙氨酸。E、 在两种抑制剂存在的情况下抑制电流(5厘米)和丙氨酸（此处显示200μM丙氨酸），方程2用于拟合数据。
为了测试抑制剂是否不仅阻断泄漏阴离子电流，还抑制运输底物的活性，我们在丙氨酸（200μM）存在下使用了这些化合物。如代表性结果所示从C到E，3立方厘米完全抑制丙氨酸诱导的反应，即使在有活性底物的情况下也会产生泄漏电流阻塞(C） ●●●●。化合物5厘米进行了更详细的评估，如中所示、D和E。外观K（K）我随着丙氨酸浓度的增加而增加，正如竞争机制所预期的那样。这个K（K）我-根据计算的versus-alanine浓度关系等式1
与实验数据吻合良好，表明存在竞争抑制机制。在这个方程式中，[S]是底物（丙氨酸）的浓度K（K）我（0）是在没有丙氨酸的情况下丝氨酸联苯-4-羧酸盐的抑制常数。
在这个方程式中我最大值表示在缺乏丙氨酸的情况下，仅抑制剂的电流，以及K（K）我是抑制剂在丙氨酸存在下的抑制常数。
抑制剂解离动力学。
我们使用快速溶液交换协议来确定萘酯的离解，3立方厘米策略是用抑制剂预平衡细胞，然后快速进入含有饱和丙氨酸浓度的溶液(，请参阅顶部的条形图以了解解决方案交换协议）。如果在丙氨酸能够结合并引发阴离子电流之前，抑制剂需要从结合部位解离，那么电流激活应该比在没有抑制剂的情况下丙氨酸激活慢。与此预期一致，ASCT2的预暴露3立方厘米导致激活时间常数增加约2倍(、A和B）。需要注意的是，我们的溶液交换装置的时间分辨率在5-8ms范围内，通过记录不同盐浓度溶液变化时的开放吸管尖端电流进行测试。因此，在没有抑制剂的情况下，活化时间常数受到溶液交换装置时间分辨率的限制。假设缓蚀剂置换实验的较慢动力学不受溶液交换动力学的限制，则解离常数为3立方厘米从72秒的结合位点−1可以估计。
抑制剂解离动力学。A、 从只含有细胞外缓冲液（对照，黑点）的溶液到含有缓冲液+2 mM丙氨酸的溶液的快速溶液交换，如条形图所示（顶部）。红点显示了一个类似的实验，在该实验中，细胞被预先培养为1 mM3立方厘米.随后应用丙氨酸会导致3立方厘米，允许测定解离动力学。减去基线电流。膜电位为0 mV，细胞内溶液含有10 mM丙氨酸和135 mM NaSCN。细胞外溶液含有140 mM NaMes。B、 根据A中实线所示的指数拟合对时间常数进行量化。注意，电流的丙氨酸活化的时间常数受到溶液交换的时间常数的限制。
ASCT2底物和抑制剂的结构-活性分析。
先前关于同源酸性氨基酸转运蛋白（EAAT）的研究表明，结合氨基酸侧链的主体是配体与其结合位点相互作用强度的重要决定因素，也是确定底物或抑制剂性质的重要决定因子。为了测试ASCT2配体行为是否遵循类似的原则，我们分析了与蛋白质相互作用的表观亲和力，作为氨基酸特性的函数，例如侧链体积和疏水性，如log（P）所定义的(). 数据表明，活化底物的亲和力随着侧链体积和侧链疏水性的降低而增加。相反，抑制剂的亲和力随着侧链体积和对数的增加而增加（P）().
ASCT2配体的构效关系。表观解离常数[log（1/K）]对侧链取代基（A）体积和取代基（B）的log（P）的依赖性。取代基被定义为所有侧链原子，从C开始β，不包括Cα以及α羧基和氨基。基板显示为开放符号，抑制剂显示为填充符号。P、 辛醇-水分配系数。
接下来，我们将结构-活性分析扩展到化合物诱导或抑制阴离子电流的能力。如所示，侧链体积低于110Å的化合物三是激活底物，而具有较高侧链体积的化合物要么是非活性的（即不结合，例如3立方厘米)或抑制泄漏阴离子电导。这一结果表明，正如对接分析预测的那样，活化底物与其ASCT2结合位点的结合存在尺寸排除极限。
预测底物、部分底物或抑制剂行为：阴离子电流的方向与侧链体积成比例。阴离子电流响应是相对于饱和丙氨酸浓度（均为0 mV）引起的响应进行计算的。
讨论
在这里，我们将电子对接与功能分析相结合，以深入了解中性氨基酸转运体ASCT2对底物的识别机制。对接分析导致了一系列同源化合物的化学合成，并测试了它们激活或抑制ASCT2介导的阴离子电导（一种运输活性的测量方法）的能力。本研究的主要新结果是，包括侧链疏水性和体积在内的预测因子允许将化合物分为活化底物、部分底物和失活抑制剂。该结果将有助于更准确地预测ASCT2结合位点中的配体行为。
配体与结合位点相互作用的机制。
对于相关的谷氨酸转运体，配体相互作用的模型如下：在无配体的载脂蛋白状态下，重入环2处于开放配置，允许转运底物在结合间隙内低亲和力结合。结合后RL2闭合，导致高亲和力相互作用并允许跨膜转运。转运的底物可能与开环构型具有较高的亲和力，因为RL2的存在允许增加氢键接触的数量，以及配体和蛋白质之间的疏水相互作用。竞争性抑制剂，如TBOA，通过将笨重的苄基部分定位在开放的RL2旁边来防止环路闭合，从而防止移位。我们的对接研究与该模型一致，表明天冬氨酸优先与闭环构象结合，从而使其稳定，而TBOA优先与开环构象结合。虽然没有apo构型的晶体结构，但分子动力学研究表明存在开环apo构象(Huang和Tajkhorshid，2008年).
我们对配体与高度同源的中性氨基酸转运体ASCT2结合的结果与这些想法一致。特别是，对接结果表明，由ASCT2（激活阴离子电导）转运的化合物优先与闭环构型结合。相反，由于空间位阻冲突，抑制剂被排除在闭环构型之外，但它们与开环构型有显著的对接分数。因此，由于抑制剂-ASCT2复合物的空间位阻性无法采用闭环构型，ASCT2抑制剂可能阻止RL2闭合。与该模型一致，在对接和实验中，抑制剂的效力随体积以及氨基酸侧链的疏水性而变化(). 对于传输基板，我们的结果表明，它们与开环配置的交互作用很差，但与闭环配置的交互效果很强，从而将平衡转变为闭环形式。
值得注意的是，对于含有较大芳香取代基（如芴基和萘基）的抑制剂，未发现芳香基团与RL2中心结合的位置。这种行为的一个似乎合理的原因是侧链太笨重，不适合TBOA-homologous开环配置。这表明，与苄基丝氨酸或TBOA相比，这些抑制剂采用了不同的侧链构象，苄基丝氨酸或TBOA具有较少的芳香体。或者，RL2可以在底物离解后进一步开放，为侧链相互作用创造额外空间。Glt的MD模拟结果支持了第二种选择酸碱度其中开环构象平均显示RL2开放程度高于TBOA结合形式(Huang和Tajkhorshid，2008年). 因此，可以推测RL2可以根据结合底物的类型采用不同程度的开放，从快速传输底物的完全封闭到部分底物的部分封闭，再到最笨重的抑制剂的完全开放。这种机制并不像谷氨酸受体那样是前所未有的，谷氨酸受体依靠维纳斯捕蝇草模型通过配体结合激活受体(Abele等人，1999年;阿姆斯特朗和古奥，2000年)，配体诱导通道开放的效率取决于结构域闭合的程度。
我们的结果表明，含有萘基取代基的化合物(3立方厘米)以表观速率系数k个d日=72秒−1.假设离解常数为K（K）d日=100μM，关联速率常数为k个b条= 7 × 105M（M）−1秒−1可以估计（假设K（K）d日=k个d日/k个b条). 该速率常数低于扩散控制结合的预期值。因此，可以假设大分子抑制剂的结合需要ASCT2结合位点的额外构象变化。
预测底物的激活/抑制性质。
本研究的主要目标之一是能够开发ASCT2底物行为的预测因子。与EAAT的结果一致，侧链中的疏水体有助于与ASCT2的高亲和力相互作用，特别是当该体为芳香体时。侧链体积可用于区分运输的底物和抑制剂()，全基板的侧链体积小于100Å三抑制剂的侧链体积大于120Å三，部分底物介于两者之间。值得注意的是，底物和抑制剂之间的侧链体积有一个相对急剧的截断。
值得注意的是，不仅侧链中的疏水体是高亲和力相互作用所必需的，而且该体需要是芳香的。如所示，化合物1c个环己基取代基不与ASCT2相互作用。这表明大的疏水性脂肪族基团不足以结合，但侧链的芳香性质很重要。对接结果不能很好地代表芳香族性质的这一要求，其中3立方厘米预计将绑定到具有高对接分数的开环形式(). 这并不奇怪，因为在没有π-特异相互作用的情况下，评分函数只包括一个一般的疏水项(Trott和Olson，2010年). 在同源模型中，只有两个芳香残基位于潜在π-堆积相互作用的结合位点附近（Phe391和Trp459），但这两个侧链都离芳香环的预测结合位置太远。因此，结合位点相互作用的详细物理描述有待进一步研究。
ASCT2药理学。
已经开发出相对较少的ASCT2氨基酸转运抑制剂。在一项研究中，苄基丝氨酸被发现是一种原型竞争性ASCT2抑制剂，其结构与谷氨酸转运体阻滞剂TBOA相似(Grewer和Grabsch，2004年). 然而，苄基丝氨酸结合亲和力较低（～1 mM）。在另一份报告中，研究了一系列天冬酰胺衍生物，其中芳香基团与酰胺氮相连(Esslinger等人，2005年). 尽管没有K（K）我给出了最有效的抑制剂化合物的值，第页-硝基苯基谷氨酰苯胺在约0.25 mM时抑制50%的吸收(Esslinger等人，2005年). 虽然不知道确切情况K（K）米C6细胞谷氨酰胺转运体对谷氨酰胺的价值，可以估计实际K（K）我在100μM谷氨酰胺下，该化合物的含量约为80μM。我们最有效的基于联苯部分的抑制剂与30μM的表观亲和力结合()这表明这是迄今为止已知的ASCT2的最高亲和力抑制剂，其效力至少比之前的化合物高出3倍。
值得注意的是Esslinger等人（2005）结论是，侧链中以酰胺N-H基团形式存在的氢键供体对高亲和力相互作用很重要。然而，在我们的系列化合物中，在这个位置没有氢键供体。这一结果表明，抑制剂与ASCT2结合位点的高亲和力相互作用不需要氢键供体，但它并不排除向芴化合物中引入氢键供体能增加亲和力的可能性。这种可能性可以在未来的实验中进行测试。
ASCT2抑制剂开发的一个重要问题是特异性。例如，芳基天冬酰胺衍生物被报道为谷氨酸转运体的高亲和力抑制剂(Greenfield等人，2005年). 这表明，带负电荷的β-羧酸基团的缺失并不能消除与EAAT结合位点的相互作用。这里测试的ASCT2抑制剂（苄基丝氨酸除外）也持续抑制谷氨酸转运体EAAT3（数据未显示）。这是一个重要的发现；这意味着必须仔细评估依赖谷氨酸转运体药理抑制的细胞生物学或神经生理学研究，因为许多已知的EAAT抑制剂也可能抑制ASCT，尽管它们的ASCT2作用从未被测试过。因此，这种影响可能归因于EAAT的抑制，而EAAT的部分抑制可能是由中性氨基酸转运体的抑制引起的。因此，与EAAT相比，开发优先与ASCT结合的高亲和力抑制剂仍然是一个挑战。单纯依靠侧链中的疏水体来实现高亲和力相互作用将不足以产生选择性。对于其他中性氨基酸转运蛋白家族来说，特异性也可能难以实现。系统A和系统N转运体的药理学尚未建立，因此我们无法对化合物与这些转运体可能发生的相互作用发表评论。对于L氨基酸转运体、LAT系统，带有芳香侧链的氨基酸是底物(Segawa等人，1999年). 因此，可以设想芳香丝氨酸酯也可能与氨基酸转运蛋白的LAT家族相互作用。
结论
总之，我们使用对接方法和实验验证来预测一系列与中性氨基酸转运蛋白ASCT2结合位点相互作用的丝氨酸衍生物的底物和抑制剂行为。我们的模型预测，侧链体积小、侧链疏水性低的氨基酸衍生物与结合位点的闭环形式强烈相互作用，但与开环形式结合较弱，充当转运底物。相反，抑制剂优先与开环形式结合。侧链芳香性是高亲和力相互作用所必需的。这些预测使我们能够开发出一种与ASCT2具有30μM表观亲和力的抑制剂，据我们所知，该抑制剂目前是其他ASCT2抑制剂所无法比拟的。鉴于ASCT2在增殖星形胶质细胞释放谷氨酰胺中的重要性，因此可能有助于谷氨酸-谷氨酰胺循环(布勒和布鲁克斯，2001年)以及许多癌症中众所周知的ASCT2上调(Fuchs和Bode，2005年)新ASCT2抑制剂的开发可能会产生具有治疗价值的化合物。
缩写：
- ASCT公司
- 丙氨酸-胆碱-半胱氨酸转运体
- EAAT公司
- 兴奋性氨基酸转运体
- HEK公司
- 人胚胎肾
- 二甲基亚砜
- 二甲基亚砜
- 纳梅斯
- 有甲磺酸钠
- Glt公司酸碱度
- 谷氨酸转运体同源物霍里克希热球菌
- PDB公司
- 蛋白质数据库
- RL公司
- 再入回路
- TBOA（待定）
- 数字图书馆-苏氨酸-β-苄氧基天冬氨酸
- 拉丁美洲
- 系统我-氨基酸转运蛋白。
作者贡献
参与研究设计：阿尔伯斯和格雷沃。
进行的实验：阿尔伯斯（Albers）、马西利亚（Marsiglia）、加梅罗（Gameiro）和格雷沃（Grewer）。
贡献的新试剂或分析工具：阿尔伯斯、马西利亚和托马斯。
执行数据分析：阿尔伯斯（Albers）、马西利亚（Marsiglia）、加梅罗（Gameiro）和格雷沃（Grewer）。
撰写或参与撰写手稿：阿尔伯斯（Albers）、马西利亚（Marsiglia）、加梅罗（Gameiro）和格雷沃（Grewer）。
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