Rho家族小GTPase在肌动蛋白调节和运动中的动力学

摘要

介绍

自p21小GTP-结合蛋白Rho家族被鉴定并与肌动蛋白细胞骨架的直接调控相关以来，已有20多年的历史。^1–5到目前为止，已经有很多关于它们对肌动蛋白细胞骨架重排动力学的调节作用的描述。在这里，我们总结了Rho、Rac和Cdc42 GTPase调控肌动蛋白细胞骨架的途径，并介绍了破译这些Rho家族GTPase激活动力学的最新方法。

Rho GTPases与上游因子调控

p21小GTPase的Rho家族对调节多种细胞功能至关重要，包括运动、有丝分裂、增殖和凋亡。^6–12Rho GTPases作为分子开关发挥作用^1，13并能与下游效应分子相互作用，以GTP负载的“on”状态传播信号转导。固有磷酸酶活性将GTP水解为GDP，从而“关闭”蛋白质。这一过程通过与GAP（GTPase激活蛋白）的相互作用而加速。¹⁴与GEF（鸟嘌呤核苷酸交换因子）的相互作用促进了GDP与GTP的交换。^15，16Rho GTPase的GTP效应分子与GDP负载状态的相对亲和力差异可能高达100倍，^17–19导致仅在GTP结合激活状态下与其相关信号伙伴发生高度特异性的相互作用。此外，GEF/GAP相互作用直接发生在Rho GTPase的同一效应器结合界面（开关I/II）。^20，21GEF或GAP的结合带来了轻微的结构变化，其作用是：（1）取代Mg⁺²在GEF的情况下，释放约束GDP以换取GTP²⁰和（2）在Rho GTPase的催化囊中插入一个水分子，以促进GTP水解为GDP，这是GAP中固有磷酸酶活性的近4000倍。^22，23Rho GTPase和相关上游调节器相互作用的一个重要考虑因素是Rho GTPase的显性阴性（T17N Rac1或Cdc42或T19N RhoA）或组成活性（Q61L或G12V Rac1和Cdc42或者Q63L或G14V Rho）突变型的过度表达。这就造成了这样一种情况，即这些突变体隔离了上游GEF和GAP。¹⁵这些效应是由于这些突变Rho GTPase分别对上游GEF和GAP具有高亲和力状态。Apo构型（无鸟嘌呤核苷酸）中的Rho GTPases对GEF具有高亲和力，而GTP负载状态中的Rhon GTPase对GAP具有高亲和力。这是一个问题，因为上游GEF和GAP在Rho GTPase亚型的成员之间可能是选择性的，并且通常不是选择性的，¹⁵如果涉及多个GTPase亚型，则无法描述表型。

鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDI）是另一类在调节周期中与Rho GTP酶相互作用的分子。^2，24–26GDI与Rho GTPase结合抑制鸟嘌呤核苷酸的解离^27，28并阻止Rho GTPase的激活。GDI已被证明能够提取膜结合的Rho-GTP酶，这些酶通过向C末端添加脂质部分进行翻译后修饰。^27，28这种翻译后修饰包括几乎所有的小p21-GTPase，但Ran家族的GTPase除外。²⁸该脂质部分通过插入由GDI的免疫球蛋白样β三明治形成的疏水口袋而与GDI相互作用。这种相互作用还使GDI的N末端调控部分与Rho GTPase的效应器结合界面（GTP-调控的开关I和开关II区域）相接触，²⁸防止Rho GTPase与其效应器的任何虚假结合。GDI与Rho GTPase在质膜上的结合导致结合复合体被拉入细胞质。Rho-GTPase在膜（活性部分）和细胞质（非活性部分）之间的穿梭构成了Rho-GTP酶的主要调节动力学之一。GTPase-GDI相互作用的时空调控是一个新兴的研究领域。新的研究表明，GDI和Rho GTPase的磷酸化在调节彼此的相对亲和力方面起着关键作用。^28–31靶向GDI和Rho GTP酶的各种上游激酶，包括Src，²⁹PKC、，³¹PKA、，³⁰已确定能够特异性调节GDI对Rho GTPase家族每个成员的亲和力。其他证据支持GTP负载的Rho GTPase可能被GDI隔离，尽管效率降低。³²这种Rho-GTPase调控模式可能会使活细胞中Rho-GTP酶激活的时空动力学的解读更加复杂。

GTPase同工酶，对运动性很重要的类

传统上，根据霍尔及其同事的开创性工作，Rho家族GTPases、RhoA、Rac1和Cdc42主要与细胞骨架重排有关。^2–7将Rho GTPases激活突变体微量注射到饥饿和静止的Swiss3T3细胞中，诱导了肌动蛋白细胞骨架的剧烈重排，其中RhoA引起应力纤维和粘附形成，Rac1诱发片状跛足突起，Cdc42产生丝状突起。自这些初步研究以来，已阐明了各种上游和下游途径；然而，由于在活体内观察多种蛋白质活性的技术挑战性，这些途径在活细胞内和实时协调的机制仍然缺乏特征。

GTPases的Rho亚家族已被证明调节多种细胞骨架动力学。^{6–12，33–35}根据体外生物化学观察、抑制剂检测或多种Rho GTPase突变体的异位表达，很容易得出结论，任何一种GTPase（Rac1、RhoA或Cdc42）都可能对体内细胞运动产生独特和孤立的影响。³⁶然而，这些Rho-GTPase似乎更可能存在于复杂的激活级联中，具有拮抗调节机制，导致体内每个家族成员之间具有精确相互关系的协同效应。^37，38这种效应的一个例子是Rac1和RhoA之间的对抗(图1). 从历史上看，Rac1在向饥饿的Swiss3T3细胞微量注射组分活性Rac1后，与跛足突起或膜皱褶有关^7，11而微量注射活化的RhoA导致应力纤维、粘附斑块和收缩表型的形成。^6，9，10更多证据表明，突起信号与收缩信号的分离来自神经元系统，其中RhoA的失活导致轴突生长锥延伸，而RhoA激活则导致其塌陷。^39，40据推测，主要由Rac1驱动的前伸表型必须占优势，RhoA的收缩表型主要驱动运动细胞的尾部收缩。^10，41–45在一些细胞系统中，观察到前缘激活的Rac1和尾部激活的RhoA。^43，46然而，最近对成纤维细胞和癌细胞的研究似乎表明，Rac1/RhoA GTPase的协调具有更复杂和动态的模式，在经历细胞骨架重排（包括突起、收缩、，皱褶或大胞饮症^37，47–50(图2). 这些最近的观察结果支持了细胞骨架动力学和Rac1/RhoA活性在亚细胞水平上紧密耦合的观点。

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图1

图中显示了迁移细胞中Rac1与RhoA活动的传统视图。RhoA被认为主要在缩尾（红色）激活以促进尾部收缩，而Rac1被认为在细胞前部激活以促进跛足突起（蓝色）。

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图2

样品荧光生物传感器数据显示RhoA在前缘（A）和大松果体亚细胞结构（B）的复杂激活模式。图片取自Pertz等人。⁴⁸

Rho GTPase下游目标

Rho的下游靶点已经得到了很好的描述，包括激酶、formins、WASp蛋白家族和其他支架分子(图3). 在这些主要的亚类中，Rho相关的卷曲螺旋激酶1/2（ROCK）、p21活化激酶（PAK）、哺乳动物双相formin（mDia）和WASp家族的蛋白质，包括WASp、N-WASp和WAVE，对与运动相关的肌动蛋白细胞骨架重排有直接影响。

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图3

GTPases Rho家族的下游效应器靶点。

RhoA、B和C激活直接下游激酶靶点ROCK。⁵¹研究表明，ROCK可直接磷酸化许多肌动蛋白细胞骨架调节因子，包括肌球蛋白轻链磷酸酶和LIM激酶（LIMK）。^51，52肌球蛋白轻链或肌球蛋白轻型链磷酸酶的直接磷酸化对磷酸化肌球蛋白轻链的水平有直接影响，这有助于收缩性。⁵³ROCK激活LIMK与ADF/cofilin的磷调节有关。^52，54–56ADF/cofilin已被证明是肌动蛋白在突起机制中切断、成核和封盖的关键调节因子之一。^57–63

Cofilin介导的肌动蛋白通过切断预先存在的肌动素纤维成核是一种重要的调控机制，细胞通过这种机制调节前缘的突出动力学。^64–67Cofilin通过LIMK由Ser3的直接磷酸化调节。⁶³这种磷酸化被认为与一对Lys126/127形成分子内盐桥，以阻断肌动蛋白结合界面，阻止其肌动蛋白的结合功能（非活性）。⁶³此外，未磷酸化（活性）cofilin已被证明与PIP2和皮质素结合，⁶³通过直接隔离活化的cofilin，赋予额外的活性调节水平。直接进入该途径，Rac1和Cdc42激活p21激活激酶1（PAK1），也激活LIMK。⁶⁸Rac1激活的Slingshot和Chronophin磷酸酯酶家族可以去磷酸化cofilin来激活它；^69，70然而，这些多途径是如何协调的，并反过来通过前缘突起内的上游Rho-GTP酶调节ADF/cofilin的，目前尚不清楚。

RhoA、B和C亚型的另一个关键下游效应器是蛋白质的Formin家族。Formins通过负责肌动蛋白丝组装起始的formin同源结构域2（FH2）产生直的、不分枝的肌动蛋白纤维。⁷¹FH2持续与生长的肌动蛋白丝的顶端相关，加速肌动蛋白单体的结合，并保护末端免受肌动蛋白帽蛋白的影响。^71–75Formin homology 1（FH1）将profilin结合的肌动蛋白单体传递给FH2，将其并入肌动蛋白丝的生长端。⁷³这些肌动蛋白丝在肌动蛋白应激纤维、丝状体、肌动蛋白索和细胞分裂素肌动蛋白环中很明显。⁷¹formins的激活模式通常涉及上游激活的Rho-GTP酶的结合，而Rho-GTPase又取代了自身抑制结构域。⁷¹这放松了自抑制和闭合构象，允许FH1/FH2处理肌动蛋白聚合。在已鉴定的15种哺乳动物的蚁群中，哺乳动物的双蚁群（mDia）1和2是迄今为止在细胞运动方面研究最多的。⁷¹mDia1被Rho亚型激活。然而，mDia2似乎也被Rac1和Cdc42激活，⁷⁶导致体内特定下游肌动蛋白细胞骨架重排的上游信号通路进一步复杂化。有趣的是，mDia1通过与微管端盖蛋白复合物EB1/APC结合，已被证明能够稳定动态微管尖端并稳定粘附。^77–79mDia2具有独立于肌动蛋白聚合活性的微管结合能力，⁷⁷将肌动蛋白细胞骨架重排直接与迁移细胞中的微管动力学联系起来。

Rac1和Cdc42激活Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族，包括WASP、N-WASP和WAVE1/2。^80–85WASP和N-WASP被认为是通过Cdc42和Rac1与GTPase结合域内的CRIB基序结合而直接激活的，随后通过与PI（4,5）P2相互作用而协同激活。⁸⁶这些分子以自动抑制的闭合构象存在，其中C末端VCA基序以非活性状态与GTPase结合域（GBD）结合。激活的上游Cdc42或Rac1对抗这种自动抑制，从GBD中释放VCA。然后，分子的开放允许Arp2/3复合物与VCA基序结合，并随后激活Arp2/3复合体。^83，86–89然而，WASP和N-WASP的本地化也可以通过与包括Grb2、，^90–92可能将分子定位于受体刺激和激活肌动蛋白细胞骨架重塑的位点。与WASP不同，WAVE蛋白没有GBD结构域⁸⁶并且它们的激活需要Rac1与衔接分子IRSp53结合，然后将该复合物与WAVE蛋白结合。⁹³此外，WAVE的活性似乎还需要Abi1的结合。^94，95WAVE有一个C末端VCA基序，激活Arp2/3复合体，促进树突状肌动蛋白网络的形成。⁸⁶

Rho-GTP酶动力学的研究方法

Rho-GTPase的显性阴性（DN）和组成激活（CA）突变版本已广泛用于活细胞中，以产生受这些突变Rho-GTP酶强烈驱动的细胞表型。然而，由于DN和CA突变的压倒性影响，这些方法在解释细胞表型时需要谨慎。^1，13，96还有一些额外的突变可能不一定产生DN或CA效应，例如效应结合突变、GDI-结合突变和GEF/GAP结合突变。⁹⁷使用这些版本的Rho GTPase将需要siRNA敲除/拯救方法来特异性地去除内源性野生型背景。进一步观察到内源性Rho-GTPase的KD可能会导致某些系统中其他Rho-GTP酶的代偿性过度表达。⁹⁸

Rho家族GTPase的免疫荧光定位一直具有挑战性，因为它们通常是弥漫的细胞质分布模式，并且Rho GTPase调节的性质是活性/非活性物质在膜和细胞质间穿梭。这种穿梭运动通常只将Rho GTPase总量的一小部分动员到激活位点。⁹⁹Rho-GTPases的GFP融合以前曾被用于描述各种Rho-GTP酶及其突变体的一般定位模式。¹⁰⁰然而，这种方法没有区分体内活性和GTP负载与非活性和GDP负载的GTPase定位，并且无法捕捉活细胞中此类活性与非活性状态之间的实时转换。

使用来自各种下游效应器靶点（即来自Rhotekin的RBD或来自PAK1的PBD）的小结合域的GST融合，对激活的Rho-GTPase进行亲和沉淀，是确定激活的Rhon-GTPases的细胞含量的主要工作。^101，102这些方法可以降低特异性激活的Rho家族GTPase，并在免疫印迹上比较活性部分与总Rho GTPase。然而，必须考虑到，这种方法提供了整个细胞群中GTP负载状态的总体平均值和快照视图。由于Rho GTPase激活通常相当微妙，并且高度局限于各种亚细胞隔室，¹⁰⁰使用多孔过滤器将外围突起与细胞体隔离可以解决这些问题。¹⁰³第二个主要考虑因素是这些分析中的时间尺度分辨率。活细胞中Rho GTPase激活的动力学通常在几秒到几十秒的时间范围内，这使得细胞裂解物的制备难以解决这些精细的时间范围事件。

二十多年来，蛋白质在其自然环境中的直接可视化一直是细胞生物学研究的重要工具。¹⁰⁴荧光生物传感器的发展首次观察到了在自然条件下活细胞中蛋白质翻译后修饰的动力学。^{46–48，105–107}水母绿色荧光蛋白（GFP）的发现大大扩展了生物传感器的适用性维多利亚州Aequoria victoria^108，109以及通过开发具有增强的光物理特性的GFP突变版本，可以进行荧光共振能量转移（FRET）。荧光蛋白不同光谱变体之间的非辐射FRET强烈依赖于GFP突变体之间的距离和方向。这一特性可用于设计报告翻译后修饰和构象变化的基因编码生物传感器，而不是简单地标记蛋白质以跟踪其定位的变化。目前已有多种基于FRET的GFP突变体生物传感器。^110–115(图4).

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图4

FRET生物传感器中使用的各种设计方法的示意图。（A） 基于Ras Raichu传感器设计的Rho家族GTPase的单链基因编码生物传感器。¹³⁵这种设计将K-Ras的CAAX盒放置在荧光蛋白的C末端，将探针组成性地放置在质膜中（用黑色锯齿线表示）。通过GDP-GTP交换激活Rho GTPase后，来自下游效应靶点（蓝色）的结合域与GTPase结合，改变FRET对黄色和蓝色荧光蛋白的相对邻近性。（B） 用于Rho GTPase的单链基因编码生物传感器。⁴⁸这种设计将FRET对荧光蛋白置于单链结构的内部。这种方法保持Rho GTPase的天然C末端，在那里可以进行适当的翻译后脂质修饰。这一特征维持了GTPase和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂之间的相互作用。这允许生物传感器以类似于内源性蛋白质的方式在细胞质（非活性）和质膜（活性）之间正确穿梭。通过GDP-GTP交换激活GTPase后，结合域（蓝色）与激活的Rho结合，改变青色和黄色荧光蛋白之间的相对取向，从而影响FRET。（C） Rho GTP酶的双分子基因编码生物传感器。³⁷这种设计将FRET供体和受体部分分离为两个必须分别表达的分子。虽然由于FRET供体和受体对的非等摩尔分布，定量分析更加繁琐，但动态范围的总变化可能远大于任何单链型生物传感器。（D） 用于检测内源性Rho GTPase活性的溶剂敏感性染料生物传感器。⁴⁷这种方法使用一种有机染料，它可以根据局部溶剂极性改变荧光发射强度。通过将染料置于下游靶蛋白的结合域（蓝色）内，该生物传感器与激活的、未标记的内源性Rho GTPase结合，导致染料改变荧光发射强度。通过监测这种荧光发射强度调制与非响应性荧光（例如，绿色荧光蛋白显示为绿色）的比率，可以监测Rho GTPase的效应结合状态。（E） 用于激酶活性的基于底物的FRET生物传感器。FRET对荧光蛋白位于靶上游激酶磷酸化基序的侧面（灰色圆圈）。磷酸化后，分子的构象略有改变，并影响两个荧光蛋白之间的FRET。该方法还可以包括与相关上游激酶的激酶磷酸化基序相邻的适当结合位点，以提高选择性（未显示）。这种方法的主要警告是，它对“激酶活性”没有那么具体，因为它只是在活细胞情况下监测相对上游激酶和局部磷酸酶活性的平衡。

影响FRET效率的因素

FRET对生物传感器内两个荧光团的距离和方向都很敏感。当荧光团相距足够远或具有正交偶极取向时，施主的激发导致施主的荧光发射，而不是导致受主的FRET发射。然而，当距离足够小（通常小于10 nm），且FRET荧光团对的取向能够实现足够的偶极偶极耦合时，存在通过量子力学过程将激发能量从施主转移到受主的有限概率，导致施主发射降低，受体发射增加。这会产生特征FRET激发/发射光谱(图5)，这与单独的供体或受体不同。

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图5

样品生物传感器荧光光谱测量中观察到的特征FRET发射响应。由于FRET，只有当生物传感器被激活时（蓝线），525nm的发射峰才可见。当生物传感器处于非激活状态时，525nm处的FRET峰值显著降低（红线）。

适用于活细胞FRET的有用GFP突变体不断进化。突变体在亮度、FRET效率、折叠和成熟率、光稳定性和荧光特性的pH依赖性之间进行了不同的权衡。^116，117较高的亮度可以提高成像过程中细胞的整体信噪比，但如果以FRET效率为代价（这会影响生物传感器的动态范围或激活和失活状态之间的差异），则不是一个优势。¹¹⁸增强的青色和柠檬黄荧光蛋白（ECFP和CitYFP）^117，119是相对快速成熟、pH稳定、明亮的GFP突变体，在许多FRET生物传感器中都很有用。¹¹⁸

在生物传感器中，目标蛋白的激活通过改变两个荧光团的距离和/或方向来影响FRET效率。FRET效率对荧光团对之间的距离非常敏感，这与第六相关性呈反比。¹²⁰偶极子相对角方向的变化产生较小但重要的影响。只有当两个荧光团在荧光团的激发态寿命期间自由地各向同性旋转时，才可以认为荧光团的偶极取向对FRET效率没有影响。因此，荧光团在不同生物传感器状态下的旋转迁移率或固定角度的变化也会影响FRET。^120，121荧光蛋白相对较大，并且在典型的激发态寿命期间不自由旋转。因此，为了优化偶极偶极耦合角，包括荧光蛋白的循环排列在内的方法¹²²对于重新定位荧光团偶极矩FRET对的相互关联的连接角非常有用。一个关键点是，荧光团分离（线性位移）与角度重新定向的影响在活细胞研究中无法轻易描述。因此，FRET变化不应用于确定蛋白质之间的精确距离，而应用于确定完全活性靶蛋白与非活性靶蛋白产生FRET的程度。然后使用这些值来解释细胞内靶蛋白的相对FRET变化和由此产生的激活状态。

检测Rho家族GTPase活性的生物传感器

现在有几种荧光生物传感器可用于检测活细胞中的Rho GTPase活性。^{46–48，123} 图4显示了这些方法的几个示例。这些生物传感器的主要优点是能够在活细胞的自然条件下实时直接可视化蛋白质的“激活”（通常通过效应器结合相互作用）。使用具有优越光物理特性的荧光蛋白的优化版本，现在可以在延长的延时实验中观察这些细胞，通常持续数小时，并以亚细胞分辨率捕获事件。^37，47–49

为了观察这些Rho-GTPase活动的协调调节，这些活动通常在空间和时间上紧密耦合，在单个活细胞中同时观察多个Rho-GTP酶活动将非常有用。活细胞中FRET生物传感器的主要限制之一是，如果同时使用一组以上的生物传感器，则多对FRET荧光蛋白之间的光谱重叠。最近克服这个问题的尝试包括使用兼容的荧光蛋白对，包括CFP/YFP和mOrange2/mCh组合。¹²⁴然而，这些方法需要关键的光学元件设计，以最小化不同荧光通道之间的光谱溢出。较新的技术开始出现，有望分离出远超过标准外荧光的多波长（即光谱反卷积、荧光寿命显微镜等），^125–128然而，这些成像模式往往伴随着其他问题（包括采集速度慢、辐照剂量大等），使得它们尚不适合相对快速动力学的活细胞成像。

如上所述，Rho-GTPase生物传感器的多路可视化方法存在局限性。最近，Machacek等人设计了一种计算方法，以虚拟多路复用生物传感器读数，重建小鼠成纤维细胞中Rac1、Cdc42和RhoA GTPase活性的前沿动力学。³⁷使用一组计算机算法精确跟踪前沿运动，作者能够生成蛋白质活性和前沿速度的“动力学图”^37，129(图6). 他们的方法的中心前提是，如果蛋白质活性是根据一个共同的基准计时器单独测量的，并且如果这种基准标记和蛋白质激活动力学之间存在保守关系，那么以后可以重建所有单独测量的Rho GTPase的完整动力学。³⁷利用这一假设，作者重新创建了Rac1、Cdc42和RhoA GTPase在构成性前缘突起/回缩的单个循环期间的激活动力学的精确图。有趣的是，RhoA活性与前缘前伸/后缩周期直接相关，几乎没有明显的时滞，而Rac1和Cdc42的激活延迟约40秒。基于这些观察，作者建议通过Rac1/Cdc42驱动机制稳定突出的跛足可能需要额外的时间和其他因素，包括前缘粘连的形成，以启动树突肌动蛋白网络的稳定。³⁷RhoA活化似乎与前缘运动直接一致的发现似乎表明，RhoA/ROCK/mDia介导的肌动蛋白聚合可能是成纤维细胞前缘突起的关键引发剂。然而，Rac1/Cdc42驱动机制在建立突起持续性方面似乎更为重要，以产生细胞边缘运动所需的方向性。

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图6

用于确定GTPase时空协调的动力学映射和互相关方法（摘自Machacek等人）。³⁷（A、D和G）指定了前缘突出/收缩的边缘跟踪，采样窗口编号为1～35。比例尺=10µm。MEF/3T3细胞随机突起和回缩周期中前缘的平均速度和Rac1（B和C）、Cdc42（E和F）和RhoA（H和I）活性的动力学图。边缘速度图和Cdc42活性图之间的（J–L）互相关系数分布显示为时间偏移的函数。（M） Rho GTPase动力学重建。Rac1、Cdc42和RhoA激活相对于边缘速度的时间，由时滞相关系数确定；绿线、边缘运动与Rac1的相关性；蓝线，边缘运动与Cdc42相关；黑线、边缘运动与RhoA的相关性；虚线，边缘速度。（N） 根据互相关最大值和自相关宽度确定GTPase在突起和回缩期间激活的时间和位置（未按比例绘制）。绿色，Rac1激活；黑色，RhoA激活；蓝色，Cdc42激活。

通过光学操作激活体内Rho GTP酶

通过检测内源性Rho-GTPase活性或生物传感器类似物的活性，可以了解细胞在最接近自然环境的条件下的信号调节。最近的研究对此采取了相反的方法，并产生了通过光操作瞬时激活细胞中Rho GTPases的方法。^130，131在Wu和Levskaya及其同事的这两种方法中，分别来自植物蛋白质中负责向光性（光-氧-电压：LOV域）和光感受器信号网络（光敏色素信号，光触发或破坏的蛋白质相互作用）的成分，用于实现Rho GTPase活性的光调节的方法。Wu和同事用LOV结构域直接衍生Rho GTPase，使得暗态中的LOV-Ja结构域组合阻碍了Rho GTPase的Switch I/II区域。¹³⁰衍生的Rho GTPase还包含消除GEF/GAP相互作用的突变（Rac1中的E91H和N92H突变）和组成性激活突变（Rac 1中的Q61L）。在458~473 nm的光照射下，Jα螺旋散开，从而将受阻的Switch I/II暴露给内源性下游效应靶，并启动信号传导。光活化Rac1的活化半衰期约为43秒，允许多次活化/失活循环以及通过闪光灯照射的连续活化。¹³⁰设计这种光活化系统的一个关键点是LOV-Jα复合物在目标分子暗态活性位点上的稳定性，以便控制任何虚假的“泄漏”。Wu等人表明，由于Rac1和LOV结构域之间在黑暗状态下形成了氨基酸残基的疏水簇，因此光活化Rac1暗状态下的LOV-Jα特别稳定。¹³⁰因此，为了将该系统扩展到Rho GTPases的其他家族成员（以及其他潜在的可调控靶点），可能需要在靶蛋白中引入适当的突变，以稳定暗态，消除系统的泄漏。Levskaya及其同事采用了不同的方法，在优化版本的拟南芥光敏色素B（PhyB）及其直接下游目标光敏色素相互作用因子6（PIF6）可以被不同波长的光触发或破坏。¹³¹通过引入组成性膜锚定PhyB并与PIF部分衍生的Tim、Tiam-1和Intersectin GEF（分别用于RhoA、Rac1和Cdc42的GEF）的组成性激活片段共存，作者能够在650/750nm的辐射下实现组分活化的GEF片段的可逆质膜募集，分别用于结合和释放。¹³¹通过筛选方法优化了结合和释放动力学，其中测试了PhyB和PIF结构域的不同组合，并发现一对最佳结构域具有适合活体细胞体内使用的快速结合和释放动力。在这里，Rho GTPase上游激活物进行光开关的方法是一种有趣的替代方法，可以通过可光激活的Rho GTPase类似物直接激活Rho蛋白。如果限速步骤是活性GEF与质膜上可用的内源性Rho GTPase的相互作用，则通过提供光开关、激活的上游GEF激活内源性Rhon GTPases将自然限制信号在途径中的传播。然而，Rho GTPase类似物的直接光活化情况并非如此，因为这将导致组分活化材料的短暂局部假过度表达。剩下的问题是：这两种方法中哪一种可能产生更符合生理学的信号动力学，以及如何根据获得真实的细胞表型读数，使用这些新工具定量描述激活动力学和蛋白质激活程度？

总结

在这里，我们概述了Rho GTPases及其在调节驱动细胞运动的肌动蛋白聚合机制中的作用，并描述了利用最先进的方法研究Rho GTPases动力学的最新方法。参考文献中描述了荧光生物传感器设计和使用的其他细节，包括生物传感器数据分析所需的计算机算法^132–134.

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