晚期骨发育不良是由一个单一的复发突变引起的FLNA公司基因

摘要

主要文本

晚期骨发育不良（MIM300244)这是一种罕见的疾病，其特征是晚期骨骼发育不良、皮肤色素缺陷和婴儿期复发的手指纤维瘤。在先前报告的家族和病例中，它被描述为男性致死性X连锁显性疾病。¹连锁研究将突变定位于Xq27.3-q28。²然而，尚未发现致病基因。

在本研究中，我们检测了三个家族和三个散发病例个体（Horii、，^三德鲁特，⁴和Breuning⁵). 荷兰家庭(图1A、 家族1）和意大利家族(图1A、 家族2）之前已有描述（Breuning⁵和巴伦西尼⁶). 第三个家庭(图1A、 家族3）以前没有被报道过，而且是非血统的，出身于以色列阿拉伯人。所有患者，一位母亲和她的两个女儿，认知发育正常。母亲（3I:2）患有慢性轻度阻塞性肺病和维生素B12缺乏症。自童年起，她进行了多次小手术，以清除手和腿上的小皮肤损伤。25岁时进行临床检查，头围54厘米（25%–50%），身高170厘米（75%–90%），臂长171厘米。右手显示第三-五指短趾，第四指短指甲，第五指侧偏。在她的左手上，第四个手指有侧倾，远端指骨外侧有一个小损伤，第五个手指斜行(图1B） ●●●●。她的右脚显示出一个短而高度植入的第四个手指。第二至第五指远端双侧增宽。她没有牙龈外系带，也没有翼状胬肉。骨骼X光检查显示，她的L1-L3椎体单侧扁平，继发右侧脊柱侧凸，L1椎体楔入。她的女儿（3II:4）在2个月大时接受了手术，以去除手、脚和牙龈上的小皮肤损伤。在3岁时进行临床检查时，她的头围为48厘米（25%–50%），身高为85厘米（<3%），体重为11.1公斤（<3%）。瞳孔间距5.4厘米（>97%），右内眦赘皮皱褶，腭正常，上下副系带肥大(图1C） 脖子短，胸部短。尽管进行了早期手术，但她的第二和第五指仍有双侧皮肤损伤，第五指有双侧斜趾损伤(图1D） ●●●●。她的脚部显示第三个脚趾有损伤，双侧第五个脚趾指甲增厚。骨骼X光检查显示肱骨近端和股骨近端有双侧溶解性病变，她的脚和手有多处软组织病变。最小的女儿（3II:5）出生时手脚有多处损伤，包括第三个脚趾的双侧脚掌和第四个脚趾上的双侧脚背。出生时超声心动图显示永存卵圆孔。在6个月大的时候进行临床检查，她的头围为42厘米（25%–50%），身高为58.8厘米（<3%），体重为5.1公斤（<3%）。她患有轻度肥大，右颞槽有三个大小不等的棕色斑点（3毫米至1.5厘米），轻度下颚退缩，右上副系带，腭裂，短颈和短胸。她有双侧腋下翼状胬肉(图1E） 右侧更严重。在双侧，她的肘部伸展有限，双手正常旋后和内旋。在她的右手里(图1F） ，她的第二至第五指有多处皮肤损伤，第二和第三指有斜指和侧偏，第五指狭窄，远端没有折痕。她的左手第二、四指出现皮肤损伤。她的第二个手指很窄，并且有侧向偏移。第三指至第五指有钟趾，第五指有短指和斜指，远端没有折痕。她的脚上有双侧足底凹陷。右脚第二五趾远端增宽，第二、三趾短趾伴并指。第三和第四脚趾被压倒了。在她的左脚上，第二个五分之一的脚趾远宽。她的第三个脚趾上有第二个和第四个脚趾的重叠，这是近距离植入的第三个趾的短趾。骨骼X光检查显示肱骨近端双侧溶解性病变、左侧股骨近端溶解性病变和多处软组织病变。她脚上的跗骨发育不全。不同患者的表型总结如下表1.

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图1

家族3的谱系和表型

（A） 本研究调查了家系。在家族3中，XCI模式显示携带突变等位基因的X染色体沉默。

（B） 3I:2的手。

（C） 多发性系带3II:4。

（D） 3II的右手：4。她患有斜趾和手指纤维瘤。

（E） 右腋下翼状胬肉3II:5。

（F） 3II的右手：5。

从外周血（家族1、家族2和家族3）、颊细胞（患者1）或石蜡包埋组织（患者2和3）中提取患者及其家族成员的DNA。荷兰和意大利家族的两个先证者（1II:4和2III:5）采用X-外显子靶点富集方法（SureSelect，Agilent）和下一代测序（Illumina Genome Analyzer II）进行了测试。用于序列捕获、富集和洗脱的方法遵循制造商（SureSelect、安捷伦）提供的说明和协议，但进行了一些修改。简而言之，根据制造商的指示，将500 ng DNA片段化（生物破坏者，帝亚吉诺德），以产生200至300 bp的片段。在两端添加来自Illumina的双烯适配器寡核苷酸。然后将DNA-适配器样片段与250 ng的SureSelect X染色体寡核苷酸捕获文库（Sure Select，Agilent）杂交14小时。杂交、洗涤和洗脱后，对洗脱物进行扩增，以创建足够的DNA模板用于下游应用。用Illumina技术平台对洗脱富集的DNA片段进行测序。我们按照制造商的说明，在所提供的集群站上准备了成对流动池。

Bowtie将这些读数与参考人类基因组（hg 18，NCBI构建36.2）对齐⁷(表S1，在线提供）。通过搜索30%以上的读取中存在变异核苷酸的位置来执行替代变异调用。删除dbSNP中出现的高频替换后，位于先前确定的TOD连锁区间Xq27.3-q28中的变体被列在表2从这些变体中，c.5217G>A是两名患者在FLNA公司选择该基因进行进一步研究的原因如下：（1）第31外显子的最后一个核苷酸c.5217G>A被Human splicing Finder预测会影响剪接。⁸剪接供体位点的得分从91.2降至80.63，表明野生型位点可能无法正常发挥作用。（2） 中的突变FLNA公司据报道与显示与TOD部分表型重叠的疾病有关。⁹

Sanger测序结果证实存在c.5217G>A(图2A） 和c.5850T>c(图2B） 在家族1的所有受影响病例中（III:4和III:6），以及在内含子中发现的c.5686+84A>G，但未在未受影响的个体中发现（I:2）。进一步的证据来自对意大利家族的分析，受影响的病例（2II:4和2II:5）携带完全相同的变体c.5217G>A，以及另一个外显子变体c.5814C>T。不幸的是，我们无法获得父母双方的材料，因此无法确定突变是否是新发生的。值得注意的是，家族1和家族2在c.5217G>A突变附近有两个不同的变体，因此极不可能有一个亲密的共同祖先。最后，在分析第三个TOD家族和三个不相关的散发病例后，我们在所有患者中再次发现了完全相同的c.5217G>a变体，但在未受影响的家族成员中没有发现（1I:2、3I:1和3I:3）。

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图2

基因结构与突变分析FLNA公司

（A） 在所有患者中通过Sanger测序证实了c.5217G>A。未受影响的家庭成员和对照携带纯合子正常等位基因。

（B） 家族1中c.5850T>c的序列。

（C）FLNA公司位于连锁分析的目标区域Xq28。c.5217G>A改变FLNA公司.

变体c.5217G>A影响FLNA公司基因(图2C） ●●●●。在蛋白质水平上，预计它不会改变编码的氨基酸，但作为外显子的最后一个核苷酸，它可能会影响剪接。^10–12RNA是从培养的上臂皮肤成纤维细胞中分离出来的，这些成纤维细胞是在知情同意的情况下，在最近的一次全身麻醉骨科手术中去除的。细胞在含有5%CO的人成纤维细胞标准培养基（含有10%FBS、1%青霉素/链霉素、1%葡萄糖、1%谷氨酸）中培养₂在37°C条件下。用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）提取RNA。根据供应商（MBI-Fermentas）提供的协议，通过RevertAid RNaseH-M-MuLV逆转录酶从500 ng总RNA合成cDNA，总体积为20μl。使用下列引物通过RT-PCR扩增靶区表S2根据制造商的说明，使用生物分析仪2100 DNA芯片1000（安捷伦）对产品进行评估。患者成纤维细胞的RNA仅显示正常转录物，转录物1（NM_01456）和转录物2({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001110556”，“术语id”：“1540352128”}}NM_001110556)不同之处在于转录本2中插入了24bp外显子30。尽管转录本1被报道为对照组的主要转录本，¹³我们在对照组中检测到大约相等的表达水平(图3B、 通道2-4和8）和患者成纤维细胞转录物2的高表达(图3B、 车道1）。通过QIAGEN凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中分离出这两条带，并通过Sanger测序进行分析。有趣的是，我们没有检测到突变等位基因的表达。这可能是由于非传感介导的衰变¹⁴和/或X染色体畸变失活（XCI）。为了测试第一种可能性，用环己酰亚胺处理成纤维细胞¹⁵持续4.5小时，然后使用与未处理细胞RNA相同的程序进行RNA分析。放线菌酮处理细胞的RNA中仍然没有突变等位基因。用雄激素受体（AR）分析XCI。¹⁶该检测显示，1I:2中的XCI是随机的，而患者1II:4中的突变染色体的XCI是100%的（患者1II:6是无信息的），这表明突变等位基因是失活的。

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图3

选择性剪接检测与三维蛋白质模型

（A） 四人示意图FLNA公司纤维瘤细胞中的转录物：转录物1和转录物2，在外显子31末端携带48bp缺失，以及正常转录物3和4。

（B） 来自安捷伦2100生物分析仪的RT-PCR结果。通道1是1III:6成纤维细胞的产物，其具有主要的较长亚型。通道2-4和8是四个对照人类成纤维细胞。第5-7行显示了从1III:6的纤维瘤细胞中获得的RT-PCR产物，正常条带来自两个FLNA公司亚型，和两个额外的较短的带，在第6道（左手无名指）和第7道（左脚第五趾）中很微弱，而第5道（右手无名指）显示四个暗带。

（C） 1III:6成纤维细胞和纤维瘤细胞中C.5858T>C和C.5217G>A的Sanger测序结果。

（D） 的3D模型FLNA公司域15。删除的16个氨基酸用灰色标记。β链标记为红色。绿色代表转弯。黄色表示3/10螺旋。随机线圈为青色。

15年前，患者1III:6岁，双手第五趾和左脚第五趾的纤维瘤组织被手术切除并储存在液氮中。我们培养这些细胞并分析RNA。在纤维瘤细胞中，我们观察到两组带(图3B、 车道5–7），表示拼接改变。一组与正常成纤维细胞的长度相同(图3A、 转录本1和2），另一组更短(图3A、 转录本3和4，从左无名指和脚趾肿瘤的RNA隐约可见；图3B、 车道6和7）。请注意，纤维瘤总是包含肿瘤和正常基质细胞的混合物。序列分析显示删除了第31外显子的最后48个核苷酸(图3C） 导致16个氨基酸缺失。

促进临床诊断FLNA公司基因突变，我们建立了一个基于网络的FLNA公司使用LOVD软件的基因变体数据库。¹⁷在这个公开可用的数据库中，我们收集了迄今为止文献中报告的所有变体（总共83个；参见FLNA公司突变数据库），包括此处描述的变体。在TOD患者中检测到的c.5217G>A变异体以前没有描述过；它既没有被列入dbSNP，也没有被列入1000基因组项目的试点研究1。最后，对400多条染色体进行了测序，未发现突变等位基因（数据未显示）。

中的突变佛罗里达州据报道在大脑、骨骼、四肢、心脏、，¹⁸和其他器官¹⁹在人类中，⁹包括室周异位（PVNH[MIM300049])^20–24和耳腭颌（OPD）频谱紊乱，²⁵其中包括耳腭下颌综合征1型（MIM311300)^26–28和类型2（MIM304120),^26,29额跖骨发育不良305620),^26,30,31和Melnick-Needles综合征（OMIM309350).^26、27尽管每种OPD谱系疾病都有特定的临床症状，但显然与TOD有重叠的临床表现，包括全身性骨发育不良，包括颅面异常、手指和长骨异常。^9,32有趣的是，TOD患者最明显的症状是四肢骨骼发育不良和复发性手指纤维瘤，这表明TOD患者的主要症状是骨骼发育不良FLNA公司TOD表型突变。

这个FLNA公司该基因编码一种细胞骨架蛋白，丝素a，它将肌动蛋白丝交联成一个正交网络，并将其连接到细胞膜。在细胞骨架内，丝素A还介导与细胞信号传递、转录和发育相关的功能。³³丝素A由N端的两个钙调素同源序列（CH1和CH2）组成，与24个免疫球蛋白样丝素重复序列相连，由两个铰链分开，一个位于重复序列15和16之间，另一个位于反复序列23和24之间。为了检查患者细胞中丝蛋白A的稳定性，从成纤维细胞和纤维瘤细胞中提取蛋白质。使用来自Millipore的鼠人丝裂素A单克隆抗体MAB1680进行免疫印迹。未观察到分子量或分子量的差异。18种氨基酸的差异可能太小，无法通过免疫印迹进行区分。c.5217G>A突变位于DNA水平的高度保守位置，跨越除啮齿动物外的各种脊椎动物和无脊椎动物物种，并在六个不同的无关家族的所有十名患者中发现。此外，这种突变在纤维瘤细胞中引入了异常剪接。在蛋白质水平上，c.5217G>A编码重复序列15的倒数第二个氨基酸，紧邻铰链1。最近的研究表明，重复序列9-15包含一个F-actin结合域，该域是高亲和力F-actin连接所必需的。³⁴铰链1在维持肌动蛋白网络的粘弹性方面起着重要作用。³⁵此外，该区域与许多结合伴侣相互作用，例如TRAF1、TRAF2，³⁶CaR细胞外Ca²⁺受体，³⁷和FAP52。³⁸由于尚未描述该区域的晶体结构，因此使用了filamin B（PDB文件2 dmb）中重复15的晶体结构作为构建3D模型的模板，该结构与该感兴趣区域具有最高的一致性（58%）(图3D） ●●●●。该模型是使用WHAT IF和YASARA双组构建的。³⁹重复15包含两个测试表。帧内删除导致删除一个beta表中间的beta链顶部，以及该表侧面的两个beta链（灰色部分图3D） ●●●●。这些残基可能会形成某种β-股状结构，并大幅改变丝氨酸重复序列15高度保守的三级结构的结构。此外，这种结构将影响β片之后的残基，并将重复序列15连接到铰链1。虽然无法预测这些连接残基会发生什么，但我们相信它会影响蛋白质的整体构象，并可能影响丝氨酸A与其他分子之间的相互作用。

TOD的确切机制尚不清楚。然而，像其他X连锁疾病一样，XCI可能是疾病发展的关键因素。发展的作用FLNA公司出生时骨骼和皮肤畸形的存在证明了这一点。足趾上的多发性纤维瘤在第一年开始发生，纤维瘤在五岁时自发停止。众所周知，在二次选择的压力下，倾斜XCI在不同组织中不同，并与年龄相关。⁴⁰有几种机制可能导致这种偏斜，包括随机效应、携带突变或正常等位基因的细胞的选择性生长优势（次级细胞选择）以及导致特定等位基因优先失活的遗传过程。XCI的选择基本上是随机的，但在细胞增殖过程中，无论是在所有细胞中还是在组织特异性方式中，携带活性突变等位基因的细胞都可能有明显的劣势，逐渐丢失或被选中，因此在成年女性中较少出现。⁴¹由于FLNA公司基因通常表现出一种扭曲的XCI模式，²⁶这表明细胞需要正常的丝氨酸才能存活。对TOD家族的几项研究表明，患者的XCI偏斜，而未受影响的个体则随机失活。^1,6我们检测了家系1（1I:2、1I:4和1III:6）和家系3（3I:2，3II:3、3II:4和3II:5）的XCI模式；图1A） 通过AR分析。除了不了解情况的患者1II:6外，所有其他患者（1II:4、3I:2、3II:4和3II:5）的XCI表现出极度偏斜（0/100%），而正常家庭成员1I:2表现出随机XCI（30/70%），3II:3（50/50%）也是如此。由于在正常成纤维细胞的RNA中没有检测到突变等位基因，我们推断1III:6也有100%的XCI偏斜，突变等位蛋白优先失活。我们测试了2II:4和2III:5的XCI，两者都显示出100%的倾斜。⁶2II:4被作者解释为未受影响。然而，我们假设2II:4是TOD的携带者，因为她只有轻微的表现（口腔多处系带）。她可能在很早的时候就已经扭曲了XCI。局部XCI模式可能影响携带者女性表型的严重性，也与男性致死性、X连锁显性疾病中选择性女性生存相关。

综上所述，这些数据表明TOD是由一种独特的变体引起的，即c.5217G>a（p.Val1724_Thr1739del）FLNA公司基因。在其他数据库中未发现该变异，在其他致病性患者中未发现FLNA公司变异，与疾病分离，并位于Xq28，导致该疾病的潜在突变基因先前已在Xq28定位。在六个不相关的家族中发现了突变。它会影响剪接，并在蛋白质水平上导致16个氨基酸的缺失。丝蛋白A中的缺失区域被假设影响或阻止丝蛋白A与其他蛋白质的相互作用。

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