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EMBO J。2011年1月19日；30(2): 277–288.
2010年12月3日在线发布。 数字对象标识：10.1038/emboj.2010.310
预防性维修识别码：项目经理3025456
PMID：21131904

TDP-43通过负反馈回路调节其mRNA水平

尤纳·M·阿亚拉，1,* 劳拉·德·孔蒂，1,* Avendaño-Vázquez大街，1,* 阿什什·迪尔，1,* 毛里齐奥·罗曼诺，1,2 安德烈亚·达姆布罗乔，1,† 詹姆斯·托勒维，三 杰内·乌莱，三 马可·巴拉勒，1 伊曼纽尔·布拉蒂，1和弗朗西斯科·巴拉勒a、，1
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关联数据

补充资料

TDP-43通过负反馈回路调节其mRNA水平

TAR DNA-结合蛋白-43是一种参与RNA代谢的异质核核糖核蛋白，其异常定位和修饰也与许多神经退行性疾病有关。这里，TAR DNA-结合蛋白-43蛋白负调控其自身的mRNA水平，这可能会导致发病。

关键词：3′UTR、hnRNP、mRNA稳定性、神经变性、RNA-蛋白质相互作用

摘要

TAR DNA-结合蛋白（TDP-43）是一种进化上保守的异质核核糖核蛋白（hnRNP），参与RNA加工，其异常的细胞分布和翻译后修饰是某些神经退行性疾病的关键标志，如肌萎缩性侧索硬化和额颞叶退行性变。我们建立了表达野生型和突变型TDP-43标记形式的人类细胞系，并观察到TDP-43通过负反馈回路控制其自身的表达。TDP-43的RNA-结合特性通过与自身mRNA中的3′UTR序列结合而对自身调节活动至关重要。我们的分析表明，介导TDP-43–hnRNP相互作用的TDP-43 C末端区域也需要进行自我调节。TDP-43与其3′UTR结合不会显著改变前mRNA剪接模式，但会促进RNA不稳定性。此外，阻断外泌体介导的降解可部分恢复TDP-43水平。我们的研究结果表明，细胞TDP-43水平受到严格控制，并且疾病相关的TDP-43聚集体可能破坏TDP-43的自我调节，从而导致发病。

关键词：3′UTR、hnRNP、mRNA稳定性、神经变性、RNA-蛋白质相互作用

介绍

TAR DNA结合蛋白（TDP-43）是一种高度保守的异质核核糖核蛋白（hnRNP）。与这个家族的其他成员一样，它与RNA加工的不同方面有关（参见Buratti和Baralle，2008年). 其作为剪接调节器的功能最为详细，其中TDP-43招募到3′剪接位点，富含GU重复序列，抑制外显子识别(Buratti等人，2001年). TDP-43的异常细胞分布和翻译后修饰是一组神经退行性疾病的关键标志物，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和具有泛素阳性内含物的额颞叶变性（FTLD-U）(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年)现在也称为TDP-43蛋白病。TDP-43在泛素阳性不溶性包涵体中的积聚随后在一系列神经退行性病变中被发现，例如在一些阿尔茨海默病（AD）病例中(Amador-Ortiz等人，2007年;Higashi等人，2007年;Uryu等人，2008年)以及其他类型的痴呆症(Higashi等人，2007年;Nakashima-Yasuda等人，2007年;Neumann等人，2007年;Geser等人，2008年). 在约5%的遗传性和散发性ALS患者中分离出TDP-43突变，进一步加强了TDP-43与疾病的联系(Pesiridis等人，2009年). TDP-43聚集发生在神经元和神经胶质细胞的细胞质和核区室，通常伴随着蛋白质的核清除。从TDP-43蛋白病中分离出来的TDP-43通常通过广泛的泛素化、磷酸化和异常蛋白水解进行修饰(Neumann等人，2006年). TDP-43在发病机制中的作用尚不清楚，但敲除转基因小鼠和苍蝇模型产生的致死和麻痹表型突出了TDP-43功能的重要性(Feiguin等人，2009年;Wu等人，2010年). TDP-43包涵体的形成是否对细胞有毒尚待观察就其本身而言TDP-43不溶性聚集体是否会隔离导致细胞TDP-43功能丧失的蛋白质，或者这两种现象是否都会导致致病性。

TDP-43中存在两个RNA-结合域RRM1和RRM2，其中RRM1对核酸结合活性是必要的和充分的(Buratti和Baralle，2001年). 该蛋白结合单链RNA，对富含GU的序列具有高特异性，在低纳米摩尔范围内测量(Ayala等人，2005年). Phe 147和149位于RRM1的RNP-1序列中，形成核酸结合的标准结合平台（NMR结构：pdb2cqg）。取代这两个关键氨基酸就足以消除RNA结合和TDP-43剪接调控活性(Buratti和Baralle，2001年;D'Ambrogio等人，2009年). RRM2的功能尚不清楚，似乎在RNA相互作用中没有重要作用。事实上，它的RNA结合亲和力比RRM1低两个数量级(Kuo等人，2009年). TDP-43的剪接活性还取决于富含甘氨酸的C末端的完整性。更具体地说，该域中的残基321-366招募了hnRNP-A和hnRNP-C家族的额外hnRNP(D'Ambrogio等人，2009年).

我们现在表明，TDP-43通过下调TDP-43转录水平来控制其在人类细胞中的同源性。这种控制需要TDP-43 RNA结合活性，通过与TDP-43转录物3′UTR中的特定序列的关联以及321-366氨基酸区域的存在。自我调节机制似乎至少部分涉及外显体介导的mRNA降解途径。

结果

TDP-43的诱导表达下调蛋白质的内源性水平

我们利用Flp-In技术（Invitrogen）诱导四环素启动子，生成了HEK293人肾细胞系，稳定表达TDP-43 cDNA的单拷贝，如所述(格拉特等人，2009年). 用双标签（SH-TDP43）或用FLAG标签（F-TDP43）在N末端标记蛋白质。经标记的转基因形式TDP-43（TG-TDP43）的诱导表达导致内源性蛋白表达水平的显著降低，如western blot所示（参见图1重量）。在用作对照的类似生成的HEK293细胞系中，TG-GFP的表达情况并非如此（数据未显示）。四环素处理24小时后，诱导蛋白的水平与未处理细胞的内源性水平相似，与Flp-in系统提供的单位点整合一致。诱导时间越长（72小时），TG-TDP43水平越高，内源性TDP-43总耗竭。

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诱导野生型和突变型TDP-43在HEK293细胞中的表达。标记形式的TDP-43（F-TDP43）在四环素（Tet）诱导（1μg/ml）下表达24或72小时。左图是不同TDP-43蛋白结构域的示意图，编号表示氨基酸残基。N末端域标签由散列框表示，RNA识别基序1和2分别显示为黑色和灰色框。突变体Δ321-366中C末端区域的缺失被描述为一个白盒。右边的面板是蛋白质提取物的免疫印迹分析，带有检测内源性（末端）和标记（TG-TDP43）蛋白质的TDP-43抗体。使用Tubulin作为负荷对照。

自动调节需要TDP-43的RRM1和C端域

为了开始探讨TDP-43的自我调节机制，我们研究了关键TDP-43区域的重要性(图1). 这些变体在HEK293 Flp-in系统中表达为FLAG-tagged TDP-43。RRM1和RRM2分别被双位点突变F147/149L和F229/231L破坏，两个RNA-结合域同时被突变F147/1249/231L（F4L）靶向。此外，321–366区域从C末端结构域（Δ321–365）中删除。Western blot分析表明，RRM1突变体即使在诱导72小时后也不能抑制内源性TDP-43的表达(图1F147/149L），以及RRM1和RRM2均被破坏的突变体（F4L）。然而，仅携带RRM2突变的TDP-43（F229/231L）对内源性TDP-43的抑制没有影响。最后，在C末端缺失的情况下，变异体Δ321-366的表达在72小时后没有改变内源性TDP-43水平，即使在转基因诱导120小时后也没有改变(图1和数据未显示）。这些结果表明，自我调节是由RNA-TDP-43相互作用介导的，需要通过321-366个C末端区域招募额外的因子。

TDP-43自我调节发生在转录水平

接下来，我们通过northern blot分析研究TDP-43过表达是否同样抑制内源性转录水平。我们的实验，使用内源性TDP-43特异探针（如中箭头所示图2A)，确定了与聚腺苷化位点的不同使用相对应的两种主要亚型。TDP-43的3′UTR的生物信息学分析预测了4个多聚腺苷酸化信号位于3′UTRs的后半部分(图2A). 然而，对数据库（UC Santa Cruz基因组浏览器）中报告的TDP-43 EST的分析表明，标记为pA的聚腺苷酸化位点几乎是唯一的使用1和pA4预测分子量分别为2.8和4.2 Kb。在EST数据库中还发现了一种次要形式，我们称之为V2，由于基因3′端的内含子激活，其分子量较小。在我们的northern blot分析（V1）中检测到的两种主要亚型与pA的使用兼容1和pA4(图2B，左起第一条车道，WT，Tet−）。

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TDP-43负性自身调节发生在转录水平。(A类)具有编码外显子和非翻译区的TDP-43基因的示意图分别以黑色和灰色显示。显示了各种预测的聚腺苷化信号，其中(*)表示实验验证的站点。这两种主要表达的内源性亚型（V1pA1和V1pA4)显示包括仅包含编码序列的转基因TG-TDP43转录本。V2形式对应于中讨论的次要亚型补充图2. (B类)对照组和诱导24和72小时后的Northern杂交分析。V1pA型1和V1pA4分别对应于2.8和4.2 Kb频带。通过探测箭头指示的区域，检测内源性TDP-43转录物(A类)，而TG-TDP43是用一个横跨外显子2和3的探针鉴定的。GAPDH检测作为负荷控制。

通过northern blot分析比较内源性TDP-43转录水平作为TG-TDP43表达的功能，发现在四环素诱导中TDP-43 mRNA亚型显著减少(图2B第二条车道，WT，Tet+）。在TG-TDP43表达24和72小时后，RRM1（F147/149L和F4L）突变和Δ321-366缺失阻止了内源性TDP-43 mRNA的显著调节(图2B). 同样，RRM2突变体与野生型没有区别。这些发现与显示RRM1和321-366区域对TDP-43负性自我调节的需求的免疫印迹结果一致。

TDP-43自动调节涉及3′UTR结合元件

western blot分析中观察到TG-TDP43随时间的累积(图1)提示诱导型TDP-43与内源性TDP-43不同，不受负反馈回路的自我调节。内源性和转基因TDP-43转录物之间的一个显著结构差异是TG-TDP43中缺少相应的3′UTR(图2A)这意味着该地区可能包含重要的监管元素。当然，野生型转基因和内源性TDP-43基因之间还存在其他重要的差异（即内含子和不同的启动子的存在），然而，出于几个原因，我们首先关注3′UTR区域。首先，关于内含子的缺失，必须考虑到TDP-43的3′UTR区域在不同物种之间高度保守，而没有一个内含子区域具有相似的保守程度（参见补充图1). 我们还知道，进化保护可能对自我调节非常重要，因为三个杂合转基因敲除小鼠模型表明，+/-小鼠产生的TDP-43蛋白和mRNA数量与野生型+/+小鼠相同(Kraemer等人，2010年;Sephton等人，2010年;Wu等人，2010年). 其次，关于不同启动子的使用，应该认为在使用不同启动子构建的异源报告子中仍然可以观察到自身调节，这将在后面讨论。最后，值得注意的是，使用两种不同的系统生产稳定的细胞株也排除了由附在转基因TDP-43上的蛋白标签序列介导的人为效应，因为这两种系统中的蛋白质标签序列彼此不同：FLAG和链亲和素结合肽融合到血凝素表位标签。

关于3′UTR，最近在HEK293细胞中进行的交联免疫沉淀（CLIP）分析确定，TDP-43与其自身转录物3′UTRs内的几个RNA序列相关体内(图3)在我们称为TDP-43结合区（TDPBR，图3A). 为了确认TDP-43与这些序列的结合，我们首先在整个区域使用片段（片段（frg.）1-4）进行了电迁移率变化分析（EMSA）。如所示图3B右面板中，包含大多数CLIP序列/簇的片段2和3可以有效地结合TDP-43，而仅包含一个或无（分别）扩展CLIP序列或簇的片段1和4则无法观察到绑定。

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TDP-43特异性结合其3′UTR区域。(A类)描述TDPBR位置和序列的TDP-43基因示意图(B类，片段2和3）位于3′UTR内。编码外显子和未翻译区域分别以黑色和灰色显示。(B类)在左侧面板中，报告了TDP-43的3′UTR区域以及测试TDP-43结合的不同区域（图1-4）。在此面板中，不同实验报告的所有CLIP序列/簇（J Ule和J Tollervey未发布的结果）均以粗体突出显示。HEK 293细胞中主要的34-nt CLIP序列，用于比较结合分析(C类——电子)已装箱。右边是使用这些不同片段的重组TDP-43的带移分析。(C类)分析GST-TDP43突变体与主要34-nt CLIP序列（装箱）和（GU）的结合6RNA作为对照。(天，电子)使用恒定水平的野生型蛋白质结合放射性标记（GU）的竞争分析6作为未标记的34nt CLIP序列浓度增加的函数(天)或与放射性标记的34-nt CLIP序列结合，作为未标记浓度（GU）增加的函数6。每个小组的第一条通道都没有蛋白质。～0.5μg不同的重组蛋白与1 ng不同的5′标记单链RNA寡核苷酸一起使用。利用2.5、3.75、5和10 ng未标记的34-nt CLIP序列和（GU）进行竞争分析6.

34核苷酸盒序列（34 nt）图3B（frg.2）是HEK 293细胞中TDP-43的CLIP检测中点击密度较高的一个。然而，由于它不是规范（GU）n个已知重复序列是该蛋白的首选靶点，我们认为有必要研究与（GU）相比的34 nt-结合效率6.图3C结果表明，野生型TDP-43和RRM2突变体（F229/231L）特异性结合34 nt序列，而RRM1变异体（F147/149L）没有像预期的那样产生位移。这些结果与我们的体内分析表明，对RRM1的破坏缺乏监管控制，RRM2没有明显作用(图1和​和2）。2). 比较TDP-43与34 nt和（UG）的结合效率6RNAs，然后我们在存在竞争数量的未标记RNA的情况下进行EMSA。TDP-43与34 nt的结合有效地与不断增加的（UG）竞争6RNA，而需要较高浓度的TDPBR RNA才能看到TDP-43与（UG）的相关性降低6(图3D和E）。总的来说，我们的数据表明TDP-43与这些序列的关联是特定的，尽管与UG重复绑定相比，这种关联的效率似乎更低。较低的亲和力可能是通过3′UTR的大区域传播的调控序列所需要的，该区域需要TDP 43的多个分子来诱导反应。

评估TDPBR区域在异源环境中的重要性

为了测试TDP-43 mRNA 3′UTR中发现的TDP-43结合位点的自我调节功能，我们使用了包含外显子5和6的重组构建物（GFP-3′UTRwt），以及TDP-43的3′UTR-序列，融合到GFP报告序列的C末端（在图4A). 这种结构提供了在异源环境中测试自身调节机制的优势，并且比内源性基因更容易操作。当转染到我们的可诱导HEK293细胞系时，在Tet诱导后，GFP-3′UTR wt结构的GFP表达水平降低(图4B，上部面板），这一结果与以下结论一致，即TDP-43的下调作用除此系统中克隆的序列外，不涉及额外的TDP-43外显子或内含子。此外，用于正常化转染效率的转染GFP野生型蛋白未观察到下调(图4B，下部面板）。然后，我们设计了异源构建体，其中我们在TDP-43结合位点的整个区域逐渐删除了3′UTR。两种结构（GFP-3′UTRΔ369和Δ669，图4A)当转染到可诱导的HEK293细胞系中时，清楚地显示出部分和完全的自我调节丧失。事实上，它可以在图4B与GFP-3′UTR wt相比，Tet诱导后GFP蛋白表达水平的下调在Δ369结构中显著降低，并最终在Δ669结构中消除。有趣的是，我们的western blot分析也强调了在属于GFP-3′UTRΔ369和Δ669结构的通道中产生约40kDa的较小的含GFP的蛋白质（Δ1812）（见下文）。

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TDP-43的3′UTR中的一个区域介导自动调节(A类)GFP-3′UTR wt和Δ369和Δ669构造的示意图。野生型TDP-43编码序列以灰色显示。下部面板显示导致Δ1812 mRNA和蛋白质亚型的剪接事件。(B类)在TG-TDP43转基因诱导（+）后，将GFP-3′UTR wt、Δ369和Δ669构建物转染到HEK293稳定细胞系时，GFP蛋白表达。通过联合转染GFP表达载体，使转染效率标准化（下表）。在GFP-3′UTRΔ369和Δ669（−）和（+）泳道中，蛋白质印迹还包含一个额外的40kDa蛋白带，称为Δ1812。用抗GFP检测不同蛋白(C类)显示了对HEK293稳定细胞系中GFP-3′UTR wt、Δ369和Δ669结构的转录物在Tet诱导前后的northern blot分析。由于使用不同的多聚腺苷化位点，所有构建物都产生两种主要的mRNA物种。除这些物种外，GFP-3′UTRΔ369和Δ669构建物还产生异常剪接mRNA亚型（Δ1812），该亚型解释了western blots中异常蛋白的产生(B类).

同时，我们进行了northern blot分析，以证实在Δ369和Δ669构建物的mRNA水平上没有出现预期的自我调节。首先，应该注意的是，对于所有三个结构体（wt、Δ369和Δ669），我们观察到存在两个主要的条带，这两个条带正确地模拟了图2和​和5。5与内源性TDP-43转录物的结果一致，图4C显示，与GFP-3′UTR wt结构相对应的两个信号在Tet诱导后完全消失（这在用于正常化的对照GFP中没有发生，见底部面板）。另一方面，GFP-3′UTRΔ369和Δ669结构的所有相应信号均逐渐不受Tet诱导的影响（注意，由于TDPBR中的大量缺失，这些信号的迁移低于GFP-3’UTR wt转录本）。然而，在删除的结构中，也可以看到新的mRNA物种（Δ1812）。RT-PCR和该条带的测序分析发现，该条带属于mRNA物种，由最后一个外显子的选择性剪接产生，类似于图2A和补充图2在Δ1812形式中，由于Δ369和Δ669结构中外显子7的5′剪接位点缺失，外显子和内含子7被剪接出来（参见图4A). 就是这个带，标记为Δ1812英寸图4B，这解释了短异常蛋白的产生（图4A还显示了新的编码帧）。

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TDP-43自动调节独立于NMD。(A类)EST数据库中发现存在激活两个下游内含子（V2）删除的选择性剪接。短型V2被视为接受NMD(补充图2)，而northern blot分析(B类)在有无CHX治疗（50μg/ml，持续3 h）的情况下，对照组和Tet诱导的样品中均未检测到V2的存在。V2的MW应为1.2或2.5 Kb，具体取决于poly a站点的使用情况。探针是用中所示的引物产生的(A类)然后纯化对应于V2的产品。

总之，这些结果表明，下调TDP-43 mRNA的重要序列是由TDPBR区域中的一组紧密定位的结合位点组成的。接下来，我们决定也研究参与这一自我调节过程的分子机制。

非感官介导的衰变

基于之前描述的其他hnRNP的自动调节机制(Wollerton等人，2004年;Rossbach等人，2009年)，我们首先考虑了与非传感介导衰变（NMD）耦合的选择性剪接修饰作为解释TDP-43自我调节的可能机制。在Tet诱导后，PCR没有显示TDP-43 mRNA模式的变化(补充图2). 然而，这些分析确实表明在对照细胞和诱导细胞中存在一种称为V2的低分子量形式(图5A和补充图2). 环己胺（CHX）治疗表明，只有V2会受到NMD的影响。然而，从功能角度来看，应该注意V2 mRNA的水平很低，只有PCR才能清楚地看到（参见补充图2B)而在northern blot分析中没有(图5B). 同时，在TG-TDP43诱导下抑制NMD过程后，未发现从该亚型衍生出的相应蛋白质的显著数量（数据未显示）。因此，尽管我们不能排除V2和NMD在通过替代途径或在不同系统中调节TDP-43中的作用，其中该亚型可能在更高水平上表达，但我们得出结论，在我们的细胞系中不太可能介导TDP-43自我调节。

TDP-43的过度表达促进其自身转录物的不稳定性

作为第二种可能性，我们检测了内源性TDP-43转录物的稳定性，作为TG-TDP43在HEK293细胞系中表达的功能。我们首先确定了Tet诱导的最短时间，使我们能够充分测量内源性转录水平（数据未显示）。通过定量PCR（qPCR），6小时的诱导期导致内源性TDP-43水平下降20-30%。然后在Tet诱导后6 h用放线菌素D（ActD）处理细胞以阻断转录，并在不同时间点收集细胞以及对照处理的细胞。如所示图6A，TG-TDP43表达导致qPCR测定的内源性转录物半衰期缩短。我们通过在不同时间点用特定引物测量TG-TDP43的水平，证实了在Act D治疗中TG-TDP43-转录水平也降低（数据未显示），从而证实了在我们的实验条件下转录的阻滞。更重要的是，该对照表明内源性TDP-43水平随时间的推移而降低并不是由于TG-TDP43表达增加。

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TDP-43过度表达以外显体依赖的方式促进RNA不稳定性。(A类)对HEK293对照细胞和诱导细胞进行ActD（5μg/ml）处理后，估计转录物半衰期。用qPCR分析指定时间的转录水平。不同时间点的相对表达水平根据时间0、（−）和（+）Tet诱导时的水平进行标准化（分别为空圆圈和实心圆圈）。(B类)在对照细胞和诱导细胞中同时沉默外显子组分PM/Scl-100和DIS3，并在western blot中观察其对TDP-43表达水平的影响。(C类)不同条件下内源性TDP-43蛋白水平的定量根据p84水平进行标准化。误差线，s.e.m。；n个=两个面板的3个实验。(天)−Tet和+Tet条件下内源性TDP-43 mRNA水平的mRNA表达水平。两种转录水平均归一化为GAPDH mRNA水平，并通过实时qPCR测定。mRNA水平分别量化为三倍，获得的标准偏差值显示在条形图上。

最后，我们通过研究两种关键的外泌体成分PM/Scl-100（Rrp6）和DIS3（Rrp44）的作用，评估了外泌体机制在TDP-43自我调节中的作用，这两种成分参与哺乳动物细胞的细胞核和细胞质RNA降解(Mitchell等人，1997年;范霍夫和帕克，1999年;巴特勒，2002;Lejeune等人，2003年). 同时敲低PM/Scl-100和DIS3可减少TG-TDP43诱导后内源性TDP-43表达的抑制。通过比较对照处理细胞与PM/Scl-100和DIS3敲除细胞中–Tet和+Tet条件下内源性TDP-43水平的差异可以观察到这一点(图6B和C). 对照siRNA在非诱导细胞中的转染以及Tet诱导24小时后，导致Tet治疗中内源性TDP-43水平降低70%，而RNAi的外体破坏在诱导后将TDP-43降低50%（通道2/1和4/3之间的比较比率）。这些结果可能被低估了，因为RNAi处理48小时后，在没有Tet诱导的情况下，外泌体成分的沉默足以导致内源性TDP-43水平增加两倍(图6B，比较车道1和3）。使用qPCR，我们还测量了在−Tet和+Tet条件下外显体组分敲除后内源性TDP-43 mRNA的水平(图6D). 这些结果表明，外显子组分敲除后TDP-43内源性水平的增加仅在+Tet样本中明显。这一观察结果表明，只有当细胞中表达大量总TDP-43蛋白时，用于外泌体降解的内源性TDP-43 mRNA底物才会增加。

讨论

据报道，许多RNA加工因子通过负反馈回路调节蛋白质水平，包括SR蛋白SC35和SF2，以及hnRNP成员PTB和hnRNP-L(Sureau等人，2001年;Wollerton等人，2004年;Lareau等人，2007年;Ni等人，2007年;Saltzman等人，2008年;Rossbach等人，2009年;Sun等人，2010年). 在所有这些情况下，通过过量存在的蛋白质分子下调转录水平，有效且持续地控制内源性蛋白质的同源性。对于蛋白质的丰度导致细胞毒性的蛋白质来说，表达的自我调节变得尤为重要。在这项研究中，我们报告TDP-43在转录水平上作为自身表达的调节器体内通过与高度保守的3′UTR结合的机制，特别是与我们称为TDPBR的扩展区域结合(图7). 与这些结果一致，不结合RNA的TDP-43突变体失去了控制内源性转录水平的能力。有趣的是，我们的观察表明，321-366区域中TDP-43 C结构域的完整性对于这种自动调节也是必要的。对该结构域在自我调节过程中的作用的理解需要进一步研究，可能涉及hnRNP的招募，因为这些蛋白质，主要是hnRNP-A2，已被证明与该序列相关。此外，TDP-43功能（如拼接控制）需要这种交互的完整性(D'Ambrogio等人，2009年). 该元素的另一个有趣的特征是TDPBR区域中的TDP-43结合序列不是由连续序列（UG）构成的n个重复序列，代表该蛋白的最高亲和力结合序列。然而，在这种特殊情况下，从调节过程的角度来看，TDP-43对这些单个序列的较低亲和力可能更适合通过3′UTR的大区域传播，因为可能需要多个TDP-43分子来诱导应答。

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TDP-43表达模型的调控。内源性或转基因TDP-43（TG-TDP43）蛋白与TDP-43转录物的3′UTR中发现的TDPBR结合。这种TDP-43–RNA相互作用与其他可能的事件一起促进了RNA的不稳定性和降解，导致TDP-43基因表达水平降低。

在目前的工作中，我们还研究了与TDP-43自动调节相关的可能机制。我们的实验表明，在HEK293细胞中，TDP-43优先使用两个聚腺苷酸化位点，这两个位点之间的距离约为1.5 Kb(图2). 近端多聚腺苷酸化位点（pA）的使用1，2.8 Kb mRNA）似乎略高于更远端的pA4位点（4.2 Kb mRNA）(图2)northern blot和PCR分析表明，TG-TDP43的表达似乎在很大程度上没有改变多聚腺苷化位点的使用。

关于这种自我调节的机制，应该注意到一些TDP-43相关蛋白主要依赖选择性剪接和NMD机制进行自我调节(Wollerton等人，2004年;Rossbach等人，2009年). 尽管我们已经证实这种机制可能解释了所选择的TDP-43 mRNA亚型（即V2）的调节，但我们的发现表明，TDP-43通过4.2和2.8kb转录物的自我调节并不依赖于这些系统，TG-TDP43诱导后，北部印迹中没有任何额外的显著mRNA物种(图2)和/或CHX治疗（参见图5和补充数据). 因此，为了建立这些主要转录物的调节机制，我们通过估计TDP-43 mRNA的衰变动力学来检查RNA稳定性的作用(图6). 与对照条件相比，诱导的TDP-43的表达降低了内源性转录物的半衰期。一贯地，两个主要外显子组分PM/Scl-100和DIS3的沉默也部分抑制TDP-43负反馈回路，尤其是在存在TDP-43过度表达的Tet+条件下。目前，我们无法解释在−Tet条件下，稳定的mRNA水平和增加的内源性TDP-43蛋白水平之间的非相关性(图6C和D). 在这种情况下，其他因素可能在调节TDP-43水平方面发挥作用，例如翻译或储存过程中的变化，这需要进一步调查。

TDP-43和该复合物的某些成分之间的直接联系也支持了外显子复合体参与TDP-43的自动调节，正如由Lehner和Sanderson（2004）使用酵母双杂交筛选方法，这些作者报告TDP-43与PM/Scl-100和Xrn2/Rat1的HRDC域相互作用。

此外，应该考虑到，TDP-43与其3′UTR的结合几乎肯定不是细胞内保持该蛋白水平恒定的唯一检查点。首先，考虑到TDP-43的>3000长3′UTR的高度保守性，很可能还有其他几个相互作用参与该过程的微调。第二，最近研究表明，蛋白质半衰期在不同的细胞系中发生了相当大的变化，这表明在翻译后水平上也可能发生调节(Ling等人，2010年《美国国家科学院院刊》）。第三，不能排除转录或翻译水平上的某种调节。因此，我们预计需要进行更多的研究，以更好地解决这个问题。最近关于大量基于外源性TDP-43过度表达的动物模型的报告可能会让我们对这一过程进行更详细的研究。

我们在细胞系中描述的TDP-43自体控制在动物模型中也有效的证据间接来自最近一份关于表达A315T TDP-43突变体的转基因小鼠的报告(Wegorzewska等人，2009年). 作者展示了脑裂解物的免疫印迹，其中内源性TDP-43水平在FLAG标记蛋白的存在下降低。虽然作者没有对这种减少发表评论，但这一观察表明TDP-43自我调节在整个机体中也很活跃。最近，一个表达野生型人类TDP-43的小鼠模型证实，人类蛋白的表达可以剂量依赖性下调小鼠TDP-43蛋白和mRNA水平图1C和补充图1C、D在里面Xu等人，2010年.

我们的发现也引发了一些关于TDP-43转录下调相关特殊机制的问题(图7). 例如，RNA稳定性的变化是否发生在细胞核、细胞质或特定的亚细胞隔室中？它与转录、翻译、3′UTR相关降解途径的激活或转录物聚腺苷化状态的变化有关吗？这些和其他问题将需要进一步的研究来理解TDP-43的自动调节，并可能揭示额外的TDP-43控制转录物的调节。事实上，位于与TDP-43基因中TDPBR相似区域的其他基因中TDP-43靶序列的丰富性（J Ule、J Tollervey和A D’Ambrogio，未发表的观察结果）表明，TDP-43的这种调控机制可能并不局限于其自身的转录物。因此，寻找更多的mRNA示例，尤其是运动神经元特异性转录物的mRNA实例，可能会解释TDP-43在神经肌肉接头发育中的作用，这将是非常有意义的(Feiguin等人，2009年).

综上所述，我们对TDP-43自身调节的研究结果也可能对理解TDP-43蛋白病的机制做出重要贡献。事实上，我们假设TDP-43自动调节的中断会导致蛋白质的异常积累。因此，最近关于秀丽隐杆线虫、鼠标和果蝇属TDP-43过表达模型表明，增加野生型蛋白水平就足以获得类似病理学的表型(Ash等人，2010年;Li等人，2010年;Tsai等人，2010年;Wils等人，2010年;Xu等人，2010年). 还应考虑到，细胞用来克服自身调节水平缺陷的最终补偿机制也可能导致一定程度的细胞痛苦。因此，即使在这种条件下成功维持正常蛋白质水平，从长远来看，细胞的这种额外努力可能是有害的。这一考虑可能有助于解释为什么具有较长寿命和复杂结构的神经元在这些病理学中特别具有靶向性。

我们的数据还表明，TDP-43的C末端区域321-366参与了自动调节。这表明，在患者中发现的TDP-43突变可能通过改变自我调节所需的蛋白质复合物的募集来干扰其同源性控制。然而，没有观察到与hnRNP相互作用的显著变化在体外到目前为止，该地区的基因突变检测(D'Ambrogio等人，2009年)因此，321-366区域在抑制自身调节方面的作用仍需阐明。然而，从更广泛的角度来看，在一小部分家族型ALS患者中描述的所有突变中（最近由Pesiridis等人，2009年)，只有D169G突变可能潜在地干扰了其自身调节过程(Kabashi等人，2008年). 这种突变发生在可能影响TDP-43的RNA结合特性的区域。然而，为了解决这种可能性，我们现在将该突变表达为GST-TDP43融合蛋白。我们的实验表明，它的RNA和hnRNP结合能力（两者都是自动调节所必需的）似乎与野生型蛋白质的结合能力没有明显差异，至少在我们的实验条件限制范围内是如此(补充图3). 尽管如此，TDP-43突变可能干扰了自身调节过程，因为最近有研究表明，较高水平的转录表达与ALS和FTD患者3′UTR区域的突变有关(Gitcho等人，2009年).

最后，我们的观察也可以解释TDP-43的RNA-结合区没有报告突变。TDP-43的RNA-结合能力的任何显著改变都可能立即有害，首先是因为自身调节机制的破坏。此外，独立于突变的存在，我们推测TDP-43的核或细胞质聚集（典型的TDP-43蛋白病）可能通过隔离功能蛋白而打破自我调节周期，从而增加TDP-43产量。这项工作还表明，旨在研究涉及外源性蛋白表达的TDP-43变体的作用的研究应保持浓度不超过内源性水平。

材料和方法

质粒构建

这个TDP-43型生成cDNA载体，表达野生型TDP-43，标记有链亲和素结合肽加血凝素肽（pSH-TDP43）或氨基末端的FLAG（pF-wt）。通过使用GWTDPwtFW和RV引物进行扩增并克隆到pDONR221中，利用Invitrogen的Gateway技术生成pSH-TDP43。该载体用于将SH-TDP43引入由M Gstaiger慷慨提供的pcDNA5/FRT/to/SH/GW载体中。FLAG标记的野生型和TDP-43突变体是通过标准PCR方法产生的。用EcoRVpFTDPFW和EcoRVTDPRV扩增pF-wt，然后作为模板构建各种突变体。pF-F147/149L、pF-F229/231L、pF-F4L和pF-Δ321-366是用前面描述的引物产生的(Buratti和Baralle，2001年;D'Ambrogio等人，2009年). 然后通过pcDNA5/FRT/to（Invitrogen）的EcoR V裂解生成表达标记了FLAG的TDP-43的载体。为了获得GFP-3′UTR结构，从TDP-43第五外显子开始到第四个预测的聚腺苷酸化信号（pA4)使用以下引物XbaBglx5FW和Hind5000RV从人类基因组DNA中扩增。然后使用Bgl公司II和后面的通过测序验证了三个位点和结构。缺失Δ369和Δ669是通过使用普夫I聚合酶带有引物Δ369FW、Δ369 RV、Δ669 FW和Δ669RV，然后是Dpn公司我消化（Promega）。用于克隆、siRNA实验、northern blot分析和EMSA的引物序列见补充数据.

细胞培养和RNA干扰

通过Flp-重组酶介导的重组，在HEK293细胞（Invitrogen）中实现HA-Strep-TDP-43（SH-TDP43）和FLAG-标记的TDP-43变体（F-TDP43）的稳定表达，然后选择潮霉素B（InvivoGen）。每个表达TDP-43的载体和表达Flp重组酶（Invitrogen）的pOG44载体与效应基因转染试剂（Qiagen）共同转染，并逐渐用高达200 mg/ml浓度的Hygromycin B筛选。通过有限稀释获得单个克隆。用1μg/ml四环素（Sigma）诱导标记的TDP-43（TG-TDP43）表达。细胞在补充有10%胎牛血清（EuroClone）的DMEM-Glutamax-I（GIBCO）中生长。按照说明执行Upf-1静音(Matsuda等人，2008年)使用Upf1siRNA(补充表一(Kim等人，2005年)). 按照制造商的说明，使用Hiperfect（Qiagen）对PM/Scl-100和Dis3进行沉默，寡核苷酸列于补充数据.

免疫印迹法

在15 mM HEPES（pH 7.5）、0.25 M NaCl、0.5%NP-40、10%甘油、1x蛋白酶抑制剂（Roche 1873580）、25 mM NaF、10 mMβ-甘油磷酸盐、0.2 mM Na中制备细胞提取物三VO（旁白）4和1 mM苯甲基磺酰基氟化物。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素（0.45μM，Amersham Biosciences）中，蛋白质检测采用标准的western印迹技术。使用的抗体：TDP-43（ProteinTech Group 10782-2-AP和前面描述的(Buratti等人，2001年))、p84（Abcam ab487）、微管蛋白（Sigma T5168）、Upf1（Santa Cruz Biotechnology sc-18260）、PM/Scl-100（Abcam-ab50558）和DIS3（Abcam-ab68570）。

Northern印迹

按照制造商的说明，用TRI试剂（Sigma）分离RNA。将RNA样品（10μg，除非另有说明）装入1%甲醛琼脂糖凝胶中，转移至Hybond N+尼龙膜（Amersham Biosciences），内部探测32ULTRAhyb预杂交后的P标记序列®超灵敏杂交缓冲液（Ambion）。预杂交和杂交在50°C下进行。探针由PCR产生，使用的引物如补充数据并使用Rediprime II DNA标签系统（GE Healthcare）进行标记。检测GAPDH的探针的生成如所述(Muro等人，2003年). 使用Cyclone Plus存储荧光扫描仪和包含的OptiQuant软件（Perkin Elmer）对转录本进行可视化。

聚合酶链式反应分析

在CFX96实时PCR检测系统（BIO-RAD）上使用iQ SYBR Green Supermix进行qPCR。检测所有TDP-43变体的引物如下：RThx2FW、RThx3RV；RThV1x6FWd、RThV1x6RVd；以及用于内源性V1和V2转录物的RThV2x7FW、RThV2x8RVb，特别是；GAPDH:GAPDHFW、GAPDHRV。在95°C下进行15〃PCR，在60°C下执行1′PCR，共45个周期，然后执行热变性方案。使用2-ΔΔCT方法(Livak和Schmittgen，2001年). 显著差异由学生的t吨-测试，其中P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

RNA夹子

如前所述执行CLIP cDNA文库和高通量测序(Wang等人，2009年)进行了以下修改。TDP-43抗体（Proteintech 10782-2-AP）用于免疫沉淀。cDNA文库在Illumina Genome Analyzer上使用配对法测序，每个方向的读长度为36 nt。5′和3′RNA连接子包含一个三核苷酸条形码AAA，在映射到人类基因组序列（版本Hg18/NCBI36）之前从序列中删除，使用Bowtie版本0.10.1（命令行：-a-m 1-v 1）允许1个失配。31438个独特的序列已映射到基因组，其中一个序列是GAGAGCGCGTGCAGAGAGACTGTGCAT，它映射到TDP-43的3′UTR。

结合分析

如前所述，生产重组GST-TDP-43和EMSA(Buratti和Baralle，2001年;Ayala等人，2005年).

补充材料

补充数据：
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审查过程文件：
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致谢

我们感谢M Gstaiger（瑞士苏黎世理工大学分子系统生物学研究所）提供的pcDNA5/FRT/TO/SH/GW载体，M Morgan（意大利的里雅斯特ICGEB）提供的EST分析帮助，T Curk（斯洛文尼亚卢布尔雅那人工智能实验室）提供的CLIP数据的生物信息学分析，以及S Dhir（意大利的里雅斯特ICGEB）用于TDP-43基因序列的生物信息学分析。这项工作得到了AriSLA和欧盟EURASNET的支持[赠款编号SHG-CT-2005-518238至FEB]。

脚注

提交人声明他们没有利益冲突。

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