TDP-43过度表达对神经系统的毒性作用秀丽线虫

摘要

简介

TAR DNA结合蛋白（TDP-43）是一种普遍表达的保守RNA和DNA结合蛋白，与抑制基因转录有关(1)，选择性外显子剪接(2)和mRNA稳定性(三). 在额颞叶变性（FTLD-U）和肌萎缩侧索硬化（ALS）患者受影响神经元中发现的泛素化内含物中也发现了TDP-43蛋白(4,5). TDP-43在这些疾病中的持续沉积，以及在家族性和散发性ALS中TDP-43突变的鉴定，有力地证明了TDP-43对这些神经退行性疾病的因果作用（参见6). 含有TDP-43的内含物也被报道存在于其他神经退行性疾病中，包括阿尔茨海默病(7)和帕金森氏病(8). 考虑到TDP-43在神经退行性疾病中的分布以及其他疾病相关蛋白的作用，有人提出TDP-43病理学可能是FTLD/ALS疾病谱中的主要病理学，但在其他神经退行疾病中是次要病理学(9).

TDP-43是一个进化上保守的基因，在果蝇属和秀丽隐杆线虫(10). 这个秀丽线虫同源物，命名为TDP-1，包含两个RNA识别基序（RRM），与TDP-43中的等效结构域具有显著的序列相似性。尽管TDP-43缺乏富含甘氨酸的C末端结构域（图1). 我们在当前的研究中表明，在基于细胞的CFTR选择性外显子剪接分析中，TDP-1可以替代TDP-43，支持这些蛋白质的功能形态。

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图1。

hTDP-43和TDP-1结构域的比较。人类TDP-43和秀丽线虫TDP-1具有类似的核定位信号、RRM和候选caspase-leavage位点的排列（箭头所示）。然而，TDP-1缺乏明显的富含甘氨酸的结构域，并且具有扩展的N末端。

与TDP-43沉积相关的病理机制目前尚不清楚。TDP-43是一种主要的核蛋白，但在受影响的ALS运动神经元中，它是细胞质沉积的，同时核定位减少(5). 在FTLD-U中也观察到TDP-43的神经核内含物(11). 病理组织的免疫印迹研究也表明，TDP-43的细胞质沉积与C末端片段的积累有关，最显著的是一个～25kDa物种。TDP-43中存在假定的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶切位点，这表明TDP-43的半胱天冬酶切可能导致聚集的C末端片段的形成。事实上，TDP-43的工程化C末端半胱天冬酶切片段在细胞培养中表达时会形成细胞质聚集体(12). 我们(13)和其他(14)已经表明，TDP-43的C末端片段的异位表达导致毒性、不溶性、泛素和磷酸阳性细胞质内含物的形成。然而，使用针对N端和C端TDP-43表位的抗体对病理组织进行免疫细胞化学分析表明，TDP-43内含物也可以包含该蛋白的N端部分，特别是在ALS脊髓中(15).

目前尚不清楚TDP-43相关病理学是否是TDP-43功能增加、减少或改变的结果。ALS-连锁TDP-43突变似乎起主导作用，与突变蛋白的超形态或新形态活性一致。然而，突变型TDP-43也可能以显性负向作用。细胞培养和斑马鱼的研究表明，TDP-43功能的过度表达和丧失都可能导致神经元病理学(16). 为了在遗传易驯化模型中广泛研究TDP-43的神经毒性机制，我们在秀丽线虫这是一个模型系统，以前曾用于研究许多人类神经退行性疾病(17–19). 我们观察到与全长、核酸定位的TDP-43的表达相关的毒性，这两种毒性都在秀丽线虫以及在细胞培养模型中。相反，删除tdp-1该基因不会引起明显的神经元功能障碍，而TDP-1的转基因过表达会引起，这支持了野生型TDP-43功能水平过高足以诱导神经病理学的假设。

结果

设计人TDP-43（hTDP-43）的泛神经表达秀丽线虫，构建了嵌合转基因，其中秀丽线虫突触蛋白基因(snb-1型)驱动全长hTDP-43 cDNA的表达。通过微量注射产生含有转基因染色体外拷贝的遗传转基因菌株。对于这些菌株的一个子集，如前所述，通过γ射线照射获得了含有转基因染色体整合拷贝的完全稳定的转基因菌株(17). 所有含有snb-1型/hTDP-43转基因表现出一种独特的“不协调”（Unc）表型，通常与导致神经元功能障碍的突变相关。这种不协调表型的特征是非正弦运动、缓慢运动和对刺激的不适当反应（图2A和B），以及盘绕身体姿势，蠕虫的背侧位于线圈内部（即“背卷”表型）。转基因蠕虫作为幼虫动物首次表现出这种表型，并且在整个成年期表型保持不变。使用抗hTDP-43抗体的免疫印迹分析显示hTDP-53在转基因蠕虫中表达（图2D） 免疫组化染色显示hTDP-43在神经元细胞核中特异性积聚（图2C） ●●●●。我们没有在这些转基因蠕虫中观察到任何与TDP-43免疫反应相关的抗泛素染色或可检测到的泛素阳性内含物（参见补充材料，图S4).

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图2。

人TDP-43在秀丽线虫. (A类)野生型和野生型平板表型的比较snb-1型/hTDP-43转基因蠕虫。注意不规则的运动轨迹和非正弦的身体姿势snb-1型/hTDP-43蠕虫，其从未在野生型动物中观察到。(B类)成人运动缺陷的量化snb-1型/hTDP-43蠕虫（菌株CL2609），通过测量40秒间隔内单个蠕虫的总行进距离进行分析。(C)固定和渗透的前部snb-1型/用抗hTDP-43抗体（ProteinTech抗TARDBP多克隆抗体）探测hTDP-33蠕虫。注意TDP-43在神经环神经元细胞核中的特异性定位。红色，抗hTDP-43；细胞核的DAPI染色；绿色、肠道GFP来自转化标记质粒。(D类)野生型和snb-1型/用抗TDP-43单克隆抗体M01探测hTDP-43转基因蠕虫（菌株CL1682）。注意单个抗TDP-43反应带snb-1型/hTDP-43蠕虫。

观察到的不协调表型snb-1型/hTDP-43转基因蠕虫特别具有秀丽线虫运动神经元功能障碍突变体。为了分析与转基因表达相关的可能的运动神经元异常snb-1型/hTDP-43转基因被导入含有6月1日报告转基因(20)表达突触素：：GFP融合蛋白unc-25号机组发起人。这名GFP报告人定位于GABA能神经运动神经元突触，并经常用于可视化活蠕虫中的这些突触(21–23). 表达snb-1型/hTDP-43转基因对GFP融合报告蛋白标记的突触的数量和分布有显著改变（图三A和C）。的表达式snb-1型/hTDP-43转基因也与偶尔的轴突脱唾液有关（在4/30中观察到snb-1型/hTDP-43蠕虫，0/30对照），通过共表达rgef-1型/DsRed报告器（图三B） ●●●●。（与突触缺陷相比，观察到的轴突缺陷不足以解释明显的“不协调”表型。）

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图3。

神经病理学snb-1型/hTDP-43转基因蠕虫。(A类)活体控制背索（CL1685）中GABA能运动神经元突触的可视化snb-1型/hTDP-43（CL1681）蠕虫使用unc-25号机组/SNB-1:：GFP报告基因转基因(七月一日). 突触被视为报告者沿着轴突的集中（“头在绳子上”）；注意到可检测的突触显著减少snb-1型/hTDP-43蠕虫（箭头）。(B类)野生型和snb-1型/hTDP-43蠕虫，通过与rgef-1型/DsRed2，一个在所有轴突过程中积累的记者(40). 注意中的脱泡snb-1型/hTDP-43轴突束（箭头）。(C)对照转基因（CL1685）和snb-1型/hTDP-43（CL1681）蠕虫，每个菌株有30只动物得分。CL1685，15.7±0.7 putta/100µm；CL1681，6.5±0.7 putta/100µm，学生t吨-测试对< 0.0001. (D类)对照组背部GABA能突触的定量(6月1日)和tdp-1(ok781号机组);6月1日蠕虫，每种菌株有30只动物得分。七月一日，18.4±0.4 putta/100µm；tdp-1(ok781号机组);6月1日，18.7±0.4 putta/100µm，学生t吨-测试对> 0.5. 误差线=SEM。

确定是否snb-1型/hTDP-43毒性也与运动神经元的丢失有关，另一位报告者转基因(hdIs22型)用于用DsRed2特异性标记26个GABA能神经元，包括19个GABA能运动神经元。在第四幼虫期未观察到GABA能运动神经元丢失snb-1型/hTDP-43蠕虫在16°C下饲养（图4A和B）。为了更广泛地询问凋亡细胞死亡是否与hTDP-43表达导致的不协调表型有关塞得-4(编号1162)突变被引入snb-1型/hTDP-43转基因株。这种突变塞得-4基因（与哺乳动物Apaf1同源）阻断所有凋亡细胞死亡秀丽线虫(24). 介绍塞得-4(编号1162)对四龄幼虫的不协调表型没有影响snb-1型/HTDP-43转基因蠕虫在16°C下饲养，可以在琼脂平板上观察到，也可以通过在液体培养基中计算身体颠簸来量化（图4C） ●●●●。

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图4。

诱导的不协调表型snb-1型/hTDP-43与神经元丢失无关。(A类)GABA能运动神经元的可视化unc-47号机组/DsRed2报告基因转基因(hdIs22型). (B类)对照组和对照组GABA能运动神经元的定量snb-1型/hTDP-43蠕虫，每种菌株有30只动物得分。hdIs22型对照组，每条蠕虫17.6±0.2个GABA能运动神经元；hdIs22型;snb-1型/hTDP-43，每条蠕虫17.7±0.2 GABA能运动神经元，学生t吨-测试对> 0.5. (C)的影响第4级(编号1162)和tdp-1(ok781号机组)关于液体中的运动snb-1型/hTDP-43蠕虫。塞得-4(编号1162)不影响非转基因[野生型，47.8±0.6次/30s；塞得-4(编号1162)，48.7±1.8次打击/30秒，学生t吨-测试对>0.5]或转基因[snb-1型/hTDP-43，9.4±0.8跳动/30秒；塞得-4(编号1162);snb-1型/hTDP-43，7.9±1.1次打击/30秒，学生t吨-测试对>0.2]蠕虫。同样，引入tdp-1(ok781型)删除到snb-1型/hTDP-43背景不会改变这种转基因引起的运动减少[snb-1型/hTDP-43，9.4±0.8跳动/30秒；tdp-1(ok781号机组);snb-1型/hTDP-43，8.3±0.5次拍打/30秒，学生t吨-测试对> 0.1]. 误差线=SEM。

不协调的表型snb-1型/hTDP-43蠕虫可能是人类TDP-43蛋白干扰tdp-1，内源性秀丽线虫TDP-43的正交曲线。然而，我们观察到含有tdp-1删除[(ok781号机组)或(ok803型)]有明显的野性运动。直接寻找的角色tdp-1在突触形成中，我们引入了6月1日记者进入tdp-1(ok781号机组)背景和评分GABA能突触如上所述（图三D） ●●●●。未观察到突触异常tdp-1删除背景，表示snb-1型/hTDP-43转基因不太可能是由于hTDP-43和TDP-1之间的直接显性负相互作用。介绍tdp-1(ok781号机组)转化为转基因snb-1型/hTDP-43后台未修改snb-1型/hTDP-43不协调表型（图4C） ，表明hTDP-43的毒性也不取决于与内源性TDP-1的相互作用。

如果人类TDP-43是TDP-1的功能同源物，并且TDP-1活性的过度表达足以导致神经元功能障碍，则上述观察结果可以解释。但是，初始报告使用在体外分析表明，在CFTR转录物的选择性剪接中，TDP-1不能替代TDP-43(10)，提出了关于这些蛋白质的功能同源性的问题。因此，我们重新检查了TDP-1在细胞系统中支持CFTR可变剪接的能力。利用HeLa细胞，我们表达了一个带有C155T外显子9突变的CFTR报告子微基因构建（图5A） 之前已经证明，在内源性HeLa TDP-43的控制下，外显子9包含受到抑制（37）。在这些条件下，TDP-43的敲除排除了内源性蛋白的任何潜在相互作用，并允许直接评估重新引入的siRNA-resistant结构的功能能力，以抑制CFTR转录物外显子9的包含。如图所示5，TDP-1可以在此系统中支持CFTR拼接，增强了TDP-43和TDP-1之间的功能相似性。

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图5。

在基于细胞的分析中，TDP-1可以促进CFTR选择性剪接。(A类)添加备份分析中转染的CFTR C155T小基因示意图（虚线表示可能的剪接结果）。(B类)内源性TDP-43基因敲除后添加回抗siRNA野生型人类TDP-43和TDP-1对CFTR外显子9剪接的影响。显示了三个独立转染实验中获得的标准偏差。下框中显示了针对内源性TDP-43和微管蛋白的蛋白质印迹，以显示沉默效率和相等负载。转染的siRNA-resistant TDP-43的弱免疫印迹信号可能是由于该质粒构建物的转染效率相对较低(37).

为了研究TDP-1的过度表达是否真的会导致神经元功能障碍，我们产生了平行的转基因菌株，其中snb-1型启动子驱动TDP-1 cDNA的表达（在内源性tdp-1表达式）。这些转基因菌株也在贴片-1允许转基因表达水平受生长温度调节的基因(25). 在较高温度下（较高的转基因表达，参见补充材料，图S1),snb-1型/eGFP:：TDP-1转基因蠕虫在抽打试验中表现出不协调的表型和减少的运动（见图6B） ●●●●。因此，我们假设人类TDP-43的神经毒性秀丽线虫可能是因为TDP-43功能过多（野生型）。

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图6。

表达于秀丽线虫. (A类)TDP-43变体的示意图秀丽线虫. (B类)野生型或变异型TDP-43表达引起的运动缺陷的量化。表达野生型TDP-43（菌株CL1682）、eGFP:：TDP-43(对<0.001，学生t吨-测试）。相反，表达eGFP:：TDP-43并缺失RRM1（菌株CL1702）、RRM2（菌株CL1705）或C末端（菌株CL1710）的转基因蠕虫的体抽打率并不降低(t吨-测试对> 0.2). eGFP:：TDP-43构造（菌株CL1687）中的核定位信号突变同样可以将身体运动恢复到控制水平。除LEN144外，所有菌株均在16°C下进行测定，LEN144在25°C下进行测定以最大限度地提高转基因表达。误差线=SEM。

接下来，我们试图确定hTDP-43的哪些结构域是诱导神经毒性所必需的秀丽线虫TDP-43蛋白包含两个RRM（RRM1和RRM2）、核定位和输出信号以及一个C末端富含甘氨酸的结构域。RRM1对核苷酸结合既必要又充分(2)据报道，富含甘氨酸的结构域负责TDP-43与异质核核糖核蛋白（hnRNP）的相互作用，特别是hnRNP A2/B1和hnRNP A1(26). 在这一系列实验中，hTDP-43的野生型和缺失变异体包括N末端GFP融合，以便快速确认转基因表达并确定表达的融合蛋白在活蠕虫中的亚细胞定位。这些结构的示意图如图所示6A.通过免疫组织化学和免疫印迹法确认适当融合结构的表达（参见补充材料，图S2)用打浆法检测转基因表达对运动能力的影响。GFP:：hTDP-43（全长）融合蛋白的神经表达导致转基因产物的不协调表型和核积累，与在表达未标记hTDP-33的蠕虫中观察到的结果没有区别。相反，包含第一个RRM（RRM1，残基106-175）或第二个RRM的缺失（RRM2，残基193-257）的融合表达并没有导致运动不协调。同样，含有hTDP-43 C末端区域（残基257–414）缺失的GFP融合蛋白的表达未能诱导不协调表型。TDP-43缺失变体中运动表型的量化如图所示6B。

尽管所有这些缺失变体都保留了它们的核定位，但变体的亚核分布似乎与全长融合蛋白的分布不同（图7A） ●●●●。RRM1和RRM2缺失蛋白具有更颗粒状的外观，C末端缺失蛋白定位于单个核体或包涵体（图7B–D）。这些TDP-43变异体的细胞分布与融合到C末端TDP-43片段（eGFP:：TDP-25）的GFP的细胞分布明显不同，正如之前在细胞培养中观察到的那样(12)只产生大的细胞质聚集体（图7一） ●●●●。有趣的是，TDP-1 C末端结构域（残基347–411）与TDP43 N末端结构域的融合（残基1–269）恢复了删除TDP-43 C末端时丢失的正常核分布（对比图7G和D插图）。

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图7。

的本地化snb-1型-驱动的全长和变体hTDP-43构建体，在秀丽线虫. (A类–F）表达eGFP:：TDP-43融合的活转基因蠕虫的GFP/DIC融合图像（主面板），与来自同一转基因菌株的固定蠕虫的神经环区域的互补插入物用抗TDP-43抗体（红色）探测，并用DAPI（蓝色）反染以突出细胞核。（A） eGFP:：hTDP-43转基因蠕虫（CL1626）的神经环区。GFP荧光和抗TDP-43染色定位于细胞核，主要扩散于细胞核。（B） eGFP:：hTDP-43 RRM1缺失转基因蠕虫（CL1702）的神经环面积。GFP荧光和抗TDP-43染色为核染色，但比全长eGFP:：hTDP-43观察到的斑点更多。（C） eGFP:：hTDP-43 RRM2缺失转基因蠕虫（CL1705）的神经环区。GFP荧光和抗TDP-43染色为核染色，但也比全长eGFP:：hTDP-43观察到的斑点更多。（D） eGFP:：hTDP-43 C末端缺失的神经环区域（即hTDP-43 1–257，菌株CL1710）。GFP荧光和抗TDP-43染色定位于大多数神经元的单个核体/包涵体。（E） eGFP:：hTDP-43无caspase-cleavage（D89E，D219E）突变转基因蠕虫（CL1690）的神经环区。如eGFP:：hTDP-43（野生型）融合（A）所观察到的，GFP荧光和抗TDP-43染色局限于细胞核，主要在细胞核内扩散。（F） eGFP:：hTDP-43 NLS1突变转基因蠕虫（菌株CL1687）的神经环区域。GFP荧光和抗TDP-43染色在核周细胞质内含物和细胞质中均可见。(G公司)用抗hTDP-43单克隆抗体（红色）和DAPI（蓝色）探测表达hTDP-43:：TDP-1融合构建物（CL1714）的固定蠕虫的神经环区域。添加C末端TDP-1序列恢复了hTDP-43变体的弥散核分布，当删除hTDP-43C末端序列时，该变体通常会丢失（与D插图相比）。(H（H）)固定eGFP:：hTDP-43转基因蠕虫（CL1626）的腹索区（绿色GFP，DAPI染色，假红色）。通过比较GFP+DAPI（左）和仅DAPI（右）图像（箭头），融合蛋白显示出严格的核定位。(我)固定eGFP:：hTDP-25 F1转基因蠕虫的腹索区（GFP为绿色，DAPI染色为假，红色）。融合蛋白形成具有严格细胞质定位的大包涵体，如GFP+DAPI（左）和仅DAPI（右）图像的比较所示（箭头）。尺寸条=10µ米在所有图像中。

TDP-1 C末端序列恢复C末端缺失的TDP-43正常核定位的能力提出了一个问题，即添加C末端TDP-1序列是否可以类似地恢复TDP-43的功能。因此，我们研究了TDP-13 C末端序列被删除时，TDP-1 C末端序列挽救CFTR选择性剪接丢失的能力(2). 如图所示8A–C，我们发现，虽然TDP-43 N端序列不能支持CFTR的选择性剪接，但TDP-43（N端）：：TDP-1（C端）在这个基于细胞的分析中构建了强有力的外显子排除支持。此外，将TDP-1 C末端序列添加到N末端TDP-43后，恢复了正常的核定位(补充材料，图S3)，正如在秀丽线虫模型。正如预测的那样，TDP-43：：TDP-1融合构建物在秀丽线虫（图8D） ●●●●。

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图8。

TDP-43缺失和融合蛋白的活性。(A类)用共转染细胞制备的cDNA作为PCR模板，确定CFTR外显子9在（TG）中的相对排除₁₃（T）₅迷你基因。(B类)使用（兔子）抗GFP（Invitrogen）的免疫印迹探针检测标记的构建物表达。使用（鼠标）抗GAPDH（BioDesign）控制加载。(C)使用来自CFTR小基因PCR（A）的密度读数来确定每个样品的CFTR小基因中外显子9的包含百分比。[与图中使用的pTB CFTR C155T小基因相比5A、 （TG）₁₃（T）₅用于评估TDP-43aa1–270:：TDP-1aa347–411融合结构的功能的CFTR结构缺乏C155T CFTR突变。在内源性TDP-43的控制下，（TG）₁₃（T）₅小基因对第9外显子包含的抑制更具抵抗力，需要TDP-43的过度表达才能诱导第9外显子跳跃(13)，对TDP-43：：TDP-1融合促进外显子跳跃的能力进行了严格测试。](D类)TDP-43:：TDP-1融合蛋白对小鼠运动障碍的影响秀丽线虫将TDP-1 C末端序列添加到TDP-43 N末端的转基因蠕虫的身体运动显著减少(对<0.01，学生的t吨-测试）。

在所有检测的转基因菌株中，全长hTDP-43只能通过GFP标记或免疫组织化学在细胞核中检测到。然而，这些实验并不排除观察到的神经毒性可能是由于产生低水平的不可检测（但高度有毒）的细胞质C末端片段，可能是通过内源性的裂解秀丽线虫半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。因此，我们在细胞培养实验中表达了全长TDP-43，该全长含有取代基（D89E，D219E），可阻断半胱氨酸蛋白酶的裂解并阻止C末端TDP-43片段的形成(12). caspase-leavage不敏感的hTDP-43的表达仍然导致不协调的转基因蠕虫，这表明hTDP-33的毒性不需要caspase裂解（图6B） ●●●●。该结果与塞得-4(编号1162)突变，阻断半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活秀丽线虫，以逆转hTDP-43毒性。为了严格证明核而非细胞质全长hTDP-43是有毒的，我们表达了含有取代基（K82S、R83S、K84S）的hTDP-33，这些取代基使二分NLS的NLS1失活。这种hTDP变体严格来说是细胞质的，TDP-43广泛分布在小包裹体中（图7F） ●●●●。尽管TDP-43的表达水平与野生型hTDP-43菌株相当，但表达NLS突变hTDP-44的转基因动物并不不协调(补充材料，图S2)这显示出明显的神经毒性。这些结果支持这样一种观点，即核的全长TDP-43在这种情况下是一种有毒物种秀丽线虫模型。

为了确定全长TDP-43的这种毒性是否也可以在哺乳动物细胞中观察到，我们将TDP-43（未标记或含有myc、FLAG或GFP标记）转染到分化的M17细胞中。所有可检测到的转染hTDP-43均呈细胞核（图9A） ●●●●。转染细胞所含的TDP-43比对照载体转染细胞中测得的内源性TDP-43多约2–3倍（图9B和C）。尽管TDP-43的过度表达相对温和，并且免疫印迹检测不到TDP-43 C末端片段，但TDP-43转染细胞的存活率却显著下降，这是通过增加LDH释放量来测量的（图9D） ●●●●。这些观察结果表明，野生型全长TDP-43的过度表达可能对哺乳动物细胞培养模型产生毒性作用。

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图9。

哺乳动物细胞培养中全长hTDP-43的毒性。用1微克表达野生型或标记全长hTDP-43的构建物转染分化的M17细胞72小时。(A类)转染蛋白质的细胞分布可视化。左上面板，GFP荧光；右上角面板，抗TDP-43（ProteinTech多克隆抗体）免疫荧光；左下面板，抗myc免疫荧光；右下面板，抗FLAG免疫荧光。所有检测到的转染蛋白表达均为细胞核。尺寸条=10µm。(B类)通过免疫印迹（多克隆抗TDP-43抗体，ProteinTech）测量转染细胞的TDP-43表达水平。(C)免疫印迹的密度分析如（B）所示。注意转染细胞表达的TDP-43比对照转染细胞多2-3倍。(D类)通过LDH释放测定TDP-43过度表达的细胞毒性。与对照载体转染细胞相比，转染TDP-43结构体的细胞中LDH释放量显著升高。三个独立实验的数据通过单向方差分析和Tukey的方差分析进行分析事后（post-hoc）分析。(***对< 0.001).

讨论

我们已经证明，野生型人类TDP-43在异源表达时可能有毒秀丽线虫系统或在细胞培养模型中过度表达。hTDP-43的神经毒性秀丽线虫取决于全长蛋白质的核积累。hTDP-43的神经毒性不太可能是由于异源蛋白表达的非特异性效应，因为我们使用了相同的表达系统来表达GFP(27)和β淀粉样肽(28)没有观察到hTDP-43转基因蠕虫中出现的显著不协调表型。hTDP-43毒性需要两个RNA识别域的观察进一步证明了hTDP-33毒性的特异性，并与这种毒性需要与DNA或RNA相互作用的假设相一致。

我们发现hTDP-43转基因蠕虫的不协调表型与运动神经元突触异常有关。虽然我们还没有检测其他神经元缺陷，秀丽线虫我们研究中检测到的导致GABA能神经元功能障碍的突变足以诱导不协调表型(29). 有趣的是，我们没有在hTDP-43转基因蠕虫中检测到GABA能运动神经元的丢失（尽管我们没有对老年转基因蠕虫或在应激条件下转基因蠕虫的这些神经元进行评分）。在ALS患者的脊髓中观察到运动神经元细胞丢失，尽管尚不清楚这是由于细胞死亡途径的直接激活还是继发于突触和轴突丢失。在表达G93A突变SOD1的小鼠ALS模型中，引入bax（巴克斯）缺失可能使运动神经元死亡与运动神经元功能障碍分离，这表明该模型中的临床症状是由远端运动神经元轴突损伤引起的，而不是细胞死亡途径的直接激活(30). 虽然我们只对有限数量的神经元进行了细胞丢失的直接分析塞得-4(编号1162)阻止所有程序性细胞死亡的突变秀丽线虫神经元[类似于bax（巴克斯）古尔德描述的删除实验等. (30)]未能抑制hTDP-43表达导致的不协调表型。结果如下秀丽线虫因此，该模型与TDP-43毒性一致，TDP-43主要通过诱导运动神经元轴突/突触功能障碍而非直接激活细胞死亡途径发挥作用。这与我们之前的哺乳动物细胞培养实验一致(13).

我们利用细胞转染实验证明，在HeLa细胞中，内源性TDP-43的siRNA敲除后，转染的TDP-1可以支持CFTR报告子结构的选择性剪接。此外，C末端TDP-1序列可以恢复剪接功能，并对C末端缺失的TDP-43进行适当的核定位。除了支持TDP-43和TDP-1的正畸学外，这些观察结果还提出了关于TDP-43 C末端功能的问题。TDP-43和TDP-1 C末端区域之间没有明显的序列相似性，并且TDP-1没有明显的富含甘氨酸的结构域(10). 尽管如此，TDP-1 C-末端可能与TDP-43 C-末端与相同的hnRNP相互作用(26)，对于TDP-1 C-末端在剪接分析中替代TDP-43 C-末端的能力的另一种解释是，任何能够纠正C末端缺失的TDP-43的核定位缺陷的序列都可以类似地在基于细胞的分析中拯救替代剪接。

含有RRM1缺失的hTDP-43的表达没有导致可检测的毒性，但改变了TDP-43的亚核分布。TDP-43的核重分布似乎与在U2OS细胞中表达的RRM1缺失的hTDP-43非常相似(31). RRM2的缺失也阻断了TDP-43的毒性，并导致转基因蛋白的核重分布。hTDP-43 RRM缺失变异体的核重分布可能反映了变异体与不同亚核结构域的关联，尽管由于缺乏合适的亚核结构，我们目前无法直接对此进行测试秀丽线虫抗体。hTDP-43 C末端的缺失显著改变了hTDP-33的核定位，在细胞核中通常可以看到一个单独的TDP-43内含物（图7D） ●●●●。阿亚拉等. (31)也报告了细胞培养中hTDP-43的C末端缺失，形成内含物；然而，这些内含物是可变的，在细胞质和细胞核中都可以观察到。

hTDP-43野生型和缺失变异体的毒性也已在酵母中通过高级表达进行性N末端和C末端缺失结构进行了检测(32). 这些研究人员在该模型中观察到全长和C末端hTDP-43的毒性。尽管这些研究人员将全长hTDP-43的毒性归因于细胞质积累，但我们的证据强烈支持核全长hTDP43在两种细胞中都具有毒性秀丽线虫和细胞培养模型。这种差异可能是因为酵母缺乏明显的TDP-43同源序列（可能还有一些依赖TDP-43的过程）。

我们还发现秀丽线虫NLS1中含有点突变的hTDP-43的表达导致弥漫和聚集hTDP-44的细胞质积累。与C末端hTDP-43片段形成的细胞质聚集体相反(13)，全长细胞质hTDP-43聚集体在这方面似乎没有神经毒性秀丽线虫模型。该结果支持C末端hTDP-43片段具有与其毒性相关的新功能增益的观点。这一结果也支持了这样一种观点，即TDP-43的核定位是我们在该模型中看到的神经毒性所特别需要的。核TDP-43活性导致异常突触的机制尚不清楚，但一个合理的解释是，过度的TDP-43活动改变了RNA代谢的某些成分（例如选择性剪接），随后导致适当突触功能所需的特定蛋白质的产生发生改变。

一个尚未回答的重要问题是，（野生型）TDP-43活性的过度表达是否在人类神经退行性疾病中起作用。许多证据表明C末端hTDP-43片段的积累与神经退行性变之间存在关联；因为这些碎片似乎不起作用(13)，其毒性机制不太可能与我们证明的全长hTDP-43在秀丽线虫或细胞培养。然而，似乎野生型TDP-43功能的失调在神经退行性疾病中起着中心作用，产生C末端TDP-43片段是神经元对抗过度TDP-43的一种尝试。野生型hTDP-43在果蝇属最近已经证明会引起神经毒性(33)，两个研究小组最近也报道了表达野生型hTDP-43的转基因小鼠的工程(34)或ALS突变体[hTDP-43Ala³¹⁵苏尔(35)]. 有趣的是，在苍蝇模型中，缺乏RRM域的TDP-43 N末端缺失变体的眼部特异性表达也未能产生可检测的神经毒性。在这两种小鼠模型中，转基因小鼠的神经病理学表型令人想起FTLD/ALS和C末端hTDP-43片段的积累。尽管在这两种模型中都观察到胞质泛素化内含物，但TDP-43要么不存在于这些内含物中（在ALS突变TDP-43小鼠中），要么存在于亚群中（野生型TDP-43鼠）。因此，正如在秀丽线虫这些转基因模型表明野生型hTDP-43的过度表达可能具有神经毒性，并且这种毒性不需要hTDP-33的细胞质沉积。

开发转基因的基本原理秀丽线虫TDP-43模型有可能利用遗传方法研究TDP-43的功能和毒性机制。我们最近在hTDP-43转基因蠕虫中发现了抑制神经元缺陷的突变（未发表的数据），并预计这些突变的表征将使我们对TDP-43的功能有最低限度的了解，并可能揭示与人类疾病相关的神经毒性机制。

材料和方法

补充材料

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基金

这项工作得到了梅奥诊所基金会（L.P.）、国家卫生研究院/国家老龄研究所的支持[R01AG026251；和P01-AG17216-08（L.P.）]，国家卫生研究院/国家神经疾病和中风研究所[R01 NS 063964-01号；（L.P.）和R01 NS063964型（C.D.L.）]、肌萎缩性侧索硬化协会（L.P.）、美国国防部USAMRMC PR080354（L.P）、加拿大卫生研究院（H.H.）、迈克尔·史密斯健康研究基金会（H.H）和AriSLA（E.B.）。

添加注释以证明

在本手稿修订期间，描述了另一种TDP-43毒性转基因果蝇模型[Hanson，K.A.、Kim，S.H.、Wassarman，D.A.和Tibbetts，R.S.（2010）Ubiquilin在肌萎缩侧索硬化（ALS）果蝇模型中修改了TDP-43的毒性。生物学杂志。化学。 285，11068–11072.]，其中发现野生型TDP-43的核积累具有神经毒性。

补充材料

致谢

参考文献