Nfs1的双重靶向性及其新型加工酶Icp55的发现

在线粒体和细胞核中检测Nfs1，但在细胞质中不检测

有许多研究表明酵母Nfs1具有核功能(5–7)然而，由于核组分中蛋白质的含量很低，这些数据是间接的。检测的困难促使我们采用了α-互补分析法，该方法以前被证明是一种敏感的方法体内检测日蚀分布蛋白的方法(1,16). α-互补是基于两个人工表达的肽片段的能力大肠杆菌组装β-半乳糖苷酶（指定为α77氨基酸和ω993氨基酸）体内只有当存在于同一个隔间中时才能形成酶活性复合物(16) (图2A类). 我们将β-半乳糖苷酶的α片段融合到Nfs1（Nfs1-α）的C末端，并在酵母中表达该融合蛋白，而ω多肽则在胞浆（ω）中表达_c（c）)，线粒体（ω_米)，或原子核（ω_{荷兰统计局}). 尽管ω_c（c）和ω_米已在前面描述过(16), ω_{荷兰统计局}这里首次将其描述为获得核定位指示的一种方法。创建ω_{荷兰统计局}，我们附上了SV-40 T抗原（PKKKRKV）的NLS(17)ω片段的C末端。我们已经进行了亚细胞分级，可以证明ω_{荷兰统计局}融合蛋白在细胞核中有显著存在（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图2。

Nfs1-α也定位于细胞核。 A类α-互补分析的说明：α-互补试验是基于β-半乳糖苷酶片段α和ω在同一隔室（线粒体）内的共同定位(中间面板)，或nucleus(右侧面板)). 酶活性可以通过生产蓝色X-gal平板上的菌落。如果这两块碎片在不同的隔间里白色菌落应该出现(左侧面板).塞浦路斯，胞浆；米特线粒体；Nuc（数字），细胞核。B类,Tet-NFS1携带指示质粒的菌株在YPD平板上生长，在30°C下，在有或无四环素（Tet启动子阻遏物）的情况下生长48小时。C类表达Nfs1或Nfs1-α的酵母细胞的亚细胞分离。总数(T型)，胞浆(C类)和线粒体(米)使用所示抗体通过Western blotting分析组分。对照组：HxK1（己糖激酶1），细胞溶质标记物，Aco1（乌头糖），线粒体标记物。D类共表达胞质ω（ω）的酵母培养物_c（c）)，线粒体ω（ω_米)，或核ω（ω_{荷兰统计局})与所示的Nfs1-α突变体一起生长在含有X-gal的半乳糖培养基上。蓝色菌落检测与所示ω片段相关的α片段。Nfs1号机组-ΔMTS公司-α是缺乏MTS的突变株，并且Nfs1-mutNLS号-α是NLS序列的四个氨基酸发生突变的突变体。对照：α_{荷兰统计局}-α片段与SV40 T抗原的NLS融合，HxK1-α-（己糖激酶1）是与α片段融合的胞质标记，Kgd2-α-是与α片段融合的线粒体标记。

使用Nfs1-α融合蛋白分析Nfs1分布的第一步是表明融合蛋白的明显特征与野生型蛋白的相同。下面描述了融合蛋白的酶活性体内(图2B类)，亚细胞分布(图2C类)和线粒体的加工(图3A类). Nfs1-α融合蛋白可以补充Nfs1在Tet-NFS1应变，应变(图2B类). 这种酵母菌株在内源性的上游含有一个Tet-off启动子NFS1型可以通过向培养基中添加四环素来抑制基因和(14). 这个Tet-NFS1表达空载体的菌株不会在含有四环素的YPD平板上生长，而表达融合蛋白（Nfs1-α）的同一菌株很容易在相同的培养基上生长(图2B类). 亚细胞分离实验表明，大多数Nfs1-α分子存在于线粒体部分(图2C类)，这种模式让人想起Nfs1野生型蛋白质(图2C类,顶部). 用抗线粒体（Aco1）和细胞溶质（己糖激酶1（HxK1））标记物的抗体监测每个分馏的质量(图2C类). 此外，如下一节所述，Nfs1-α在线粒体中得到有效处理(图3A类). 因此，我们得出结论，Nfs1-α表现出与野生型Nfs1相同的亚细胞分布。

在单独的窗口中打开

图3。

这个NFS1型基因编码单个基因产物。 A类在没有或存在CCCP（膜电位解偶联剂）的情况下，对表达Nfs1或Nfs1-α的野生型菌株进行代谢标记。第页，前体；米，成熟。B类，Nfs1突变体的示意图。灰色和黑匣子分别代表MTS和成熟序列，弯曲箭头代表潜在的翻译起始点。Nfs1-M85L突变蛋白包含一个错义突变，其中Met-85被改为Leu。Nfs1-Shift有一个额外的核苷酸(C类)插入第一个和第二个八月之间，导致从第一个八月开始的翻译提前终止。C类，的Tet-NFS1在有或无四环素的YPD平板上检测表达各种Nfs1突变蛋白的菌株的生长情况(泰特).D类，蛋白质印迹分析Tet-NFS1表达上述突变蛋白的菌株。细胞在含有四环素的半乳糖培养基上生长8小时。使用Hsp60抗体控制等效负载。

为了使用α-互补分析来检测Nfs1-α融合蛋白的亚细胞定位，编码Nfs1-α的质粒与胞浆、线粒体或核定位的ω片段（ω_米, ω_c（c）和ω_{荷兰统计局}在酵母WT细胞中同时共表达。当这些细胞生长在含有X-gal指示剂和半乳糖作为碳源的琼脂平板上时，Nfs1-α与ω共存的细胞获得蓝色菌落_米或ω_{荷兰统计局}，但与ω无关_c（c）碎片(图2D类). 这些结果表明，Nfs1-α分子的亚群位于细胞核中，事实上，胞浆中不存在Nfs1-(图2D类)为该蛋白的双重分布提供了直接证据。作为阴性对照，我们发现与Kgd2-α（线粒体α-酮戊二酸脱氢酶复合物的一种成分，二氢硫酰转琥珀酸酶）的α片段融合的唯一线粒体蛋白与ω共表达时产生无色菌落_{荷兰统计局}或ω_c（c）(图2D类). 然而，当α片段作为阳性对照物附着在NLS上时，它本身会产生蓝色与核ω片段共表达时的唯一菌落(图2D类). 细胞溶质控制蛋白HxK1-α融合蛋白（HxK1融合到α）不仅与ω共表达时产生蓝色集落_c（c）而且还有ω_{荷兰统计局}这是由于ω的不完全局部化造成的_{荷兰统计局}到细胞核，它的一个亚部分仍留在细胞质中。因此，共存ω的细胞出现蓝色菌落_{荷兰统计局}以及与α片段融合的任何细胞溶质蛋白。在这方面，因为Nfs1-α不是细胞溶质蛋白(白色ω的菌落_c（c）),蓝色ω的菌落_{荷兰统计局}明显检测蛋白质的核定位。

为了支持这一分析，一个缺乏MTS（ΔMTS-Nfs1-α，这反过来可能表明目前未知因素参与了这一过程。

此外，我们将Nfs1-α的NLS序列突变为与Nakai及其同事所描述的类似（不完全相同）(6)从RRRPR到GGGSR（命名为Nfs1-mutNLS-α），阻止蛋白质靶向细胞核。如所示图2C类突变型Nfs1-mutNLS-α仅位于线粒体中，在细胞核和细胞质中不存在(图2D类). 因此，我们得出结论，Nfs1在线粒体和细胞核之间具有双重靶向性，似乎NLS和MTS都需要进行这种双重定位。

酵母Nfs1是一种双本地化、单翻译产品

有多种机制可以使同一蛋白质定位于多个亚细胞隔室。在一种可能的机制中，产生了两种翻译产物，一种含有靶向信号，另一种缺乏靶向信号(23,24). 另一种双重目标机制涉及一个单一的翻译产品，但该产品分布在两个部分之间。为了检测Nfs1前体与成熟蛋白的比较，我们对酵母细胞进行了代谢标记，其中蛋白质的输入被膜电位解偶联剂CCCP阻断。如果有两个Nfs1翻译产物，当CCCP阻断线粒体的输入时，我们应该会得到两条带，对应于含有前体的MTS和缺乏MTS（分别为高分子量和低分子量）的成熟形式。然而，在CCCP存在的情况下，Nfs1和Nfs1-α只出现蛋白质的前体（p）形式(图3A类，比较车道1到2和三到4)这与单个Nfs1基因产物一致。这显然不排除没有检测到第二个翻译产物（核衍生物）的可能性，因为它是以微小的量产生的。

为了解决低丰度单一翻译产品的问题，我们生成了一个NFS1型第二个AUG（唯一的帧内起始密码子替代物）突变为UUG的突变体（将蛋氨酸密码子85变为亮氨酸，Nfs1-M85L，图3B类). 如所示图3C类Nfs1-M85L突变蛋白很容易在含有四环素的YPD板上生长，就像野生型Nfs1一样（比较第七和第八排)，表明单个翻译产物（从8月1日开始）同时产生线粒体和核蛋白。作为对照，我们在第一个和第二个AUG之间创建了移码突变（C的核苷酸插入），阻止了从第一个AUG到NFS1型，但这不应影响从第二个8月（Met-85，图3B类). 这种Nfs1-Shift突变体在四环素存在下无法生长(图3C类,第九排)由于线粒体Nfs1缺失。然而，如果从第二次AUG（Met-85）开始的转换启动能够实现核Nfs1靶向，则实际存在体内，人们应该能够用独有的线粒体Nfs1来完全补充这种活性。为了解决这个问题，我们使用了之前描述的唯一线粒体Nfs1-mutNLS突变体。含有编码线粒体（Nfs1-mutNLS）和核（ΔMTS-Nfs1）靶向型质粒的细胞实际上可以在四环素板上生长(图3C类,右侧面板第五排). 然而，同时表达Nfs1-shift和Nfs1-mutNLS的菌株不能在四环素平板上生长(图3C类)，表明Nfs1不是从第二个AUG转换而来的，因此不能补充Nfs1核功能。一致地，通过蛋白质印迹未检测到Nfs1移位的表达(图3D类,第四车道). 这些结果表明酵母NFS1型编码单个全长翻译产物，分布于线粒体和细胞核之间。

MPP处理核Nfs1

单个Nfs1翻译产物在酵母中双重定位的机制是什么？有两种可能的情况：第一，前体可能有效地靶向线粒体，但一小部分分子在经过MPP处理后，可能通过反向易位回到胞浆中。在这种情况下，核蛋白应该被加工，因此缺乏MTS。这种机制类似于前面描述的富马酸酶和乌头酸酶在酵母中的双重定位(1,23–28). 在第二种情况下，一些前体Nfs1分子从未到达线粒体，而是直接从胞浆靶向细胞核(2,5). 蛋白质Adk1在胞浆和线粒体之间的分布也有类似的机制(29). 根据这种机制，核部分应该包含全长的Nfs1前体，包括MTS。为了区分这些可能性，我们询问Nfs1的前体是否可以在核中发挥功能。如前几节所述，我们已经突变了Nfs1 MPP裂解位点(图1A类)，这导致表达未处理形式的Nfs1（Nfs1-UP）。如所示图1D类在CCCP存在（+）或不存在（-）的情况下，通过代谢标记检测Nfs1-UP-α的加工。对于Nfs1-UP，我们在存在和不存在解偶联剂的情况下检测到相同的前体大小条带（参见Nfs1-α的大小差异，而Nfs1-UP-α突变体的大小没有变化）。

Nfs1-UP突变蛋白的活性体内在条件酵母中分析Tet-NFS1应变。这种表达Nfs1-UP突变蛋白的菌株在四环素存在下没有生长(图4,右侧面板). 为了检查Nfs1-UP突变体在细胞核中是否不活动，我们使用了Nfs1-mutNLS。我们发现Nfs1-UP不能补充Nfs1-mutNLS，以促进Tet-NFS1应变，应变(图4,左面板最后一行)表明Nfs1-UP突变蛋白在细胞核中不活跃。基于这些发现，我们提出Nfs1需要由MPP处理才能在细胞核中发挥功能。这些数据支持一种机制，该机制涉及加工Nfs1的反向移位，即Nfs1的逆行运动（上述第一种情况）。

在单独的窗口中打开

图4。

未处理的Nfs1突变体在细胞核中不活跃。这个Tet-NFS1表达所示Nfs1突变蛋白的细胞在有或无四环素的YPD平板上生长(泰特).

为了进一步支持Nfs1核形式被加工的观点，WT培养物在镀锌10启动子进行了核亚细胞分离实验。核分数(N个)浓缩倍数是总细胞提取物的24倍(T型)，并通过蛋白质印迹分析等分试样。通过抗核标记物（组蛋白乙酰基H4）、线粒体标记物（Hsp60，Fumarase）和细胞溶质标记物（Hexokinase1，Fumarase）的抗体监测分馏的质量(图5). 核Nfs1-α显示出明显的分子量，与总细胞提取物中检测到的成熟线粒体形式没有区别，并且与前体的大小有显著差异(图5，比较第一和第二条车道到第三的和第四车道). 综上所述，这些结果强烈支持一种机制，即核Nfs1部分转位到线粒体（N末端），在MPP处理后，逆行运动回到细胞质，然后回到细胞核。

在单独的窗口中打开

图5。

所有Nfs1分子都在线粒体中加工。过度表达Nfs1-α的WT菌株的亚细胞分馏。总数的等分部分(T型)和核能(N个)通过Western blotting分析的分数。核分数的浓度大约是总分数的24倍。第页，前体；米，成熟。标记：Nfs1-α和Nfs1-UP-α。对照组：Hsp60（线粒体）、HxK1（胞浆）、组蛋白H4（细胞核）和Fum1（线粒体和胞浆）。