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单元格。作者手稿；PMC 2012年7月22日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2011年7月22日；146(2): 318–331.
2011年7月14日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2011.06.019
预防性维修识别码：PMC3155290型
美国国立卫生研究院：NIHMS312232
PMID：21757228

两种早期帕金森点突变完全不同的等基因多能干细胞的产生

弗兰克·索尔德纳,1 乔西·拉加尼埃尔,4 阿尔伯特·W·程,1,三 德克·霍克梅耶,1 青高,1 拉吉·阿拉加潘,1 维克拉姆·库拉纳,1,5 劳伦斯·戈布,7 理查德·迈尔斯,6 苏珊·林德奎斯特,1,2 张磊（Lei Zhang）,4 德米特里·古斯钦,4 劳伦·K·方,4 乔·武,4 孟向东,4 费奥多尔·乌尔诺夫,4 爱德华·雷巴尔,4 菲利普·格雷戈里,4 H.史蒂夫·张,4和鲁道夫·杰尼什1,2,8
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关联数据

补充资料

总结

来自体细胞的患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）为人类疾病的研究提供了一种独特的工具，也为细胞置换治疗提供了一个很有前景的来源。然而，一个关键的限制是无法在基因定义的条件下进行实验。这与晚发性疾病特别相关，因为体外表型被预测为细微的，并且容易受到遗传背景变化的显著影响。通过结合锌指核酸酶（ZFN）-介导的基因组编辑和iPSC技术我们通过生成多组等基因疾病，为这个问题提供了一个普遍适用的解决方案，并通过修改潜在点突变（A53T/E46K），控制在两种帕金森病易感性变异体中唯一不同的人类多能干细胞α-synuclein基因。在患者衍生的hiPSC中，强大的基因纠正致病点突变的能力不仅是基础生物医学研究的重大进展，也是基于hiPSC的细胞置换治疗的重大进展。

简介

基因组医学将特定基因型与疾病易感性联系起来的能力取得了进步，但在将这种联系转化为特定治疗方面的诸多挑战缓和了人们对这一进展的异常兴奋。该领域的共识是，建立“菜肴中的疾病”模型是解决这一关键问题的最有希望的方法之一(沃格尔，2010年). 人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术是这种体外疾病建模的关键组成部分，该技术能够将人类体细胞表观遗传重编程为胚胎干细胞样状态，然后分化为任何类型的身体细胞(Dimos等人，2008年;Park等人，2008年;Soldner等人，2009年;Takahashi等人，2007年;Yu等人，2007年). 原则上，携带所有与疾病相关的遗传改变的患者特异性iPSCs可以为研究人员提供一个独特的机会，在体外研究相关细胞类型中单基因和复杂疾病的细胞和分子机制，并有可能确定替代疗法(Daley和Scadden，2008年;Saha和Jaenisch，2009年).

然而，到目前为止，只有少数这样的研究确定了与疾病相关的表型，大多数是在罕见的早期发病或代谢性疾病中(Brennand等人，2011年;Ebert等人，2009年;Itzhaki等人，2011年;Lee等人，2009年;Marchetto等人，2010年;Rashid等人，2010年). 由于这些疾病表现强劲且迅速，与健康供者对照组相比，体外模型更有可能显示出明显的差异。相比之下，迟发性疾病，如潜伏期长、体内细胞和病理变化进展缓慢的帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，预计在体外只能表现出细微的表型。由于缺乏基因匹配的对照，很难将这些细微但与疾病相关的表型变化与不可预测的背景相关变异区分开来。来自健康供体的常用对照细胞最多代表一个近似的解决方案，因为单个hESC和hiPSC株表现出高度可变的生物学特性，例如分化为特定功能细胞的倾向(Bock等人，2011年;Boulting等人，2011年;Soldner等人，2009年). 这些深刻差异的基础是多方面的，包括（i）遗传背景的差异；（ii）细胞衍生过程(Lengner等人，2010年)和（iii）在hiPSCs的情况下，用于诱导重编程的病毒载体的变异效应和残余转基因表达(Soldner等人，2009年)以及在重编程过程中引入的基因改变(戈尔等人，2011年;Hussein等人，2011年). 可变遗传背景对体外疾病建模方法造成了特别严重的阻碍，因为不可能控制遗传修饰基因座的影响。即使是导致最常见的“单基因”疾病的突变，包括镰状细胞贫血、囊性纤维化和显性家族性帕金森氏病，也容易受到遗传背景的显著上位性影响，导致外显率不完全，发病年龄和疾病进展不定(Lees等人，2010年;萨默斯，1996年).

因此，为了使“盘中疾病”方法取得成功，必须建立实验系统，其中感兴趣的致病基因损伤是唯一的修改变量。然而，尚未解决的遗传操纵多能人细胞的问题阻碍了这种遗传定义的人体模型系统的创建。最近，我们和其他人使用工程锌指核酸酶（ZFN）来推动选择性标记有效靶向整合到人胚胎干细胞和hiPSC中(Hockemeyer等人，2009年;Zou等人，2009年). 利用这项技术（称为“基因组编辑”），我们通过演示从hESCs和hiPSCs中产生的一组同基因疾病和对照细胞系，为这个关键问题提供了一个普遍适用的解决方案，这些细胞系仅在经验证的帕金森病（PD）易感性变体上存在差异通过遗传修饰α-synuclein基因中的单碱基对。

PD是第二常见的迟发性神经退行性疾病，其主要特征是黑质纹状体多巴胺能神经元的大量丢失和受影响细胞中存在蛋白质包涵体（路易体）。与罕见家族性PD相关的突变的发现，如路易小体主要成分α-突触核蛋白（A53T、E46K、A30P）的显性突变，为理解罕见家族性疾病以及更常见的散发性疾病的分子发病机制提供了重要线索(Lees等人，2010年;舒尔茨，2008). 然而，表达这种突变体的细胞和转基因动物模型只能部分重述PD病理学(Dawson等人，2010年). 为了建立一个遗传定义的PD人类体外模型，我们试图通过从携带A53T（G209）α-synuclein突变的患者中获得hiPSC，然后纠正该突变，或者通过生成A53T或E46K（G188A），来生成一组对照和疾病相关细胞系野生型人胚胎干细胞基因组突变。

结果

致病A53T（G209A）α-突触核蛋白突变插入人胚胎干细胞

基因工程ZFN的基因组编辑依赖于核酸酶引入的双链断裂（DSB）。精确地将DSB靶向研究者特定位点的能力是至关重要的，因为点突变以最大效率从外胚供体转移到DSB本身的位置(Elliott等人，1998年;Goldberg等人，2010年). 我们设计了一组ZFN，在α-synuclein基因外显子3的核苷酸碱基209（A53T突变位点）精确引入DSB(图1A、B和表S1和S2). 对转化的人类细胞中的ZFN进行筛选，结果显示在预期位置编辑了高达18%的α-synuclein等位基因(图1A).

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基于药物选择的靶向策略在人胚胎干细胞中ZFN介导A53T（G209）α-突触核蛋白突变的插入

（A） 针对人类α-突触核蛋白第3外显子209核苷酸的ZFNs筛选。通过Surveyor/Cel-1分析测量ZFNs介导的靶位点破坏。红色箭头表示预期的Cel-1消化产物。每个ZFN对的基因断裂频率显示在每个通道下方（GFP表示GFP转染阴性对照）。除SNCA-L1/R3对外，所有ZFN均与野生型FokI连接，SNCA-L1/R3对与Fok1核酸内切酶（ELD-KKR）的专性异二聚体形式连接

（B） 描述基因组α-突触核蛋白位点的示意图(SNCA公司)以及显示外显子（蓝框）、限制性位点以及外部和内部southern杂交探针（红条）位置的靶向策略。序列扩增表明，ZFNs在α-突触核蛋白第3外显子209碱基诱导剪切位点（红色碱基对）和loxP-位点封闭的pGK-puro选择盒插入位点（红色框）。以下显示了在选择盒的Cre切除之前和之后用于阳性选择（Syn-A53T-loxP-pGK-puro-loxP）或阳性-阴性选择（Syn-A53T-loxP-pGK-puro-loxP-HSV-TK-DT-a）和靶向基因组基因座的供体质粒设计的示意图。供体质粒在ZFN切割的每一侧具有约600 bp的同源性。pGK启动子，磷酸甘油激酶启动子；puro，嘌呤霉素抗性基因；pGKpolyA，聚腺苷化序列；单纯疱疹病毒胸苷激酶；pGK-DT-A-pA，白蚁毒素A链。

（C） 供体质粒Syn-A53T-loxP-pGK-puro-loxP（WIBR3-SNCA）靶向人胚胎干细胞系WIBR3的Southern blot分析A53T/重量-1） 以及之后（WIBR3-SNCAA53T/重量-1C）C介导的选择盒切除。用指示酶消化基因组DNA，并与外部3′、5′探针和内部3′探针杂交。指出了每个摘要的片段大小。

（D） 人胚胎干细胞系WIBR3-SNCA基因组α-突触核蛋白基因座的序列测定A53T/重量-1C显示野生型（G209，蓝基）或靶向突变体（A209，红基）序列。靶向等位基因包含C介导的选择盒切除后剩余的loxP位点。

（E） WIBR3-SNCA免疫荧光染色A53T/重量-1C代表多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4。

（F） WIBR3-SNCA生成的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色A53T/重量-1C电池。

（G） WIBR3-SNCA神经元培养物的免疫荧光染色A53T/重量-1C细胞在诱导分化10天后，检测神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；绿色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；红色）。

（H） 所示细胞系中α-synuclein转录物（+/-Tsp45I限制性消化）的突变分析RT-PCR。（A53T突变产生额外的Tsp45I限制位点）。Tsp45I消化后预期片段大小：野生型转录本，249/218/24/9个基点；A53T转录本249/185/33/24/9 bp（A53T和野生型（wt）衍生的限制性片段用红色箭头表示）。

（一） 阳性-阴性选择后供体质粒Syn-A53T-loxP-pGK-puro-loxP-HSV-TK-DT-A靶向WIBR3细胞的Southern blot分析。用指定的酶消化基因组DNA，并与外部5′和3′探针以及内部3′探针杂交。指出了每个摘要的片段大小（WIBR3-SNCAA53T/重量-2个品系显示一个等位基因的正确靶向性；WIBR3-nca公司A53T/A53T线显示两个等位基因的正确靶向）。

根据我们之前关于hESCs和hiPSCs基因高效靶向整合的研究结果(Hockemeyer等人，2009年)，我们最初考虑了一种基于药物选择的策略，将PD-causing A53T（G209A）突变引入人胚胎干细胞内源性α-突触核蛋白位点。然而，对于许多位于蛋白质编码外显子内的疾病相关突变，包括α-突触核蛋白A53T（G209A），不能使用相同的方法，因为插入选择标记会破坏靶基因的表达。因此，我们设计了一种替代策略，将loxP位点侧翼的嘌呤霉素抗性基因插入A53Tα-突触核蛋白突变和DSB下游相邻的内含子23碱基中(图1B). 对于这种基因编辑策略，一个正确的靶向事件加上Cre重组酶介导的选择盒的切除，预期会导致单个碱基对的改变，从而在α-synuclein的外显子3中产生A53T（G209A）突变，在下面的内含子中保留一个loxP位点(图1B).

靶向供体构建体（Syn-A53T-loxP-pGK-puro-loxP）在携带A53T（G209A）突变的ZFN靶向位点的每侧包含约600bp的同源性(图1B)，以及4个不同的ZFN对(表1,图1A和表S1和S2)被电穿孔成两个不同的hESC株系（BGO1和WIBR3）。使用供体同源区外的探针5′和3′对单个单细胞来源的嘌呤霉素耐药克隆进行Southern blot分析，结果表明基因组位点被破坏，靶向供体载体的整合频率至少为25%(图1C,图S1A和表1). 利用内部探针对供体载体的3′靶臂进行进一步分析(图S1B)并对抗氨苄西林耐药基因(图S1C)揭示了额外的供体衍生向量序列与目标位点的整合，可能是通过一种基于杂交同源定向修复（HDR）-末端连接的过程，如前所述(Richardson和Jasin，2000年).

表1

ZFN介导的基因组编辑实验和分析克隆综述

细胞系供体载体/ssODNZFN对#分析的克隆数#具有修改的目标基因座的克隆#具有正确靶向等位基因的克隆（2第等位基因被破坏）#正确定位/分析的克隆#非目标改造/测试场地细胞系名称
BGO1公司供体-Syn-A53T-loxP-pGK-puro-loxP采埃孚L1/R16017一1 (1)0/240
采埃孚L2/R16017一
ZFN L1/R26018一1 (1)
采埃孚L2/R26023一
无线局域网3Donor-Syn-A53T-loxP-pGK-嘌呤-loxP采埃孚L1/R19612一1 (0)1/960/38WIBR3-SNCA公司A53T/重量1A、1B、1Cd日
无线局域网3Donor-Syn-A53T-loxP-pGK-嘌呤-loxP-pTK-DT（正-负选择）采埃孚L1/R341一个等位基因：17一9 (5)4/410/24（f）WIBR3-SNCA公司A53T/重量2,3,4,5,6
两个等位基因：2一2 (1)1/410/12WIBR3-SNCA公司A53T/A53T
无线局域网3不锈钢脱氧核糖核酸-E46K采埃孚L1/R34804克4 (0)4/480未注明日期。WIBR3-SNCA公司E46K系列1,2,3,4
BGO1公司供体Syn-A53T（无选择）采埃孚L1/R1240三b条2 (1)1/2400/38BGO1-SNCA公司53吨/重量
BGO1公司ssODN-E46K型采埃孚L1/R32401克1 (0)1/240未注明日期。BGO1-SNCA公司E46K系列
WIBR iPS SNCA公司A53T型-5供体-Syn-WT（无选择）采埃孚L1/R12406c2 (1)1/2400/38WIBR-iPS-SNCA公司A53T-Corr公司1,2,3,4,5e（电子）
一供体载体的同源和非同源整合（如图S1)
b条TSP45I消化后southern blot分析A53T（G209A）突变的插入、基因组PCR突变分析和测序
cTSP45I（消化基因组PCR突变分析和测序）后用southern blot分析A53T（G209A）突变缺失
d日1A、1B、1C代表WIBR3-SNCA的不同亚克隆A53T/重量-C介导的选择磁带放回后1个
e（电子）1,2,3,4,5代表秒ent WIBR-IPS-SNCA的不同亚克隆A53T-Corr公司Cre介导的重编程转基因切除后
（f）WIBR3-SNCA线0/12离目标修改A53T/重量-2和WIBR3-SNCAA53T/重量-3
克基于PCR突变分析的E46K（G188A）突变筛查策略对ZFN诱导DSB位点的修饰不敏感（baes 209）。

336个耐嘌呤霉素克隆中有3个通过southern blot正确修改了靶基因位点(图1C,图S1和表1)，在Cre介导的选择盒切除后通过测序进一步证实(图1D). 由于ZFN介导的基因破坏，三个克隆中有两个克隆的第二个等位基因发生了小的缺失。具有非破坏野生型等位基因（WIBR3-SNCA）的正确靶向克隆A53T/重量-1A/-1C）显示正常核型(图S1D)并保持多能性特异性标记蛋白的一致表达所示的多能性状态(图1E)以及形成畸胎瘤的能力，畸胎瘤由来源于所有三个发育胚层的细胞类型组成(图1F). southern blot分析排除了瞬时转染的ZFN或Cre重组酶表达质粒的稳定整合(图S3). 此外，使用基于胚胎体（EB）的方案诱导神经分化，我们能够从靶向hESC细胞系中高效地获得多巴胺能甲状腺素羟化酶（TH）表达神经元(图1G). 为了验证Cre介导的选择盒切除后剩余的loxP位点不会干扰α-突触核蛋白的剪接或基因表达，我们将亲代和靶向hESC细胞系分化为神经元，以诱导α-突触核蛋白的表达。突变分析RT-PCR(Polymeropoulos等人，1997年)证实靶细胞系中野生型和A53T突变转录物的表达水平和比率与从A53T患者特异性hiPSCs（WIBR-iPS-SNCA）衍生的神经元中观察到的类似A53T（1箱）) (图1H).

为了通过减少供体载体的非靶向整合以及ZFN裂解位点同源臂以外的供体载体序列的整合来提高靶向效率，我们采用了正负选择策略(卡佩基，1989年)通过将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和白喉毒素A链（DT-A）纳入载体主干(图1B). 使用这种策略，41个耐嘌呤霉素和更昔洛韦的菌落中有9个产生了正确的靶向等位基因(图1I和表1). 这些克隆中有四个没有破坏第二个野生型等位基因，41个克隆中有一个导致A53T（G209A）突变正确定位并插入到这两个等位基因中（WIBR3-SNCAA53T/A53T). 最初通过southern blot分析确定的目标克隆通过基因组位点的测序进行了确认（数据未显示）。没有克隆整合瞬时转染的ZFN(图S3). 这种疾病相关基因座的单步双等位基因修饰是研究突变α-突触核蛋白在缺乏野生型蛋白的情况下的作用的独特工具。这种突变的纯合子个体尚未被描述，纯合子突变细胞的研究可能为PD的发病机制提供新的见解。

在无药物选择的情况下将A53T（G209A）点突变插入α-synuclein基因

到目前为止所描述的实验，虽然成功地将一个期望的点突变转移到本地基因座，但需要将一个可选择的标记整合到相邻的内含子中。根据所需编辑事件相对于内含子/外显子连接的位置，这种策略可能并不适用于所有基因；此外，虽然可以使用Cre-relubise去除可选择标记，但剩余的loxP位点代表了额外的非必需遗传改变，可能会产生不可预测的影响。因此，我们转向了一种方法，旨在生成遗传上原始的hESCs，除了编辑的碱基外，不包含任何外源序列(Urnov等人，2005年)引入致病点突变(图2A). 鉴于ZFN的高基因编辑活性(图1A,图S1A和表1)，我们构建了一个缺乏选择盒的供体载体，该供体载体仅由携带A53T（G209A）点突变的ZFN裂解位点两侧的~1kb同源性组成，以便将突变插入人胚胎干细胞内源性α-突触核蛋白位点(图2A). 人胚胎干细胞系BGO1与供体构建物、ZFNs和eGFP表达质粒一起电穿孔，通过荧光激活细胞分选（FACS）使转染细胞富集。使用A53T（G209A）等位基因特异性Tsp45I限制性消化物，通过southern blot分析筛选来自单个eGFP表达细胞的克隆。240个BGO1克隆中有3个显示出A53T（G209A）等位基因特异性限制模式，表明发生了准确的遗传改变事件，导致内源性基因组位点发生A53T突变(图2B). PCR基因分型进一步分析(图2C)基因组位点的测序(图2D)确认了一个目标正确的克隆(表1)一个等位基因和一个未受影响的第二等位基因的核苷酸209发生预期的单碱基对变化，导致BGO1基因背景的A53T突变细胞系（BGO1-SNCAA53T/重量). 靶向细胞系维持多能性状态，如多能性特异性标记物的一致表达所示(图2E)形成畸胎瘤的能力(图2F)体外分化为多巴胺能神经元(图2G). southern blot分析排除了ZFNs和GFP表达质粒的稳定整合(图S3).

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无药物选择的ZFN介导人胚胎干细胞系BGO1 A53Tα-突触核蛋白突变的插入

（A） 描述基因组α-突触核蛋白的示意图(SNCA公司)基因座和靶向策略显示外显子（蓝框）、限制性位点和内部southern杂交探针（红条）的位置。放大的序列表明ZFNs在α-突触核蛋白外显子3的209碱基处诱导了切割位点（红色碱基对）。如下所示为A53T（G209A）α-synuclein突变插入（供体-A53T）或校正（野生型供体）的供体质粒设计和靶向基因组位点示意图。供体质粒与靶位点具有~1kb同源性。

（B） 对BGO1细胞进行Southern blot筛选（3′内探针），以靶向整合A53T（G209A）突变（供体A53T）。使用A53T（G209A）等位基因特异性Tsp45I限制性消化酶消化基因组DNA（A53T突变产生额外的Tsp45I限制位点）。预期片段大小野生型等位基因，2.96 kb；A53T等位基因，1.55 kb。3′内南方杂交探针排除了供体载体的额外非同源整合。红色星号表示克隆带有额外的Tsp45I限制位点，表明插入了A53T突变。

（C） 患者衍生hiPSC（WIBR-iPS-SNCA）α-突触核蛋白基因座（+/-Tsp45I限制性消化）的PCR突变分析A53T型)和靶向hESCs（BGO1-SNCAA53T/重量表示（B）中用红色星号标记的克隆。片段大小（+Tsp45I）野生型等位基因，219 bp；A53T等位基因，131/88bp。

（D） 靶向人胚胎干细胞克隆BGO1-SNCA基因组α-突触核蛋白基因座的序列测定53吨/重量显示野生型等位基因（12个序列中的7个序列为G209）或靶向突变A53T等位基因。

（E） BGO1-SNCA免疫荧光染色A53T/重量针对多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4。

（F） WIBR3-SNCA生成的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色A53T/重量-1C电池。

（G） WIBR3-SNCA来源的神经元培养物的免疫荧光染色A53T/重量-1C细胞在诱导分化10天后，检测神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；绿色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；红色）。

使用单链寡核苷酸将PD-causing E46K（G188A）点突变插入人胚胎干细胞的α-突触核蛋白

最近的研究表明，短单链寡核苷酸（ssODNs）代替双链供体质粒可以作为ZFN驱动的基因组编辑的替代DSB修复模板(Radecke等人，2006年;Radecke等人，2010年). 正如已经显示的那样，点突变可以转移到远离ZFN诱导的DSB的地方(Elliott等人，1998年;Goldberg等人，2010年)我们想测试在α-突触核蛋白的外显子3中引入第二个PD-causing突变（E46K/G188A）的可能性(Zarranz等人，2004年)因此，设计了一个114bp的ssODN，携带与疾病相关的G188A碱基对变化，位于A53T（G209A）突变上游的21个碱基(图3A). hESC系BGO1和WIBR3用ZFNs和表达eGFP的质粒以及ssODNs而不是双链供体载体电穿孔(图3A). 通过PCR和突变特异性StyI限制性消化筛选来自FACS分选的eGFP表达细胞的单个单细胞克隆。480个WIBR3克隆中的4个和240个BGO1克隆中的1个显示了经PCR基因分型验证的StyI限制位点的E46K（G188A）等位基因特异性缺失(Zarranz等人，2004年)和southern杂交分析(图3B、C)表明内源性α-synuclein基因组位点发生了准确的遗传改变。通过基因组位点测序的进一步分析证实了E46K（G188A）突变的正确插入，而没有对ZFN裂解位点附近的野生型或突变等位基因进行任何额外的改变(图3D，E). 如多能性特异性标记蛋白的一致表达所示，靶细胞系保持多能性状态(图3F、G). 使用ssODN作为模板正确编辑基因组克隆的效率与使用双链供体质粒的效率相当(表1).

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利用ssODN介导ZFN在人胚胎干细胞中插入E46Kα-突触核蛋白突变

（A） 描述基因组α-突触核蛋白的示意图(SNCA公司)基因座和靶向策略显示外显子3（蓝盒）、限制性位点和southern杂交探针（红条）的位置。序列扩大表明，ZFN在α-突触核蛋白第3外显子209碱基和E46K（G188A）突变位点（红色碱基对）诱导切割。下图显示了插入E46K（G188A）α-突触核蛋白突变后114bp ssODN和目标基因组位点的示意图。

（B） 人胚胎干细胞系WIBR3、BGO1和靶向E46K人胚胎干公司系（WIBR3-SNCA）α-突触核蛋白基因座（+/-StyI限制性内切酶）的PCR突变分析E46K系列和BGO1-SNCAE46K系列). 片段大小（+StyI）野生型等位基因，153/66bp，E46K突变等位基因219bp。

（C） WIBR3和BGO1及靶向E46K hESC株（WIBR3-SNCA）的Southern blot分析（3′探针）E46K系列和BGO1-SNCAE46K系列)用于A53T（G209A）突变的靶向整合。使用E46K（G188A）等位基因特异性StyI限制性消化酶消化基因组DNA（E46K突变破坏野生型等位基因特定的StyI抑制位点）。预期片段大小为野生型等位基因，0.46kb；E46K突变等位基因，2.96 kb）。

（D） 靶向人胚胎干细胞克隆WIBR3-SNCA基因组α-突触核蛋白基因座的序列测定E46K系列显示野生型等位基因（16个序列中有10个为G188）或靶向突变型E46K等位基因。

（E） 靶向人胚胎干细胞克隆BGO1-SNCA基因组α-突触核蛋白基因座的序列测定E46K系列显示野生型等位基因（G188在16个序列中的7个序列中）或靶向突变的E46K等位基因。

（F） WIBR3-SNCA免疫荧光染色46公里针对多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4。

（G） BGO1-SNCA的免疫荧光染色E46K系列针对多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4。

PD患者hiPSC A53T（G209A）α-突触核蛋白突变的基因修复

从携带A53T（G209A）α-突触核蛋白突变的患者获得的成纤维细胞使用之前描述的多西环素诱导和Cre-relubise可切除慢病毒载体重新编程(Hockemeyer等人，2008年;Soldner等人，2009年). 之前产生的hiPSC（WIBR-iPS-SNCAA53T（2个）) (图4)以及在Cre介导的重编程因子切除后（WIBR-iPS-SNCAA53T（1个）) (图S2)显示了多能干细胞的所有基本特性，如多能干标记蛋白的一致表达所示(图4A和图S2B)形成畸胎瘤的能力(图S2C)和正常核型(图4B). 基因组α-突触核蛋白基因座的测序证实了患者衍生hiPSC中A53T（G209A）突变(图4D). 此外，这些细胞被证明分化为表达TH的多巴胺能神经元(图4E).

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A53T（G209A）α-synuclein突变PD患者疾病特异性hiPSCs的衍生

（A） PD患者衍生hiPSC株WIBR-iPS-SNCA的免疫荧光染色A53T（2个）-多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4为5。

（B） 患者来源的hiPSC系WIBR iPS SNCA的细胞遗传学分析A53T（2个）-5号染色体核型正常。

（C） WIBR-iPS-SNCA的Southern blot分析A53T（2箱）克隆。用XbaI消化基因组DNA，并探测前病毒与32针对hOCT4、hKLF4、hSOX2和M2rtTA的P标记DNA探针。Southen blot分析证实了基于单个前病毒整合模式的独立克隆。

（D） PD患者衍生hiPSCs株WIBR-iPS-SNCA基因组α-突触核蛋白基因座的序列测定A53T（2个）-5显示野生型等位基因（19个序列中的7个序列中有G209）和突变型A53T等位基因。

（E） hiPSC细胞系WIBR-iPS-SNCA神经元培养物的免疫荧光染色A53T（2箱）-5诱导分化后10天，检测神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；绿色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；红色）。

为了从基因上修复PD患者衍生的hiPSC中的A53T（G209）突变，我们采用了如上所述的针对hESCs的无选择靶向策略，唯一的区别是使用包含供体载体的野生型序列(图2A). 240个WIBR-iPS-SNCA中的6个A53T型通过southern blot筛选，克隆证明A53T特异性Tsp45I限制位点丢失，这可能是ZFN诱导的DSB后非同源易出错的末端连接或基于HDR的等位基因校正的结果(图5A). PCR基因分型进一步分析(图5B)基因组位点的测序(图5C)确认一条经正确修复的患者衍生hiPSC线（WIBR-iPS-SNCAA53T-Corr公司,表1)α-synuclein核苷酸209的预期单碱基对变化。最后，为了防止重编程转基因残余表达的不可控影响(Soldner等人，2009年)，我们从校正的患者衍生hiPSC中切除了重编程载体(图S2D)随后显示正常核型(图5E)如多能性标记的一致表达所示，保持多能性状态(图5F)以及形成畸胎瘤的能力(图5G). southern blot分析排除了ZFNs、Cre重组酶和GFP表达质粒的稳定整合(图S3). 患者源性hiPSC中A53T突变的基因修复并不影响分化为TH表达多巴胺能神经元的能力(图5H). 进一步验证修复后的hiPSC患者衍生株（WIBR-iPS-SNCA）中α-突触核蛋白基因座的准确编辑A53T-Corr公司)，我们对神经元分化后的α-突触核蛋白进行了突变分析RT-PCR，证实突变的A53T（G209A）转录物表达缺失(图5D).

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ZFN介导的PD患者来源的hiPSCs中A53T（G209A）突变的校正

（A） 患者衍生hiPSC（WIBR-iPS-SNCA）的Southern blot筛查（3′内探针）A53T型)用于纠正A53T（G209A）突变（野生型供体）。使用A53T（G209A）-等位基因特异性Tsp45I限制性消化物消化基因组DNA（A53T突变产生额外的Tsp45I限制性位点）。3′内南方杂交探针排除了供体载体的额外非同源整合。片段大小：野生型等位基因，2.96 kb；A53T等位基因，1.55 kb。红色星号表示Tsp45I限制位点缺失的克隆，表示A53T突变缺失。

（B） 人类胚胎干细胞（WIBR3）和患者源性hiPSC基因组α-突触核蛋白位点（+/-Tsp45I限制性内切酶）PCR突变分析A53T型)修正后（WIBR-iPS-SNCAA53T-Corr公司-1和5，表示来自（A）中用红色星号标记的克隆的两个子克隆）。片段大小（+Tsp45I）：野生型等位基因，219 bp；A53T突变等位基因，131/88bp。

（C） ZFN介导校正后PD患者衍生hiPSC基因组α-突触核蛋白基因座的序列测定。校正细胞系（WIBR-iPS-SNCAA53T-Corr公司-1和5）仅显示野生型等位基因（35个序列中的35个序列为G209）。

（D） 所示细胞系中α-synuclein转录物（+/-Tsp45I限制性消化）的突变分析RT-PCR。（A53T突变产生额外的Tsp45I限制位点）。Tsp45I消化后预期片段大小：野生型转录本，249/218/24/9个基点；A53T转录本249/185/33/24/9 bp（A53T和野生型（wt）衍生的限制性片段用红色箭头表示）。

（E） 帕金森病患者改良hiPSC系WIBR-iPS-SNCA的细胞遗传学分析A53T-Corr公司-5号染色体核型正常。

（F） WIBR-iPS-SNCA的免疫荧光染色A53T-Corr公司-多能性标记OCT4、NANOG、SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4的5个品系。

（G） WIBR-iPS-SNCA生成的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色A53T-Corr公司-5个单元格。

（H） WIBR3-SNCA神经元培养物的免疫荧光染色A53T/重量-1C细胞在诱导分化10天后，检测神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；绿色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；红色）。

工程化ESCs和iPSC的全基因组分析

ZFNs介导的基因组编辑的一个潜在限制是在非预期靶位点的序列中诱导DNA链断裂。为了检查编辑细胞系中的非靶向修饰，我们首先通过前面描述的SELEX分析确定了本研究中使用的每个ZFN的DNA结合特异性(Hockemeyer等人，2009年;Perez等人，2008年) (表S3). 这允许在全基因组范围内识别最可能的非靶点切割位点(表S4). 随后进行了Surveyor内切酶（Cel-1）检测，以揭示我们编辑的几个细胞系中大量假定的非靶点的潜在非同源末端连接（NHEJ）介导的indels(表1,图S4). 虽然该分析在其他研究中揭示了ZFN罕见的真正离靶修改(Hockemeyer等人，2009年;Perez等人，2008年)我们没有发现任何被检测基因座出现非靶向基因组断裂的证据(表1,图S4).

众所周知，长时间培养人胚胎干细胞可导致适应性改变，如增长率增加、凋亡减少和获得染色体异常，如拷贝数变异（CNV）(Laurent等人，2011年;Narva等人，2010年). 最近，有人提出，重编程过程本身会破坏基因组的完整性，导致CNV和体细胞突变的积累(戈尔等人，2011年;Hussein等人，2011年). 尽管我们的所有测试细胞系在常规核型分析确定的基因组编辑后均显示出正常的核型，但该技术的低分辨率不包括检测较小的CNV，CNV被认为是人类基因组变异的主要来源，在基因组编辑的背景下尤为重要。这种遗传变化包括DNA双链断裂和克隆事件的诱导，这被认为增加了额外基因组改变的机会。因此，如前所述，我们使用Affymetrix SNP 6.0阵列进行了高分辨率全基因组CNV分析(Hussein等人，2011年;Narva等人，2010年)在3对等基因亲本和转基因细胞系上。我们平均鉴定出77个CNV，每个细胞株的平均大小为158 kb(表S5). 对于人类ES细胞系而言，这比之前描述的稍高，可能是由于本研究中使用的细胞系的技术变异性，例如样本量低或传代数高（hESCs的传代P25和P60之间，hiPSC的传代数为P22和P40之间）。在ZFNs介导的基因组修饰前后，通过两两比较，63%已鉴定的CNV（数量和总基因组面积）在等基因对之间重叠(图S5A-E). 相比之下，我们观察到在基因无关的样本中只有35%的CNV重叠(图S5A-E). 这种重叠程度与之前公布的人类胚胎干细胞移植数据相当，这些数据比较了不同通道数下的相同细胞系(图S5D、E) (Narva等人，2010年). 此外，比较ZFN介导的基因靶向前后CNV的平均数量和总基因组面积，除了在正常培养的人胚胎干细胞中观察到的变化外，没有发现任何其他变化(图S5F). 与以前的报告一致(Narva等人，2010年)我们的分析证实，hESCs和hiPSCs包含的CNV数量高于正常人类基因组，这与基因组编辑程序无关，可能是在hESC衍生、重编程过程和延长细胞培养过程中获得的。此外，我们得出的结论是，Cre重组酶介导的重编程因子切除和ZFN介导的基因组编辑并没有显著增加基因组改变的水平。为了进一步验证基因组编辑方法不会导致导致异常基因表达谱的主要遗传或表观遗传改变，我们对未分化的双亲细胞系和转基因细胞系进行了全基因组表达分析。尽管所有多能干细胞系的基因表达非常相似，但层次聚类分析表明，遗传背景对基因表达的影响比基因组编辑更显著，因为亲本和基因组编辑的细胞系对的基因表达模式比遗传独立的细胞系更密切相关(图S5G).

讨论

虽然疾病的转基因动物模型和在培养皿中研究人类培养细胞是推动基本生物医学研究的核心技术，但在许多情况下，这些方法只是部分再现了在患者身上观察到的分子和细胞变化。使用hiPSC技术产生无限量的患者衍生疾病相关细胞类型的能力有可能改变人类疾病的生物医学研究。然而，在实现这项技术的全部前景之前，必须解决通往定义明确的体外实验系统的道路上的众多挑战。其中一个关键的限制是无法在基因定义的条件下进行实验。在这里，我们通过将ZFNs介导的基因编辑与hESC和hiPSC技术相结合，提出了一个解决这个问题的优雅方案。

表2比较了本研究中描述的四种策略的优缺点。虽然使用正负选择的基因靶向载体代表了最有效的基因组编辑策略，但这种方法需要删除选择盒，因此需要第二个单细胞克隆步骤，以增加生成最终靶向细胞系的时间。基于选择的策略的另一个不可避免的后果是，它会在目标基因改变附近留下一个基因足迹，即loxP位点。相反，无选择策略虽然效率较低，但没有留下遗传足迹，只涉及一个细胞克隆步骤，因此缩短了生成目标细胞系所需的时间。基于ssODN供体的简单合成的优势，加上转移ZFN诱导的DSB附近基因组改变的能力，极大地提高了基于非选择方法的通用性和适用性，可能是基因组编辑的最有利选择。

表2

四种不同目标策略的比较

战略捐赠者确定目标步骤所需时间1效率2优势缺点
基于选择积极的选择28-16周+高效率
使用多重选择标记可以同时针对两个等位基因		复杂矢量设计
两个克隆步骤
遗传改变（剩余的loxP位点）
正负选择++一个克隆步骤
无其他遗传改变		复杂矢量设计
无选择基于矢量的捐赠者14-8周+方便的捐赠者设计
ssODN公司
1电穿孔与改良细胞系鉴定之间的时间
2+ ~ 1%; ++ ~ 10%. （效率可能因不同基因而异）

在这里，我们通过将PD相关的A53T或E46K突变工程化为hESCs，或者反过来，通过只改变一个碱基对而不需要以任何其他方式改变基因组来修复PD患者衍生的hiPSC中的突变，从而在几个确定的遗传背景上生成了一组等基因控制和疾病细胞系。考虑到遗传背景的广泛影响以及单个hESCs和hiPSCs之间深刻的生物学差异，例如向特定细胞系分化的倾向(Bock等人，2011年;Boulting等人，2011年)该实验系统可以克服传统hiPSC方法在识别疾病相关表型方面的一些缺点。强大的疾病相关体外表型对于确定新药靶点或大规模筛选基因和小分子疾病修饰物至关重要。在无偏见的全基因组分析中，为了区分遗传背景噪声和疾病相关影响，遗传定义的疾病和对照细胞系对的可用性变得更加重要，考虑到大约5%的基因表达被认为与遗传变异有关(蒙哥马利等人，2010年;Pickrell等人，2010年).

虽然生物医学研究可能会从体外疾病建模中受益匪浅，但iPSC技术的最终前景（尽管还处于发展的早期阶段）是使用自体细胞对退行性疾病进行细胞替代治疗的概念(Daley和Scadden，2008年). 小鼠原理验证实验(Hanna等人，2007年)利用衍生疾病特异性iPSC、体外修复潜在遗传改变和随后移植校正的iPSC衍生细胞的联合方法，确定了治疗单基因疾病的可行性。人类细胞的类似方法目前受到修复致病基因组改变所需的有效基因靶向问题的阻碍(Daley和Scadden，2008年). 因此，通过基因纠正患者衍生的hiPSC中的致病点突变的方法不仅是基础生物医学研究的重大进展，也是基于hiPSC的细胞替代疗法的重大进展。

实验程序

HESC和hiPSC的衍生和培养

HESC生产线BG01（NIH代码：BG01；BresaGen，Inc.，Athens，GA）和WIBR3（Whitehead Institute Center for Human Stem Cell Research，Cambridge，MA）(Lengner等人，2010年)hiPSCs的衍生和维持如前所述(Soldner等人，2009年)以及扩展实验程序中的详细信息。活检的患者携带A53Tα-突触核蛋白突变，之前已有描述(Golbe等人，1996年). 所有方案均经相关机构审查委员会（波士顿大学医学院、麻省理工学院）和胚胎干细胞研究监督委员会（怀特海研究所）批准，并在活检前获得书面知情同意。所有多能干细胞系均已通过常规方法进行表征，扩展实验程序中对此进行了详细描述。

ZFN设计和ZFN表达质粒

抗人α-突触核蛋白基因座的ZFN是使用预先验证的2指模块档案设计的，如所述(Doyon等人，2008年;Miller等人，2007年;Perez等人，2008年;Urnov等人，2005年). 锌指蛋白的完整序列靶点见表S1和表S2除SNCA-L1/R3对与Fok1内切酶（ELD-KKR）的专性异二聚体形式相关外，所有ZFN均与野生型FokI相关(Doyon等人，2010年;Miller等人，2007年;Perez等人，2008年). 通过瞬时转染K562细胞检测ZFN，以检测野生型α-突触核蛋白等位基因的破坏。通过Surveyor（Cel-1）基于核酸内切酶的非同源末端连接测量确定目标位点的干扰效率(Miller等人，2007年;Perez等人，2008年)（Cel-1分析中使用的引物：SNCA-Cel1-FW:5′-AAACTAGCTAATCAGCAATTTTAAGGC-3；SNCA-Cel 1-RW:5’-AGCCCTCATTTTGGCA-3）。ZFN的离靶裂解分析（产生NHEJ介导的吲哚）基本上如前所述进行(Doyon等人，2008年;Hockemeyer等人，2009年;Perez等人，2008年)并在扩展实验程序中进行了详细描述。

ZFN介导的hESCs和hiPSCs的基因组编辑

在电穿孔前24小时，HESC和hiPSC在Rho-相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（钙生物化学；Y-27632）中培养。使用0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液（Invitrogen）采集细胞，并将其重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中。用于基于药物选择的基因编辑1×107用35μg供体质粒（由F.S.设计和组装）和7.5μg每个ZFN编码质粒（Gene Pulser Xcell System，Bio-Rad:250 V，500μF，0.4 cm试管）电穿孔细胞。随后将细胞在补充有ROCK抑制剂的hESC培养基中的DR4 MEF饲养层上铺板24小时。更昔洛韦（1X10−6M） 电穿孔72小时后开始选择和/或嘌呤霉素（0.5μg/ml）。对于无药物选择的基因编辑，1×107用30μg供体质粒（由F.S.设计和组装）、7.5μg每个ZFN编码质粒和10μg pEGFP-N1（Clontech）电穿孔细胞。对于使用ssODN的基因编辑，1×107用7.5μg每个ZFN编码质粒和15μg pEGFP-N1（Clontech）以及30μg ssODNs（5′-GACTTTAGTCTTGAATTTTTGTAGGCTCCCAAAAACCAAGA AGGGAGTGTGCATGGTGCAACAGGTAAGCTCCATTGCTTATATCCA AAGATGTATAGTAT-3′；爱荷华州集成DNA技术公司）对细胞进行电穿孔。细胞在含有ROCK抑制剂的MEF饲养层上保存72小时，然后对eGFP表达细胞的单个细胞悬浮液进行FACS分类（FACS-Aria；BD-Biosciences），然后在添加ROCK抑制剂的hESC培养基中以低密度培养24小时。在电穿孔后10至14天，采集单个菌落并扩大。

​

亮点

  • 产生等基因疾病和控制多能干细胞的一般方法
  • 无药物选择的ZFNs介导的人类多能干细胞基因组编辑
  • 两种PD不同的等基因细胞的产生导致α-突触核蛋白突变
  • 纠正患者源性hiPSC中导致帕金森病的A53T突变

补充材料

01

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02

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03

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04

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05

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致谢

我们感谢徐平（Ping Xu）和丹增隆江娃（Tenzin Lungjangwa）的技术支持，感谢杰西卡·道斯曼（Jessica Daussman）、基比比·甘兹（Kibibi Ganz）、鲁斯·弗兰纳里（Ruth Flannery）和傅东东（Dongdong Fu。我们要感谢怀特黑德基因组技术核心的汤姆·沃尔科特（Tom Volkert）和琼·阿昆（Jeong-Ah Kwon）在拷贝CNV分析方面的帮助，感谢W.M.凯克显微镜设备的尼奇·沃森（Nicki Watson）在共焦显微镜技术方面的帮助以及怀特黑德研究所FACS设备的帕蒂·维斯涅夫斯基（Patti Wisniewski）和查德·阿拉诺（Chad Araneo）在细胞分选方面的帮助。我们感谢Gladys Dulay构建ZFN矢量，感谢Elo Leung对离靶研究进行计算分析。我们感谢Jaenisch实验室的所有成员对手稿进行了有益的讨论和评论。R.J.得到了NIH拨款R01-CA084198和R37-HD045022的支持。霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的合作创新奖（Collaborative Innovation Award）部分支持了这项研究。RJ是Stemgent的顾问，也是Fate Therapeutics的联合创始人。L.K.F.、L.Z.、F.D.U.、P.D.G.、H.S.Z.、D.J.、J.V.、X.M.、E.J.R.是Sangamo BioSciences，Inc.的全职员工。作者的贡献见补充信息.

脚注

补充信息

补充信息包括扩展实验程序、五张图和五张表，可以在网上找到本文

接入号码

Expression Microarray数据和SNP 6.0 CNV阵列数据已提交给Gene Expression Omnibus（GEO），可通过登录号获得

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