跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
摩尔癌症治疗。作者手稿；PMC 2011年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
摩尔癌症治疗。2010年12月；9(12): 3186–3199.
2010年10月1日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1535-7163.MCT-10-0563
预防性维修识别码：项目经理3005138
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院241914
PMID：20889728

以醛脱氢酶肿瘤干细胞为靶点治疗卵巢癌

查尔斯·兰登。,1,* 布莱克·古德曼,2 阿什维尼·A·卡特尔,1 亚当·D·斯特格,1 阿尔帕·M·尼克,2 丽贝卡·L·斯通,2 兰斯·D·米勒,三 巴勃罗·维瓦斯·梅加,4,5 尼古拉斯·B·詹宁斯,2 大卫·M·格尔森,2 小罗伯特·C·巴斯特。,4 罗伯特·科尔曼,2,7 加布里埃尔·洛佩斯·贝雷斯坦,4,6,7和阿尼尔·K·苏德2,6,7
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）的表达表征了几种恶性肿瘤中具有肿瘤起始或癌症干细胞特性的细胞亚群。我们的目标是描述ALDH1A1阳性卵巢癌细胞的表型，并检查ALDH1A2基因沉默的生物学效应。在我们对多个卵巢癌细胞系的分析中，我们发现ALDH1A1在紫杉烷和铂耐药细胞系中的表达和活性明显较高。在患者样本中，72.9%的卵巢癌有ALDH1A1表达，其中ALDH1A1-阳性细胞百分比与无进展生存期呈负相关（6.05 vs 13.81个月，p<0.035）。分离出具有ALDH1A1活性的A2780cp20细胞亚群，用于原位肿瘤启动研究，其中ALDH1A1-阳性细胞的致瘤性大约高出50倍。有趣的是，来自ALDH1A1阳性细胞的肿瘤可同时产生ALDH1A1-阳性和ALDH1A1-阴性细胞群，但ALDH1B1阴性细胞不能产生ALDH1A阳性细胞。在一个体内卵巢癌原位小鼠模型，使用纳米脂质体siRNA沉默ALDH1A1，使紫杉烷和铂耐药细胞系对化疗敏感，与单独化疗相比，显著降低了小鼠的肿瘤生长（减少74-90%，p<0.015）。这些数据表明，ALDH1A1亚群与卵巢癌患者的化疗耐药和预后相关，靶向ALDH1A2可使耐药细胞对化疗敏感。ALDH1A1阳性细胞的致瘤性增强，但不是绝对的，但具有ALDH1A1-阴性细胞缺乏的分化能力。这种酶可能对卵巢癌耐药细胞群的鉴定和靶向性很重要。

关键词：醛脱氢酶、化疗耐药、肿瘤干细胞、小干扰RNA、卵巢癌

简介

预计2009年将有21550名女性被诊断出卵巢癌，14600名女性因此丧命(1). 尽管卵巢癌在初次治疗时（手术和紫杉烷/铂类化疗）是化疗最敏感的恶性肿瘤之一，但大多数患者都会发生肿瘤复发并死于化疗耐药疾病(2). 了解卵巢癌细胞亚群存活的介导机制对于显著改善这种疾病的预后是必要的。

在许多恶性肿瘤中，被称为“肿瘤干细胞”（CSC）或“肿瘤起始细胞”（TICs）的恶性细胞亚群被假设为代表异质肿瘤中最具致瘤性和抗治疗性的细胞。这些细胞产生小鼠异种移植物的能力增强，并产生由TIC和非TIC群体组成的异质性肿瘤，与大多数肿瘤细胞相比，这些细胞也可能更具化学耐药性，并依赖于独特的生物过程(三–4). 在卵巢癌中，CD44/c-kit阳性细胞的人群中已经发现了许多这些特性(5)，CD133阳性细胞(6–8)和Hoechst-排除细胞（“侧群”）(9).

在用于鉴定癌症干细胞的几种标记物中，醛脱氢酶-1A1（ALDH1A1）是几种恶性和非恶性组织的有效标记物(10–20). 它不仅是“干细胞”的潜在标记，而且还可能在TIC生物学中发挥作用，这一点很有吸引力(10). ALDH1A1是17种ALDH亚型之一，是一种细胞内酶，可氧化醛类，起解毒作用，并将视黄醇转化为视黄酸，调节分化途径。ALDH1A1人群定义为正常造血干细胞，用于分离用于患者干细胞移植的细胞。使用ALDEFLOUR分析（一种功能性流式细胞术分析，用于识别具有活性ALDH1A1、TIC富集人群的细胞），已在多种恶性肿瘤中发现(20)包括乳房(11–14)，冒号(15–16)，胰腺(17)，肺(18)和肝脏(19). ALDH1A1活性人群是否富含TIC，目前尚未证实卵巢癌。更重要的是，虽然ALDH1A1与化疗耐药途径有关，但目前尚不清楚靶向ALDH1A2是否能使耐药细胞对化疗敏感，因此是肿瘤干细胞导向治疗的潜在靶点。我们试图确定ALDH1A1在卵巢癌细胞系和患者样本中的表达特征，确定其是否包含TIC属性，并检查靶向ALDH1A2是否会使两种肿瘤细胞的化疗敏感性在体外和体内卵巢癌模型。

方法

细胞系和培养

卵巢癌细胞系SKOV3ip1、SKOV3 Trip2、HeyA8、HeyA 8MDR、A2780ip2、A2780 cp20、IGROV-AF1和IGROV-cp20(21–22)在添加15%胎牛血清（Hyclone、Logan、UT）的RPMI-1640培养基中保存。SKOV3TRip2（耐紫杉醇，Michael Seiden博士的一份礼物(23))添加150 nM紫杉醇维持HeyA8MDR。来自正常卵巢表面上皮的HIO-180 SV40永生化非肿瘤细胞系是Andrew Godwin博士的一份礼物。对所有细胞系进行常规筛选支原体物种（GenProbe检测试剂盒；Fisher，Itasca，IL），在70-80%融合培养基下进行实验。用STR基因组分析证实了细胞系的纯度，并且所使用的细胞从纯度测试的储备中总是少于20个传代。

全基因组分析

RNA是从三个独立的SKOV3ip1和SKOV3Grip2细胞集合中提取的，与RNeasy Mini Kit（德国希尔登市齐根）的80%融合。使用Illumina HumanRef-8表达珠芯片对RNA进行微阵列分析，该芯片针对约24500个注释良好的转录物。用三次样条方法对微阵列数据进行归一化(24)使用Illumina BeadStudio软件。差异表达基因的重要性通过学生的t检验确定，然后纠正错误发现(25). 使用Cluster 3.0和Java TreeView软件生成了热图。阵列数据已向GEO注册（加入#GSE23779标准)供公众使用。

蛋白质印迹分析

培养的细胞裂解物收集在改良的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液中，缓冲液中含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，曼海姆，德国），并通过标准技术进行免疫印迹分析(26)使用抗ALDH1A1抗体（BD Biosciences，San Jose，CA）在4°C下以1:1000稀释过夜，或使用抗β-肌动蛋白抗体（Sigma Chemical，St.Louis，MO）在1:2000稀释过晚。

免疫组织化学染色与临床相关性

使用标准技术对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品进行免疫组织化学（IHC）分析(26). 对于ALDH1A1，抗原回收在柠檬酸缓冲液中的常压蒸锅中进行45分钟，使用抗ALDH1A2抗体（BD Biosciences），在4°C的Cyto-Q试剂（Innovex Bioscinces，Richmond，CA）中以1:500的稀释度过夜。在RT时使用Mach 4 HRP聚合物（加利福尼亚州康科德市Biocare Medical）检测一级抗体20分钟，然后进行DAB培养。IHC染色后，ALDH1A1阳性的肿瘤细胞数量由一名对临床结果不知情的检查人员进行计数，并表示为所有肿瘤细胞的百分比。患者样本分为低表达（低于1%）、中等表达（1-20%）或高表达（21-100%）ALDH1A1。对65例未经治疗的Ⅲ-Ⅳ期高级别乳头状浆液性腺癌患者在初次去鳞状细胞手术时采集的样本进行IHC，并在IRB批准的情况下收集临床信息。采用Kaplan-Meier方法绘制各组患者ALDH1A1表达的无进展生存率和总生存率，并使用PASW 17.0与对数秩统计进行比较。

对于ALDH1A1和CD68（巨噬细胞）的双重染色，首先如上所述进行ALHD1A1染色，然后暴露于抗CD68抗体（1:4000，英国剑桥郡达科）和山羊抗鼠AP（Jackson Immunoresearch，宾夕法尼亚州西格罗夫）。AP是用Ferangi Blue铬试剂盒（Biocare Medical）开发的。对于ALDH1A1和缺氧肿瘤区域的双重染色，携带SKOV3TRip2异种移植物的小鼠注射60mg/kg Hypoxyprobe-1试剂（HPI，Inc，Burlington，MA）。对FFPE中的肿瘤切片进行上述抗原回收，然后在4°C下暴露于FITC-结合的抗缺氧原-1小鼠抗体（1:50）过夜。这是用HRP结合的抗FITC抗体（1:500，Jackson Immunoresearch）和DAB分辨率检测的。然后用抗鼠IgG F（ab'）2片段阻断内源性小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch），并用AP-结合的抗鼠Ig G和Ferangi Blue染色法对ALDH1A1进行上述染色。

ALDEFLUOR分析和限制稀释液的致瘤性

根据制造商的说明（StemCell Technologies，不列颠哥伦比亚省温哥华），通过ALDEFLOUR分析鉴定出活性ALDH1A1。ALDH1A1阳性人群由FITC信号增强的细胞定义，门由DEAB处理的细胞决定（DEAB是ALDH1A2活性的抑制剂）。对于致瘤性实验，使用FACS Aria II流式细胞仪（BD Biosciences）对来自A2780cp20细胞的ALDEFLOUR阳性人群进行分类，并重新分析以确认至少95%的阳性。清洗收集的细胞并将其重新悬浮在Ca中2+-和镁2+-游离Hanks平衡盐溶液（HBSS，Gibco），并以有限稀释度腹膜内注射（IP）到NOD Scid小鼠中，如图所示表2对小鼠进行1年的随访，或直到肿瘤形成，然后处死并进行组织学证实。为了对这些肿瘤进行流式细胞术分析，用手术刀机械分离异种移植物，通过70mm过滤器收集单细胞悬浮液，剩余的聚集细胞在0.5mg/mL胶原酶和0.0369mg/mL透明质酸酶（加州洛杉矶Calbiochem）中在37°C下孵育30分钟。这些经过化学消化的细胞再次通过70µm过滤器过滤，添加到初始收集中，并进行ALDEFLOUR分析。然后将ALDEFLOUR阳性细胞或阴性细胞注射到额外的小鼠（n=5）中，以检查其致瘤性的维持情况。

表2

ALDEFLOUR阳性和阴性细胞的致瘤性

A2780cp20电池
注入IP		100万25万10万2.5万5公里1公里序列号
移植
率
ALDEFLOUR-阴性5/54/52/52/50/50/50/5
ALDEFLOUR-阳性5/55/55/51/55/5

初级异种移植发育

在机构IRB和IACUC的批准下，在隔离诊断和管理所需的组织后，获得晚期卵巢癌患者多余的新鲜收集的大网膜转移瘤。3–4毫米三切片被切割并植入NOD-SCID小鼠背部皮下。提交相邻切片进行组织学分析以确认肿瘤。每周两次对肿瘤进行二维测量。观察到进行性生长后，对患有形成性肿瘤的小鼠进行载体或顺铂治疗（每周腹腔注射7.5mg/kg）。小鼠接受8周的治疗，然后处死并收获肿瘤。

SiRNA下调在体外

为了检测siRNA对ALDH1A1的下调作用，将细胞暴露于2.5µg/mL的对照siRNA（靶序列5'-AATTCTCCGAACGTGTCACGTCACGT-3'，Sigma，St.Louis，MO）或3种受试的ALDH1A1-靶向结构物之一（SASI_Hs01_00244055，00244056，或00303091，Sigma-），siRNA（µg）与Lipofectamine 2000（µL）的比率为1:3。在RT条件下，将脂质己内酰胺和siRNA孵育20分钟，添加到无血清RPMI中的细胞中孵育6小时，然后再添加15%的FBS/RMPI。转染细胞在37°C下培养48–72小时，然后收获用于Western Blot。

用化疗IC50和细胞周期分析评估细胞活力

将2000个细胞/孔置于一个96 well板中，暴露于浓度增加的多西紫杉醇或顺铂中，一式三份。通过0.15%MTT（Sigma）培养2小时和OD450分光光度计分析评估活性。为了研究siRNA对IC50的影响，将细胞与siRNA在6孔板中孵育24小时，然后将其重新放置在96孔板中，并在12小时后添加化疗以允许附着。通过计算药物具有50%疗效的剂量来确定IC50，计算公式为[（OD450马克斯−外径450最小值)/2） +外径450最小值]. 协同作用的测试采用Loewe加性模型(27)通过方程式CI=[D计算1/D类x1个]+[D2/D类2个]，其中CI（组合指数）为1表示加性效应，<1表示协同作用，>1表示对抗。对于细胞周期分析，将上述siRNA转染细胞72小时，胰蛋白酶化，在PBS中洗涤，并在75%乙醇中固定过夜。然后离心细胞，在PBS中洗涤x2，并在PBS中用50µg/mL碘化丙啶重组。通过流式细胞术评估PI荧光，并通过FlowJo的细胞周期分析模块计算每个周期中的细胞百分比。

原位卵巢癌模型和体内siRNA的传递

对于卵巢癌细胞系的原位治疗实验，从国家癌症研究所（Frederick，MD）购买雌性裸鼠（NCr-nu），并按照美国实验动物护理认证协会的指南进行护理。对于所有人体内实验中，胰蛋白酶化细胞悬浮在HBSS和106每个实验中，细胞向40只小鼠注射IP。1周后，将小鼠随机分为a）对照siRNA/DOPC；b） 控制siRNA/DOPC加化疗；c） ALDH1A1靶向siRNA/DOPC；或d）化疗加ALDH1A1靶向siRNA/DOPC。SiRNA/DOPC剂量为5µg，每周两次，体积为100µL IP。SKOV3TRip2的化疗剂量为多西紫杉醇35µg IP每周，A2780cp20的化疗剂量是顺铂160µg每周。小鼠在处死和收集肿瘤前接受4周的治疗。将SiRNA并入1,2-二油酰基-锡-如前所述的甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）中性纳米脂质体(28)，冷冻干燥，并在0.9%生理盐水中复原以供服用。

统计分析

如果数据符合正态性检验，则用双尾Student t检验对肿瘤重量的治疗组进行比较。用Mann-Whitney U统计检验了交替分布代表的数据。各组之间的差异具有统计学意义（p<0.05）。每组（n=10）的小鼠数量按照功率分析的指示进行选择，以检测肿瘤生长减少50%，β误差为0.2。通过使用Kaplan-Meier方法绘图和使用PASW 17.0软件使用log-rank统计评估统计差异，比较ALDH1A1三类染色患者的无进展生存率和总生存率。

结果

卵巢癌耐药细胞系的表达谱分析

为了发现介导紫杉烷抗性的基因，使用Illumina HumanRef-8 expression BeadChip进行微阵列分析，对亲本SKOV3ip1和紫杉烷耐药SKOV3Grip2细胞进行表达谱分析。SKOV3TRip2细胞系之前是通过紫杉醇（指定为SKOV3GR）的逐步暴露产生的(23)然后在小鼠中进行两代腹腔内（IP）传代，以选择具有增强致瘤性的种群。同样，SKOV3ip1来源于SKOV3亲代细胞，用于选择具有增强致瘤性的细胞。我们发现34个基因在SKOV3TRip2中上调了10倍以上(图1)其中ALDH1A1增加了92.7倍（p=0.0025）。SKOV3ip1中有20个基因增加了10倍以上。经MTT IC50测定，SKOV3TRip2细胞对多西紫杉醇的耐药性增加了约3000倍（62.5 nM vs.0.02 nM，图2A).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms241914f1.jpg
SKOV3TRip2和SKOV3 ip1细胞株全基因组表达谱的比较

使用Illumina平台对来自SKOV3TRip2和SKOV3 ip1细胞系的总RNA进行全基因组表达谱分析。SKOV3TRip2中增加超过10倍（FC倍变化）的基因显示为红色，SKOV3 ip1中增加超过十倍的基因显示绿色。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms241914f2.jpg
ALDH1A1在卵巢癌细胞系中的表达

A） 通过MTT活性测定，SKOV3TRip2卵巢癌细胞系的多西紫杉醇IC50大约是其亲本SKOV3 ip1细胞系的3000倍。B） 通过蛋白质印迹法在四对化学敏感性和化学抗性卵巢癌细胞系以及未转化的HIO-180正常卵巢表面上皮细胞系中表达ALDH1A1。在除HeyA8/HeyA8MDR外的所有病例中，这两个株系的表达量均极低，而耐药株系的ALDH1A1表达量均增加。C） 如通过ALDEFLUOR测定所测量的，A2780cp20（顺铂抗性）和SKOV3TRip2（紫杉烷抗性）也含有更高百分比的具有功能性ALDH1A1的细胞。D） 这些细胞系上ALDH1A1的免疫组织化学（IHC）证实了这一点在体外单个细胞呈阴性或强阳性，表明细胞系群体中ALDH1A1表达的异质性。低倍镜（4x）可以观察到ALDH1A1阳性细胞的不同菌落，而高倍镜（10x）检查显示单个A2780cp20和SKOV3TRip2细胞的ALDH1A1-阳性或阴性性质，但亲代A2780ip2和SKOV3ip1细胞中没有ALDH1A2。E） 这种异质性也存在于肿瘤异种移植物中，正如在小鼠体内生长的SKOV3TRip2肿瘤中的ALDH1A1的IHC所示（腹膜内位置由幻灯片右侧的正常胰腺组织确认）F）ALDH1A2的表达并不局限于缺氧细胞，如从给予低氧探针试剂的小鼠收集的异种移植物中所示，并对ALDH1A1（蓝色）和低氧探针副产物（棕色）进行co-IHC。比例尺在10x视图中表示50µm，在4x视图和（E，F）中表示100µm。

ALDH1A1在卵巢癌细胞系中的表达

为了证实ALDH1A1在SKOV3TRip2中的表达/活性增加，并检测其他卵巢癌细胞系中的表达，检测了4对亲本和化疗耐药细胞系：；HeyA8/HeyA8MDR（多药耐药）；A2780ip2/A2780cp20（顺铂耐药增加10倍）；和IGROV-AF1/IGROVcp20（顺铂耐药性增加5倍）。此外，还检测了来自正常卵巢表面上皮的永生化非转化细胞系HIO-180。我们发现，通过Western blot分析测得的ALDH1A1总表达量，在每种情况下，化疗耐药细胞系中都较高，HeyA8/HeyA8MDR除外，其中ALDH1A2在两种细胞系中均较低或缺失(图2B). 为了检测ALDH1A1是否不仅存在，而且具有活性，我们使用ALDEFLOUR分析对细胞进行流式细胞术分析。这种功能测定主要通过将化学物质转化为荧光染料来鉴定活性ALDH1A1。在SKOV3TRip2（占总人口的58%）和A2780cp20（2.2%）中很容易发现ALDH1A1活性细胞的亚群，但在其亲本细胞系中不存在(图2C). 此外，一些细胞中荧光信号的强烈变化表明，不仅所有细胞中的表达普遍增加，而且ALDH1A1阳性和阴性细胞的分离群体也增加了。免疫组织化学证实了这一点，在A2780cp20和SKOV3TRip2细胞中显示出明显的ALDH1A1阳性或阴性细胞群，但在培养的亲本A2780ip2和SKOV3ip1细胞中没有发现(图2D). 最后，我们观察到肿瘤中保持了这种异质性。将SKOV3TRip2细胞IP注射到裸鼠体内并收集原位肿瘤植入物后，ALDH1A1的免疫组织化学染色显示ALDH1A2亚群阳性和阴性(图2E). 为了检查这种表达的异质性是否是由于缺氧区域的差异表达所致，给荷瘤小鼠注射缺氧探针试剂，30分钟后处死。肿瘤用ALDH1A1和抗缺氧探针抗体联合染色。我们发现，ALDH1A1阳性细胞并不优先定位于肿瘤的缺氧区域，只有1.5%的ALDH1A1-阳性细胞同时对低氧探针阳性，只有3.3%的低氧原阳性细胞对ALDH1A2阳性（p<0.01，图2F).

人卵巢癌组织中ALDH1A1的表达

为了确定患者中ALDH1A1的表达模式及其与化疗耐药的可能相关性，我们接下来检测了65例未经治疗的高级别乳头状浆液性Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌患者标本（患者特征为表1). 我们发现了广泛的表达模式(图3A). 27.1%的样本中肿瘤细胞中没有ALDH1A1。在44%的肿瘤中，ALDH1A1在1–20%的细胞中表达，代表了最大的表达模式队列。与来自细胞系的异种移植一样，某些细胞的表达通常很强，而其他细胞的表达则为阴性，这表明肿瘤具有明显的异质性。阳性细胞的位置没有明显的组织学模式（例如血管周围或肿瘤前缘），但阳性细胞确实倾向于聚集在一起。其余的肿瘤（28.9%）都有21%到100%的染色，其中10%的患者在几乎100%的肿瘤细胞中有强烈的ALDH1A1表达。为了确认ALDH1A1在肿瘤浸润巨噬细胞中的表达没有被错误识别，对一些snap冷冻样品进行了ALDH1A2和CD68双重染色。虽然图像不如石蜡包埋样品的图像详细，但双重染色清楚地显示大多数巨噬细胞（蓝色）为ALDH1A1阴性，因此肿瘤中异质性ALDH1A2阳性并不仅仅是因为检测到巨噬细胞浸润(图3B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms241914f3.jpg
ALDH1A1在卵巢癌患者中的表达

IHC对65例高级别III–IV期乳头状浆液性卵巢癌患者进行了ALDH1A1评估。A） 观察到几种表达模式，包括缺失、斑点（例如“低ALDH”）和弥散（“高ALDH“）染色。与细胞系中的染色一致，观察到强阳性和阴性群体。B） 为了证实“斑点状”ALDH1A1模式不能识别浸润性巨噬细胞，在冰冻组织上对ALDH1A2（棕色）和CD68（泛巨噬细胞标志物，蓝色）进行了co-IHC。C） 将患者分为小于1%、1–20%和大于20%的ALDH1A1表达，采用Kaplan-Meier方法绘制无进展生存期和总生存期，并用对数秩检验检验其统计学意义。ALDH1A1表达增加的患者无进展生存期明显缩短。D） 已建立初级皮下异种移植物的小鼠用载体或顺铂治疗5周。E） 收集这些小鼠的肿瘤并进行ALDH1A1的IHC。顺铂治疗的肿瘤显示ALDH1A1阳性肿瘤细胞数量显著增加。显示了低功率和高功率下的放大倍数；比例尺表示50µm in（A，B），高功率（E），100µm for low power（E）。

表1

检测ALHD1A1表达的患者特征（n=65）

特性百分比或平均值（范围）
诊断时的年龄62.2 (34–89)
高加索人种71%
化疗前0%
阶段
  第三阶段74%
  第四阶段26%
钙1253,071 (161–9600)
腹水87%
最佳脱砖74%
乳头浆液组织学100%
铂/紫杉烷初级治疗96%
无进展生存14.2个月（1.7–108）
总体生存率2.5年（0.2–11.8）
ALDH1A1染色
  不存在27.1%
  1–20%的细胞44.0%
  21–100%的细胞28.9%

ALDH1A1表达与临床结果的相关性

为了确定ALDH1A1表达是否与临床结果相关，我们比较了上述患者样本（以及表1)在没有ALDH1A1表达的队列中，表达率为1–20%，且大于20%，因为该分组允许组间的数字相似，。ALDH1A1阳性细胞>20%的患者中位无进展生存期（6.1个月）短于ALDH1A1-1阳性细胞1-20%的患者（8.2个月）或无ALDH1B1阳性细胞的患者（13.8个月），这通过对数秩检验具有统计学意义（p=0.035，图3C). 总生存率反映了对复发环境中使用的多种化疗药物的耐药性，随着ALDH1A1表达的增加，总生存率呈现出较差的趋势（中位数OS 1.09 vs.1.84 vs.2.32年），但这一趋势在统计学上并不显著（p=0.33，补充图1).

顺铂治疗ALDH1A1阳性细胞的优先存活

为了确定ALDH1A1阳性细胞在铂治疗的肿瘤微环境中是否具有优先存活率，我们通过将新鲜收集的肿瘤标本皮下植入NOD-Scid小鼠，从主要患者样本建立了小鼠异种移植物。使用皮下模型而不是原位模型，以便可以准确地测量肿瘤生长和反应。一旦肿瘤形成并生长，大小约为1cm三，开始每周用7.5µg/kg顺铂IP进行治疗，而对照组仅给予载体(图3D). 当肿瘤长到2厘米时三在顺铂治疗保持稳定的对照组中，收集肿瘤并对切片进行ALDH1A1表达染色。ALDH1A1在移植瘤中的基线表达出现在大约1%的癌细胞中，在未经治疗的小鼠中生长的异种移植物中也发现了类似的表达水平(图3E). 然而，顺铂治疗的异种移植物中ALDH1A1阳性细胞的百分比显著增加至38%（p<0.001，图3E). 与此相一致的是，对分离肿瘤进行的ALDEFLOUR检测表明，未经治疗的肿瘤中0.6%的细胞呈ALDEFLUOR阳性，而顺铂治疗的肿瘤的细胞中17.6%呈ALDEHLUOR阳性。由于本例中处理过的异种移植物没有退化，而是在大小上保持稳定，顺铂暴露除了优先杀死ALDH1A1阴性细胞外，还可能诱导存活细胞中的ALDH1A2表达。

ALDH1A1阳性卵巢癌细胞的致瘤能力

在乳腺癌和其他癌症中，ALDH1A1活性癌细胞被证明代表肿瘤起始人群(10–19). 为了确定这种情况是否发生在卵巢癌中，我们使用ALDEFLOUR分析从A2780cp20细胞系中分类ALDH1A1阳性和阴性人群，并将细胞腹腔注射到NOD-Scid小鼠中，以限制稀释度，以确定肿瘤起始潜能。总结如下表2ALDEFLOUR阳性细胞表现出更强的致瘤潜能，注射100000、25000或5000个细胞后100%肿瘤发生，注射1000个细胞后1个肿瘤形成。ALDEFLOUR阴性细胞也能形成肿瘤，尽管速度较慢：5只小鼠中有2只在注射25000或100000个细胞后形成肿瘤，而注射5000或1000个细胞后没有形成肿瘤。注射后对小鼠进行1年的随访，并对其余小鼠进行彻底尸检，以确认肿瘤没有发展。在50%的动物中，允许肿瘤形成所需的TD50（细胞剂量）是ALDEFLOUR阳性细胞的50倍。也许更引人注目的是这些肿瘤的构成。肿瘤起始群体的一个要求是，它们有能力产生由干细胞和非干细胞群体组成的异质性肿瘤，因此具有多能分化潜力。在注射ALDEFLOUR阳性细胞后形成的肿瘤中发现了这一点。在所有16个肿瘤中，少数样本中发现ALDH1A1呈强阳性，平均占肿瘤的4.7%（范围2.4-6.1%，图4A). 然而，注射ALDH1A1阴性细胞后形成的肿瘤中未发现ALDEFLOUR阳性细胞(图4B). 这已与IHC确认(图4C、D). 这与以下观点相悖：肿瘤是由于ALDEFLOUR阳性细胞的污染而形成的，或者ALDH1A1的表达仅仅是由肿瘤微环境诱导的，而与细胞的容量无关。也注意到了产生ALDEFLOUR阳性细胞能力的差异在体外将SKOV3TRip2细胞分为ALDEFLOUR阳性和阴性细胞群，分别进行培养，并在24、48和72小时对不同细胞群进行ALDEFLUER分析(图4E、F). 在ALDEFLOOR阳性细胞中，每个时间点的ALDEFLOUR阳性细胞数分别逐渐恢复到75.3%、54.2%和51.4%。然而，ALDEFLOUR阴性细胞不能产生任何ALDEFLUOR阳性细胞。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms241914f4.jpg
A2780cp20异种移植物中的ALDH1A1群体

对注射ALDEFLUOR阳性或阴性A2780cp20细胞后发生的腹膜内肿瘤进行ALDH1A1成分评估。A） 注射纯ALDEFLOUR阳性细胞后形成的肿瘤显示了ALDEFLUOR阳性和阴性人群，并重述了TIC表型，即ALDEFLUR阳性细胞百分比很小（2.4-6.1%）。B） 有趣的是，注射纯ALDEFLOUR阴性细胞后形成的肿瘤仅含有ALDEFLUER阴性细胞，显示出缺乏分化能力，至少在ALDEFLUOR阳性方面。C–D）在这些样本的ALDH1A1的IHC上也发现了这种表达差异。比例尺代表100µm。E） 同样，在体外，SKOV3TRip2 ALDEFLOUOR阳性细胞产生ALDEFLUOR阳性和ALDEFLUEOR阴性细胞，在48小时时重新建立基线水平，而（F）ALDEFLOOR阴性细胞不能产生ALDEFLAOR阳性细胞。

为了证实来自肿瘤的ALDEFLUOR阳性细胞保持了致瘤性，对这些细胞群进行分类并再次腹腔注射到小鼠体内，并在注射25000个细胞后继续以100%的速度形成肿瘤。然而，来自注射ALDEFLUOR阴性细胞后形成的肿瘤的ALDEFLUOR阴性细胞没有形成肿瘤。综上所述，这些研究表明，ALDEFLOUR阳性细胞增加了致瘤性，但并非绝对致瘤性；但确实具有分化能力，并维持了ALDEFLUER阴性细胞中不存在的致瘤表型。

为了确定从卵巢癌患者中新收集的ALDEFLUOR阳性细胞是否具有相似的致瘤性，我们从五名不同的卵巢癌患者中分离出ALDEFLUOR阳性和阴性细胞，分离出在初次去瘤手术时转移到网膜的肿瘤。在这个队列中，1.5-17.8%的细胞呈ALDEFLOUR阳性。每组患者将25000个ALDEFLOUR阳性细胞、100000个ALDEHLOUR阴性细胞或100000个未分类细胞注射到5只小鼠体内。不幸的是，没有在任何小鼠中形成肿瘤，这突显了用单细胞悬浮液分离的原发性卵巢癌样本进行致瘤性研究的困难。

为了初步确定ALDEFLOUR阳性人群与卵巢癌中假定干细胞的其他标记物之间是否存在重叠，还对这五个样本进行了CD44、c-kit和CD133分析。我们无法从任何样本中确定令人信服的阳性c-kit人群。CD133阳性细胞平均占肿瘤细胞总数的3.1%（范围0.6–5.7%），所有五个样本中ALDEFLOUR阳性率均大于80%（平均86.7%，范围81.5–100%）。CD44更常见，平均占肿瘤的45.7%（但范围很广，为2.4-98.2%）。在CD44阳性细胞中，75.4%也呈ALDEFLOUR阳性（范围46.6–88.8%）。同样，SKOV3TRip2系有82%的CD44阳性细胞，其中74%为ALDEFLOUR阳性。尽管需要对大量样本进行检查，以全面描述多标记阳性细胞是否可以更准确地定义最纯的致瘤细胞，但标记表达肯定存在重叠。双阳性CD44/ALDEFLUOR和CD133/ALDEFLUOR阳性人群可能被证明更像CSC人群，正在进行的研究可以评估这种差异。有趣的是，A2780cp20细胞系CD44完全阴性，HeyA8细胞系ALDH1A1/ALDEFLUOR阴性，尽管两者都具有高度致瘤性。这突显了一个事实，即这些不能是小鼠致瘤性的唯一介质。

ALDH1A1下调使卵巢癌细胞对化疗敏感

鉴于ALDH1A1的表达与卵巢癌患者的化疗耐药细胞系和无进展生存率下降有关，我们询问ALDH1A1的下调是否会使耐药细胞对化疗敏感。两种不同的siRNA结构被鉴定为ALDH1A1表达降低80%以上(图5A). 确认ALDEFLOUR人群减少(图5B). 将SKOV3TRip2或A2780cp20细胞暴露于ALDH1A1靶向siRNA（ALDH1A1-siRNA）或对照siRNA 24小时，然后分别重新放置和添加浓度增加的多西他赛或顺铂。加入化疗后4天，用MTT法评估细胞存活率。在SKOV3TRip2细胞中，siRNA-ALDH1A1单独降低生存能力49%(图5C，p<0.001）。下调ALDH1A1也将多西紫杉醇IC50从178 nM降至82 nM。在A2780cp20中，仅ALDH1A1下调的影响是适度的(图5D，生存率降低了15.9%，p=0.040），但对顺铂的敏感性相当大，IC50从5.1µM降低到2.0µM。协同作用测试表明，每个细胞系都有适度的协同作用（SKOV3TRip2的CI=0.82，A2780cp20的CI=0.75）。ALDH1A1-siRNA单独作用的对比效果与这些细胞系中ALDH1A1活性细胞的数量一致，SKOV3TRip2细胞系具有50-60%的ALDEFLOUR阳性细胞，而A2780cp20只有2-3%。为了确定ALDH1A1下调如何单独影响细胞生长，在单独的实验中进行了细胞周期分析。我们发现，ALDH1A1下调诱导SKOV3TRip2细胞在S期和G2期积累（与对照siRNA相比p<0.001），但对A2780cp20细胞的细胞周期影响极小(图5E).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms241914f5.jpg
siRNA下调ALDH1A1的疗效在体外和体内

A） 通过Western blot和B）在SKOV3TRip2细胞系中使用ALDEFLOUR分析进行流式细胞术，确认降低ALDH1A1表达的siRNA结构。C） 在用增加剂量的多西紫杉醇治疗SKOV3TRip2细胞48小时前，用siRNA下调ALDH1A1显示出增敏作用，将IC50从178nM降低到82nM。siRNA单独使用也有效果，生存率降低了49%。D） 在A2780cp20细胞系中，仅下调ALDH1A1的作用最小，但使细胞对顺铂敏感，IC50从5.1µM降低到2.0µM。E） 细胞周期分析表明，ALDH1A1下调诱导SKOV3TRip2中S期和G2期细胞聚集，而对A2780cp20影响不大。F）体内，腹膜内注射SKOV3TRip2细胞的小鼠用掺入DOPC纳米颗粒中的ALDH1A1 siRNA、DOPC中的多西他赛/对照siRNA或其组合处理，并与用DOPC中的对照siRNA处理的小鼠进行比较。与对照siRNA治疗组（肿瘤生长减少94%，p<0.001）或单药治疗组（减少90-91%，p<0.05）相比，单药治疗的小鼠效果最小，但联合治疗组显示出显著降低。G） 类似地，注射A2780cp20细胞的小鼠在DOPC中用顺铂或ALDH1A1 siRNA显示出最小的非显著生长减少，但联合治疗在统计学上优于单一药物（减少65-73%，p<0.04）和对照siRNA（减少85%，p=0.048）。给出了平均肿瘤重量和单个肿瘤大小。

没有已知的ALDH1A1抑制剂体内研究。因此，我们使用了一种传递siRNA的方法体内使用DOPC纳米粒子。我们和其他人(28–32)此前已证明将纳入DOPC纳米脂质体的siRNA传递至肿瘤实质，随后靶向下调。在本研究中，裸鼠腹腔内注射SKOV3TRip2或A2780cp20细胞，并随机分为四个治疗组，在细胞注射后1周开始：1）DOPC中的对照siRNA，每周注射两次IP；2） 多西他赛35 mg，每周IP给药（对于SKOV3TRip2模型）或顺铂160µg，每周IP付药（对于A2780cp20模型）；3） DOPC中的ALDH1A1-siRNA，每周两次；或4）DOPC中的ALDH1A1-siRNA加多西他赛（用于SKOV3TRip2）或顺铂（用于A2780cp20）。治疗四周后，处死小鼠并记录肿瘤总重量。免疫组织化学分析证实，与对照组相比，ALDH1A1-siRNA/DOPC治疗组的ALDH1A1表达降低，但单用化疗组没有降低(补充图2; 可用的组织太少，无法用ALDEFLOUR分析进行检查）。在SKOV3TRip2异种移植物中(图5F)与对照DOPC相比，多西他赛治疗37.0%（p＝0.17）和ALDH1A1 siRNA治疗25.0%（p＝0.38）的肿瘤生长没有显著降低。观察到ALDH1A1单独下调显著降低SKOV3TRip2生长在体外但不太明显体内提示肿瘤微环境因子如支持性基质细胞可能能够保护细胞免受ALDH1A1缺失。然而，ALDH1A1 siRNA和多西紫杉醇的联合使用显著降低了生长，与对照siRNA相比降低了93.6%（p<0.001），与多西紫杉醇加对照siRNA相比较降低了89.8%（p=0.003），与ALDH1A2 siRNA相比减少了91.4%（p=0.002）。在A2780cp20中(图5G)，单用顺铂和ALDH1A1 siRNA治疗的肿瘤重量分别减少了43.9%（p=0.32）和57.0%（p=0.19），但无显著性差异。考虑到对照siRNA组中存在两个特别大的肿瘤，这些影响可能比平均肿瘤重量显示的更不显著。然而，联合治疗再次显示了ALDH1A1 siRNA对化疗的敏感性，与对照siRNA相比，联合治疗使生长减少了85.0%（p=0.048），与顺铂加对照siRNA（p=0.013）相比，生长减少了73.4%，与单独使用ALDH1A2 siRNA相比减少了65.3%（p=0.039）。考虑到单一药物的最小效果以及联合治疗显著改善的一致发现，这些数据表明ALDH1A1下调与紫杉烷和铂类化疗药物之间存在协同作用，尽管需要正式的剂量发现实验来明确证明协同作用。

讨论

我们发现ALDH1A1在卵巢癌耐药细胞系中的表达和活性增加就地顺铂治疗的原发性卵巢癌异种移植物。ALDH1A1在卵巢肿瘤中频繁表达，与ALDH1A1-阳性细胞较多的患者相比，ALDH1A2表达较低的患者预后更好。与ALDEFLOUR阴性细胞相比，ALDEFLUOR阳性细胞的致瘤性增加（但不是绝对的），并且具有在ALDEFLUER阴性人群中不存在的分化能力。最重要的是，ALDH1A1表达下调使正常化疗耐药肿瘤对多西他赛和顺铂均敏感在体外以及卵巢癌原位小鼠模型。

在卵巢癌中寻找肿瘤起始细胞的研究结果表明，CD44+/c-kit+人群的致瘤性增加了约5000倍，在注射来自原发肿瘤、异种移植或球形异质人群的多达100个细胞后，肿瘤形成(5)CD133+人群的致瘤性增加了约20倍，小鼠异种移植瘤形成的细胞数仅为100-500，CD133+细胞形成肿瘤的速度快4倍(7). 此外，CD133+细胞的致瘤性增加可以通过干扰CD44与其配体透明质酸之间的结合来抑制(6). 其他研究人员发现A2780细胞系中CD133+和CD133−细胞的肿瘤形成率相同，但CD133+细胞的生长速度更快(8). 来自MOVCAR细胞系的侧群（SP）细胞也更频繁地形成肿瘤，比来自非SP细胞的肿瘤出现早3-4周(9). 在所有这些研究中，与我们的研究一样，由假定的TIC群体产生的肿瘤同时包含TIC和非TIC群体，证明了多潜能。有趣的是，我们已经看到由ALDH1A1阴性细胞形成的肿瘤细胞缺乏生成ALDH1A1-阳性细胞的能力，并且不会在多代人中继续传播肿瘤，这表明它们的多潜能有限。在来自乳腺癌细胞系的ALDEFLUOR阴性细胞中也发现了这种分化能力的缺乏(33).

致瘤性实验中最合适的肿瘤细胞来源存在一些争议。虽然使用从原发性肿瘤中新采集的样本是可取的，但对这些样本进行分类并建立原发性异种移植物已被证明是有问题的。卵巢癌异种移植物和细胞系传统上很难从原始样本中建立。所有先前报道的卵巢肿瘤起始细胞的研究都使用了从不同世代的异种移植物或生长在分化抑制介质中的细胞（形成肿瘤球）中选择的某种类型的细胞，作为新采集标本和细胞系之间的折衷。然而，即使在第一代小鼠中形成肿瘤的细胞几乎可以肯定代表原始肿瘤的某些选定部分。这些异种移植物仍然只含有一小部分TIC，这说明了这种方法的适用性，也证明了肿瘤形成细胞是多潜能的，会产生TIC阴性的人群，并且仍然相对罕见。由于细胞系的同质性，通常不鼓励使用细胞系。但很明显，即使在细胞系内，ALDH1A1的表达也存在异质性，通过流式细胞术和免疫组织化学分析检测不同人群证明了这一点(图2). 在一些乳腺癌细胞系中也发现了不同的ALDEFLOUR阳性和阴性细胞群，其中ALDEFLUER阳性细胞具有更强的致瘤性和不同的分子特征(33). 因此，我们的发现是，细胞系中ALDEFLOUR阳性细胞群的致瘤性增加可能反映了ALDH1A1活性细胞更具侵袭性的表型，但并不能证明该群体对就地卵巢癌。有证据表明，ALDH1A1表达增加的患者预后较差，这表明了这种关联，但从新鲜收集的肿瘤中进行的额外致瘤性实验将更恰当地将ALDEFLOUR人群定义为具有临床意义的TIC。

致癌性在定义肿瘤干细胞方面的重要性也存在争议。而100–500个ALDEFLOUR阳性细胞形成肿瘤，注射105ALDEFLUOR阴性细胞肯定反映了一种侵袭性表型，异种移植物形成所需的生物学过程——在紧张的实验条件下存活、粘附、增殖时间和宿主免疫活性的变化——可能无法反映癌症干细胞研究试图确定的真实群体。我们的最终目标应该是确定在化疗后存活的母细胞肿瘤中的亚群，因此更有可能导致复发。化疗后存活的干细胞应表现出与临床相关的化疗耐药性。例如，在乳腺癌中，CD44+/CD24-人群具有高度致瘤性。然而，Tanei等人研究了新辅助化疗前后获得的组织，发现尽管治疗有阳性反应，但CD44+/CD24-阴性细胞的比例没有改变。然而，在这些样本中，ALDH1A1阳性人群显著增加(34).

ALDH1A1先前被提议在化疗耐药中发挥作用，已注意到其在IGROV铂耐药卵巢癌细胞的蛋白质组分析中更高(35)，在多药耐药胃癌的基因组分析中(36)以及抗环磷酰胺的细胞(37–38)，氮杂磷(39)现在是多西他赛和顺铂。ALDH1A1将许多细胞内醛类氧化成羧酸(40)，解毒化疗药物产生的许多自由基。干细胞群体理所当然地应该对多种化疗药物产生耐药性，而不是只对一类药物产生耐药性。这也符合临床，因为大多数卵巢癌患者对铂类药物产生耐药性，对多种药物产生耐药性(2). ALDH1A1已被证明与乳腺癌中的BRCA1相关，因为BRCA1的敲除增加了ALDEFLOUR人群，并且ALDEFLUOR阳性细胞优先包含BRCA1杂合性缺失(41). 这些发现对BRCA介导的卵巢癌也很重要。尽管有大量证据表明ALDH1A1的重要性，但还不完全清楚是否有任何额外的ALDH1亚型对干细胞生物学很重要。在我们的研究中，ALDH1A1可以用等型特异性抗体特异性鉴定（用于IHC和WB）。然而，对于干细胞群体来说，更为重要且持续使用的鉴定方法是ALDEFLOUR分析，该分析虽然主要依赖于ALDH1A1，但也可以鉴定ALDH1A2和ALDH1A3等型((42)以及干细胞技术公司未发布的数据）。作为一种治疗方法，我们已经看到了用siRNA靶向ALDH1A1的积极作用，但为了最大限度地提高治疗效果，这些额外同种型的贡献需要通过额外的研究来确定。

虽然我们发现ALDH1A1高表达患者预后较差，但与乳腺癌的类似研究结果一致(12–13)和卵巢癌(20)，一份有趣的报告发现，ALDH1A1的高表达实际上可以给卵巢癌带来积极的预后(43). 该队列还包括无染色、分散染色和弥散染色的患者。然而，该队列包括I期和II期疾病和低度恶性肿瘤的患者，这些患者中ALDH1A1的表达更高（证实了先前报告的结果(44)). 此外，通过多变量分析，仅与生存相关的阶段——ALDH1A1表达不再预测结果。卵巢癌在致癌和病理生物学方面有一个公认的二分法(45)因此，低度恶性肿瘤（通常在I期或II期诊断）具有更高的化疗耐药性，但由于生长缓慢，生存期延长。鉴于这些集体数据，以及ALDH1A1被证明有助于化疗耐药的几种机制，可能是ALDH1A2在低度恶性肿瘤中更频繁地表达，但同时参与了对高级和低度亚型的化疗耐药。

我们已经证明，ALDH1A1阳性人群具有肿瘤干细胞的特性，与紫杉烷和铂耐药相关，并且可以通过下调ALDH1A2对化疗再敏感在体外和体内因此，ALDH1A1不仅是攻击性人群的标志物，也是表型的介导者和可行的治疗靶点。随着开发出更好的模型来更纯粹地定义新发患者肿瘤中的真正耐药人群，ALDH1A1人群，无论是单独还是与其他耐药标记物和介质联合，可能代表一个必须针对的人群，以提高卵巢癌患者的反应率和生存率。

补充材料

1

单击此处查看。（23K，文档）

2

单击此处查看。（120万，jpg）

三

单击此处查看。（140万，jpg）

致谢

生殖科学家发展计划通过卵巢癌研究基金和美国国立卫生研究院（K12 HD00849）、国防部卵巢癌研究院、，获得UT MD Anderson癌症中心卵巢癌卓越研究专业计划（CA083639）和妇科癌症基金会颁发的职业发展奖；NIH（CA109298和CA110793，P50 CA083639；CA128797，RC2GM092599），卵巢癌研究基金会、马库斯基金会和贝蒂·安·阿什·默里杰出教授向AKS提供的项目开发拨款。

参考文献

1Jemal A、Siegel R、Ward E、Hao Y、Xu J、Thun MJ。2009年癌症统计。CA癌症临床杂志。2009;59:225–249.[公共医学][谷歌学者]
2Hoskins W、Perez C、Young R、Barakat R、Markman M、Randall M。妇科肿瘤学原理与实践。第四版，费城：Lippincott Williams&Wilkins；2005[谷歌学者]
三。Jordan CT的Rosen JM。癌症干细胞范式的日益复杂。科学。2009;324:1670–1673. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Dalerba P，Cho RW，Clarke MF。癌症干细胞：模型和概念。医疗年度收入。2007;58:267–284.[公共医学][谷歌学者]
5Zhang S，Balch C，Chan MW，等。人类原发性肿瘤卵巢癌诱导细胞的鉴定和特征。癌症研究。2008年；68:4311–4320. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Slomiany MG、Dai L、Tolliver LB、Grass GD、Zeng Y、Toole BP。小透明质酸寡糖抑制CD133阳性原代人卵巢癌细胞中功能性透明质酸-CD44相互作用。临床癌症研究。2009;15:7593–7601. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Curley MD、Therrien VA、Cummings CL等。CD133表达定义了原发性人类卵巢癌中的肿瘤起始细胞群。干细胞。2009[公共医学][谷歌学者]
8Baba T、Convery PA、Matsumura N等。CD133的表观遗传调控和CD133+卵巢癌细胞的致瘤性。致癌物。2008[公共医学][谷歌学者]
9Szotek PP、Pieretti-Vanmarcke R、Masiakos PT等。卵巢癌侧群定义了具有干细胞样特征和苗勒抑制物质反应性的细胞。美国国家科学院院刊。2006;103:11154–11159. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10更多JS。醛脱氢酶作为干细胞标记物。当前干细胞研究。2008年；三:237–246.[公共医学][谷歌学者]
11Balicki D.利用ALDH1推进人类乳腺干细胞生物学和乳腺癌预测。细胞干细胞。2007;1:485–487.[公共医学][谷歌学者]
12Ginestier C、Hur MH、Charafe-Jauffret E等。ALDH1是正常和恶性人类乳腺干细胞的标记物，也是不良临床结局的预测因子。细胞干细胞。2007;1:555–567. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Charafe-Jauffret E、Ginestier C、Iovino F等。醛脱氢酶1阳性癌干细胞介导炎症性乳腺癌的转移和不良临床结局。临床癌症研究。2010;16:45–55. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Croker AK、Goodale D、Chu J等。高醛脱氢酶和肿瘤干细胞标记物的表达可选择恶性和转移能力增强的乳腺癌细胞。细胞分子医学杂志。2008 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Huang EH，Hynes MJ，Zhang T，等。乙醛脱氢酶1是正常和恶性人类结肠干细胞（SC）的标记物，并在结肠肿瘤发生过程中跟踪SC过量。癌症研究。2009;69:3382–3389. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Carpentio JE、Hynes MJ、Appelman HD等。乙醛脱氢酶表达的结肠干细胞在结肠炎向癌症转化过程中对肿瘤发生的作用。癌症研究。2009;69:8208–8215. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Dembinski JL，Krauss S.胰腺癌中慢循环干细胞样亚群的特征和功能分析。临床实验转移。2009;26:611–623. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Ucar D，Cogle CR，Zucali JR等。乙醛脱氢酶活性作为肺癌的功能标志物。化学-生物相互作用。2009;178:48–55. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Ma S，Chan KW，Hu L，等。致瘤性肝癌干/祖细胞的鉴定和表征。胃肠病学。2007;132:2542–2556.[公共医学][谷歌学者]
20Deng S，Yang X，Lassus H，等。人类上皮癌中干细胞标记物醛脱氢酶亚型1（ALDH1）的不同表达水平和模式。公共科学图书馆一号。2010;5：e10277。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21别克RN，普拉诺R，特伦特JM。五种人类卵巢腺癌细胞系的比较特性。癌症研究。1985;45:3668–3676.[公共医学][谷歌学者]
22Yoneda J、Kuniyasu H、Crispens MA、Price JE、Bucana CD、Fidler IJ。血管生成相关基因的表达与裸鼠卵巢癌的进展。美国国家癌症研究所杂志。1998年；90:447–454.[公共医学][谷歌学者]
23Duan Z，Feller AJ，Toh HC，Makastrissis T，Seiden MV.TRAG-3，一个从抗紫杉醇卵巢癌细胞系分离的新基因。基因。1999;229:75–81.[公共医学][谷歌学者]
24Illumina I.BeadStudio基因表达数据规范化算法。技术说明：ILLUMINA®RNA分析。2007年被引用；可从以下位置获得：http://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_beadstudio_normalization.pdf.
25Benjamini Y、Drai D、Elmer G、Kafkafi N、Golani I。控制行为遗传学研究中的错误发现率。行为大脑研究。2001;125:279–284.[公共医学][谷歌学者]
26Landen CN，Jr，Lu C，Han LY等。用激动性抗体减少EphA2在卵巢癌中的疗效和抗血管作用。美国国家癌症研究所杂志。2006;98:1558–1570.[公共医学][谷歌学者]
27Straetemans R，O'Brien T，Wouters L，等。药物组合实验的设计与分析。生物J。2005;47:299–308.[公共医学][谷歌学者]
28Landen CN，Jr、Chavez-Reyes A、Bucana C等，《利用中性脂质体小干扰RNA传递靶向体内治疗性EphA2基因》。癌症研究。2005;65:6910–6918.[公共医学][谷歌学者]
29Gray MJ、Dallas NA、Van Buren G等。Id2治疗靶向性降低小鼠肝脏中人类结直肠癌的生长。致癌物。2008年；27:7192–7200. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Halder J，Kamat AA，Landen CN，Jr，等。利用体内短干扰RNA在中性脂质体中传递靶向性粘附激酶治疗卵巢癌。临床癌症研究。2006;12:4916–4924. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Kamat AA、Feng S、Agoulnik IU等。松弛素在子宫内膜癌中的作用。癌症生物治疗。2006;5:71–77.[公共医学][谷歌学者]
32Villares GJ，Zigler M，Wang H，等。脂质体结合蛋白酶活化受体-1小干扰RNA的全身给药靶向黑色素瘤生长和转移。癌症研究。2008年；68:9078–9086. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Charafe-Jauffret E、Ginestier C、Iovino F等。乳腺癌细胞系包含具有转移能力和独特分子特征的功能性肿瘤干细胞。癌症研究。2009;69:1302–1313. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Tanei T、Morimoto K、Shimazu K等。通过乙醛脱氢酶1表达鉴定的乳腺癌干细胞与乳腺癌紫杉醇和表阿霉素序贯化疗耐药性的相关性。临床癌症研究。2009;15:4234–4241.[公共医学][谷歌学者]
35Le Moguen K、Lincet H、Marcelo P等。IGROV1卵巢癌细胞系对顺铂治疗反应的蛋白质组动力学分析。蛋白质组学。2007;7:4090–4101.[公共医学][谷歌学者]
36Ludwig A，Dietel M，Lage H。经典和非典型多药耐药胃癌细胞差异表达基因的鉴定。抗癌研究。2002;22:3213–3221.[公共医学][谷歌学者]
37Russo JE，Hilton J.抗环磷酰胺L1210细胞胞浆醛脱氢酶的表征。癌症研究。1988;48:2963–2968.[公共医学][谷歌学者]
38吉田A、戴夫V、韩H、Scanlon KJ。细胞溶质ALDH基因在环磷酰胺耐药的人癌细胞中的转录增强。高级实验医学生物。1993;328:63–72.[公共医学][谷歌学者]
39Kohn FR、Landkamer GJ、Manhe CL、Ramsay NK、Sladek NE。醛脱氢酶抑制剂对人类多能干细胞和定向造血祖细胞及恶性血细胞对恶唑磷的体外敏感性的影响。癌症研究。1987;47:3180–3185.[公共医学][谷歌学者]
40Riveros-Rosas H，Julian-Sanchez A，Pina E.哺乳动物乙醇和乙醛代谢的酶学。医学研究档案。1997;28:453–471.[公共医学][谷歌学者]
41Liu S、Ginestier C、Charafe-Jauffret E等。BRCA1调节人类乳腺干/祖细胞命运。美国国家科学院院刊。2008年；105:1680–1685. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Yokota A、Takeuchi H、Maeda N等。GM-CSF和IL-4协同触发树突状细胞获得维甲酸生成能力。国际免疫学。2009;21：361–377。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Chang B，Liu G，Xue F，等。ALDH1表达与卵巢癌的良好预后相关。Mod病理学。2009;22:817–823. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Tanner B、Hengstler JG、Dietrich B等。谷胱甘肽、谷胱甘苷S-转移酶α和π以及醛脱氢酶含量与卵巢癌耐药性的关系。妇科肿瘤。1997;65:54–62.[公共医学][谷歌学者]
45Landen CN，Jr、Birrer MJ、Sood AK。上皮性卵巢癌发病机制中的早期事件。临床肿瘤学杂志。2008年；26:995–1005.[公共医学][谷歌学者]