AKT/PKB信号：下游航行

摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/PKB已成为高等真核生物所有细胞内的一个关键信号节点，也是人类生理和疾病核心中最重要和最通用的蛋白激酶之一。自从在小鼠白血病病毒AKT8中发现癌基因以来(Bellacosa等人，1991年;斯塔尔，1987年)作为蛋白激酶C的同源物(Jones等人，1991年)，已经有许多激动人心的突破，阐明了Akt的上游调控机制（总结于图1). 最近几篇优秀的综述涵盖了Akt调节的分子细节及其在人类疾病中的作用（例如Bellacosa等人，2005年;Engelman等人，2006年). 在这里，我们重点关注Akt下游的信号传导，重点关注激酶的直接磷酸化靶点及其真正的细胞功能。

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图1

生长因子对Akt的上游激活

还描述了Akt信号和mTOR之间的复杂关系。活化受体酪氨酸激酶（RTK）通过直接结合或通过支架适配器（如IRS1）的酪氨酸磷酸化激活I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），然后结合并激活PI3K。PI3K磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌糖-3,4,5-三磷酸（PIP3），该反应可被PIP3磷酸酶PTEN逆转。AKT和PDK1在质膜上与PIP3结合，PDK1磷酸化T308处AKT的活化环。RTK信号也通过目前未知的机制激活mTOR复合物2（mTORC2），mTORC1磷酸化疏水基序S473上的Akt，该疏水基序可被S473磷酸酶PHLPP去磷酸化。Akt通过TSC1-TSC2复合物中TSC2的多位点磷酸化激活mTOR复合物1（mTORC1），这阻止了TSC2作为Rheb的GTPase激活蛋白（GAP）的能力，从而允许Rheb-GTP积累。Rheb-GTP激活mTORC1，其磷酸化下游靶点，如4E-BP1和S6激酶上的疏水基序（S6Ks；S6K1上的T389）。PDK1在不依赖于PDK1与PIP3结合的反应中磷酸化S6Ks上的激活环（S6K1上的T229）。Akt还可以通过磷酸化PRAS40激活mTORC1，从而减轻PRAS40介导的mTORC2抑制。一旦激活，mTORC1和S6K都可以磷酸化IRS1上的丝氨酸残基，以IRS1为目标进行降解，这是减弱PI3K-Akt信号的负反馈机制。有关详细介绍Akt调节和mTOR信号的最新评论，请参阅正文。

底物特异性

三种Akt亚型（Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ）在其激酶域内与蛋白激酶A、G和C有广泛同源性，因此是AGC激酶家族的成员。在确定激酶GSK3上的一个残基作为Akt在细胞中的第一个直接靶点之后(Cross等人，1995年)，对含有该序列变体的肽的开创性实验将Akt的最小识别基序定义为R-X-R-X-S/T-B(Alessi等人，1996b)，其中X代表任何氨基酸，B代表大量疏水残基。被Akt高效磷酸化的肽上−5和−3位置（即分别为5和3个残基，磷酸受体位点的N端）的R残基的关键要求将Akt的底物特异性与另外两种有丝分裂原刺激的AGC激酶RSK（MAPKAP-K1）和S6K1（p70S6K）的底物特异性区分开来，在这些位置能更好地耐受K。在这些“肽碱化”实验中，还发现磷酸化位点周围的其他残基对Akt有更微妙的偏好（例如对T at−2的偏好）。结合在GSK3肽底物上的Akt的高分辨率晶体结构提供了对决定Akt底物选择性的分子相互作用的结构见解(Yang等人，2002年).

使用肽库筛选获得了Akt首选底物特异性的进一步细节(Hutti等人，2004年;Obata等人，2000年)，它为磷酸受体位点的七个残基N末端和C末端内每个位点的所有20个氨基酸提供了无偏、系统和定量的分数。这种方法允许识别磷酸化位点周围每个位置的相关激酶选择的支持和反对的残基。一个叫做Scansite的生物信息学程序(http://scansite.mit.edu;Yaffe等人，2001年)提供了使用从此类筛选中获得的数据矩阵而非单一一致序列搜索蛋白质数据库的能力，并有助于识别新的Akt底物和缩小可疑底物上的目标残留。然而，这种方法需要谨慎使用，因为它只对识别候选磷酸化位点有用。蛋白质组中高质量Akt位点的绝对数量，以及与其他AGC激酶的底物特异性重叠，说明需要严格证明Akt对给定候选靶点的体内直接磷酸化。

细胞内仍有可能存在未知的序列背景或大分子相互作用，这可能使Akt磷酸化除最低要求的R-X-R-X-S/T外的基序。然而，目前还没有严格证明和独立证实的Akt底物属于这一类。因此，在下面讨论底物表征和特定底物的作用时，我们认为R-X-R-X-S/T基序的存在是必不可少的。

诚信Akt基板的定义标准

在这里，我们回顾了定义体内Akt底物应满足的标准。我们认识到这些标准的局限性，因为在一种条件下，Akt在一种细胞类型中磷酸化的同一位点可能在其他条件下被其他激酶磷酸化。然而，考虑到Akt信号的日益复杂及其在人类生理和疾病中的重要性，值得评估目前用于定义Akt直接下游靶点的实验范式。我们的讨论针对Akt，但标准与针对其他蛋白激酶提出的标准类似(Frame和Cohen，2001年). 许多方法被用来证明细胞内靶蛋白上位点的磷酸化。然而，没有一种方法是足够的；相反，需要Akt损失和获得功能的方法。最后，必须证明内源性底物上候选位点的磷酸化是由激活内源性Akt的特定生理刺激诱导的，并且磷酸化在Akt失活时丢失。

体外磷酸化

Akt直接体外磷酸化候选R-X-R-X-S/T位点的证明是确定Akt底物的必要步骤。应证明感兴趣的全长蛋白质的磷酸化，而不是与其他蛋白质（例如GST）融合的片段或基序。必须证明在相关场所掺入磷酸盐。然而，Akt在体外是一种有点混杂的激酶，如果给予足够的时间和底物，它将磷酸化大多数R-X-RX-X-S/T位点和一些R-X-X-S/T位点。因此，体外磷酸化虽然必要，但不足以确定Akt的新磷酸化位点。

磷酸化-现场读数

为了确认使用生物信息学和/或体外方法检测到的候选磷酸化位点，首先需要可靠且具体的磷酸化事件读数。这有时可以被检测为变性聚丙烯酰胺凝胶向缓慢迁移形式的转变。然而，Akt位点的磷酸化很少引起这种移位，这通常表示脯氨酸导向位点（即S/T-P），而Akt对这些位点磷酸化较差(Alessi等人，1996b;Hutti等人，2004年). 质谱技术与体内[³²P] 正磷酸标记后再进行二维磷酸肽定位是鉴定体内磷酸化位点不可或缺的工具。然而，由于其耗时和低吞吐量的特性，这些方法在表征细胞条件和负责磷酸化的激酶时，作为实验读数的用处不大。过去五年来，磷酸化基序的特异性抗体（即磷酸化底物抗体）对于识别和表征新的Akt底物具有极其重要的价值（例如。，Kovacina等人，2003年;Manning等人，2002年;Sano等人，2003年). 这些抗体针对含有磷酸化最小Akt底物基序（R-X-R-X-pS/pT；Zhang等人，2002年). 尽管这些抗体有助于识别候选Akt位点，但必须使用突变分析来确认抗体识别预测的位点。值得注意的是，至少一些目前可用的Akt磷酸底物抗体可以在序列上下文中识别R-X-X-pS/pT基序，在−5位置缺乏R(Zhang等人，2002年)尤其是当这种磷酸蛋白过度表达时（B.D.M.，未发表的数据）。最后，一旦获得表明特定位点的磷酸化受到调控的数据，金标准就是使用感兴趣位点特有的磷酸化特异性抗体。无论给定磷酸化事件的读数如何，这种方法之后必须进行实验，以证明对Akt的要求。

药理学

Akt位点的生长因子刺激磷酸化应该对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂的预处理敏感，例如沃特曼（≤100 nM）或LY294002（≤20μM），因为I类PI3K是Akt的上游激活剂(图1). 尽管低剂量的沃特曼对PI3K具有特异性，但它抑制所有类别的PI3K，并且可能有PI3K调节激酶（Akt除外）受到这种抑制的影响。对激酶RSK的高度特异性抑制剂（例如BI-D1870；Sapkota等人，2007年)mTORC1（例如雷帕霉素）对于分别排除RSK和S6K作为体内磷酸化事件的候选激酶也很重要。目前可用的Akt抑制剂存在特异性问题，因此限制了其用于将Akt定义为特定磷酸化事件或细胞功能的相关激酶。然而，靶向Akt高度保守的ATP-结合囊外区域的抑制剂是很有希望的，与其他AGC激酶相比，Akt应显示出更强的特异性。随着AGC激酶抑制剂特异性的提高，它们必将成为鉴定和验证Akt底物的有用工具。

功能丧失

目前药理方法的局限性决定了需要Akt特异性功能丧失方法。尽管最近开发的缺乏Akt功能的细胞系为确认底物提供了最严格的条件（见下文），但有几种类型的显性阴性Akt构建体可用，在抑制内源性Akt方面取得了不同的成功。根据我们的经验，缺乏两个活化磷酸化位点（Akt-T308A/S473A）的Akt作为显性负向激酶（K179D）版本的活性更高。然而，这些不同结构的显性负效应的分子机制尚不清楚，对上游激酶如磷脂酰肌醇依赖性激酶-1（PDK1）和mTORC2的潜在影响使得这种方法不太可取。通过小干扰（si）RNA敲除Akt亚型越来越常用于确定Akt底物和功能。了解不同Akt亚型的表达模式和使用亚型特异性抗体是这里的重要考虑因素。在任何给定的环境中，很可能需要敲除多个亚型。然而，最近的研究表明，Akt的异形特异性底物和功能比先前怀疑的更常见（见下文）。

功能增益

外源性Akt结构的过度表达必然会增加其底物的基础磷酸化和刺激磷酸化。然而，考虑到伴随着细胞中激酶-底物相互作用的严格的时间和空间调控，外源性过度表达的构建物不应作为定义Akt底物的唯一依据。膜靶向型Akt，如肉豆蔻酰化PH结构域缺失Akt（myr-ΔPH-Akt），被带到不依赖PI3K活性的质膜，已被最广泛地用于确定Akt组成激活的细胞效应(Andjelkovic等人，1997年;Kohn等人，1996年). 然而，根据所使用的膜靶向结构，可以检测到下游信号的差异效应。另一种选择是Akt的磷酸化突变体（Akt-T308D/S473D），其活性低于myr-Akt衍生物，但具有组成活性和PI3K独立性(Alessi等人，1996年a). 总的来说，关于潜在过度表达伪影的一般担忧肯定适用于激酶-底物相互作用和磷酸化事件，并且应谨慎解释使用此类结构获得的结果。

遗传学

遗传系统在鉴定和确认激酶底物方面发挥了重要作用。秀丽线虫和果蝇属遗传学已经成为阐明信号通路的有力工具。使用遗传方法阐明Akt信号传导的一个重要例子是发现叉头盒O（FOXO）转录因子Daf-16位于PI3K和Akt同源序列的下游秀丽线虫用于控制发育和代谢状态，称为dauer(Paradis和Ruvkun，1998年). 虽然遗传上位性分析有助于定位特定激酶下游的新候选底物，并有助于了解激酶对给定靶点的作用，但需要更严格的方法来证明直接磷酸化。然而，激酶的功能丧失或缺失等位基因对于确认体内磷酸化事件的激酶特异性是有价值的。为此，小鼠遗传模型对于确定Akt的真正目标越来越重要。现在已经制造出多种异构体特异性Akt基因敲除小鼠及其组合（在Dummler和Hemmings，2007年)，并且这些可以用来证明给定底物的磷酸化在感兴趣的特定细胞类型中需要特定的Akt亚型。用于确认体内Akt底物的其他强大的小鼠模型是Alessi及其同事产生的一对PDK1敲除突变体。第一种是PDK1-PH域突变体（PKD1-RRR472-474LLL或PDK1-PH）的敲除蛋白_KI公司)不能与PI3K脂质产物结合，在Akt亚型的磷酸化和活化方面有缺陷，同时保持磷酸化其他AGC激酶的能力(McManus等人，2004年). 使用PDK1-PH证实了几种拟议Akt底物的磷酸化_KI公司胚胎干细胞，包括FOXO1和3、TSC2、GSK3、PRAS40和WNK1上的位点(McManus等人，2004年). 另一个PDK1敲除突变体是PDK1-PIF口袋突变体（PDK1-L155E），它可以激活Akt，但不能激活其他AGC激酶(Collins等人，2003年). 表达这种突变体的胚胎干细胞与关键的体内磷酸化位点Akt特异性检测并行使用。最终，所有候选底物和位点的磷酸化对Akt活性的依赖性应该在这样的细胞和小鼠模型中得到验证。

Akt基板和功能

仔细搜索文献，发现100多个报告的非冗余Akt基质，其中约25%不包含Akt场地的最低要求（例如R-X-R-X-S/T）。此外，许多确实包含该基序的序列还没有比体外激酶分析更进一步的特征。虽然我们尚未确定所有其他已发表的候选Akt底物如何达到上述标准，但我们已评估了18种底物的文献，其中已有多份独立发表的报告(表1和S1（第一阶段）). 在这项调查中，我们包括了对进化保护的分析(表S1). 确定的Akt磷酸化位点的保存程度可以指示底物与Akt的既定细胞功能的相关性。大多数经过彻底研究和独立确认的Akt磷酸化位点在所有哺乳动物的直系祖先中都是保守的，少数被保守到无脊椎动物模型中，例如果蝇属或秀丽线虫(表S1后生动物）。当使用动物模型来确定Akt底物在人类疾病中的作用时，保护分析尤其重要。例如，一项使用大鼠版本的蛋白Par-4/PAWR的研究得出结论，该蛋白是Akt的直接靶点，Akt在癌细胞生存中的作用至关重要(Goswami等人，2005年)，但提议的Akt位点在人类甚至小鼠Par-4/PAWR中不保守。最后，应该指出表1或者，下文的讨论并不排除公开的底物是真正的Akt目标。我们急切地等待对这些其他候选底物的进一步研究。

在本节中，我们将重点介绍Akt的已知细胞功能以及最有可能介导这些功能的Akt直接下游靶点。本讨论说明了表征任何激酶-底物对的最具挑战性的方面：定义新底物上一个或多个特定位点磷酸化的功能后果。为此，如果底物具有已知功能，磷酸化位点突变体（S/T到A）特别有用。这种突变体应阻断Akt对底物活性或涉及底物的细胞过程的积极或消极影响。尽管已经对极少数底物进行了研究，但磷酸化位点突变敲除小鼠的产生是一种特别有效的方法，可以确定Akt对给定靶点磷酸化的生理重要性（例如。，McManus等人，2005年). 拟磷酸突变体（S/T到D/E）的用途更为有限。将磷酸受体位点改变为酸性残基可能会模拟磷酸化，但并非在所有情况下都如此。当Akt磷酸化位点产生14-3-3结合基序时尤其如此，这是一种常见的调控模式（见下文），因为D和E残基在介导14-3-3的结合时是磷酸-S/T的不良替代物。从下面的讨论中可以明显看出的一个主题是，Akt的不同细胞角色不属于单底物-单功能范式；相反，Akt下游的每个生理反应似乎都由多个靶点介导(图2). 此外，一些Akt底物控制多个细胞功能，这些功能可能以细胞和信号控制依赖的方式变化。

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图2

十种Akt底物的细胞功能

Akt介导的这些蛋白质磷酸化导致其激活（箭头）或抑制（阻塞箭头）。Akt对这些底物的调节有助于激活所示的各种细胞过程（即生存、生长、增殖、葡萄糖摄取、代谢和血管生成）。如这十个目标所示，Akt基板之间存在高度的功能多样性和重叠。有关基板和功能的详细说明，请参阅正文。

细胞存活率

甚至在确定相关底物之前，几个组就独立地证明了Akt在促进生长因子、致癌基因和细胞应激下游的细胞存活方面的关键作用（在Marte and Downward，1997年). Akt通过阻断促凋亡蛋白和过程的功能来提高细胞的存活率。Akt负性调节几个Bcl-2同源结构域3（BH3）蛋白的功能或表达，这些蛋白通过结合和灭活前生存的Bcl-2家族成员发挥促凋亡作用。例如，Akt直接磷酸化并抑制BH3-only蛋白BAD(Datta等人，1997年;德尔佩索等人，1997年). 生存因子刺激S136上Akt介导的BAD磷酸化，这为14-3-3蛋白创造了一个结合位点，从而触发BAD从其靶蛋白中释放(Datta等人，2000年). 在BAD上磷酸化S136的能力对于Akt对神经元和其他细胞类型的生存影响很重要(Datta等人，1997年,2002). Akt还通过影响转录因子（如FOXO和p53）抑制BH3-only蛋白的表达。Akt磷酸化T24、S256和S319上的FOXO1，并磷酸化三个等效位点上的FOXO3a和FOXO4（参见Tran等人，2003年). Akt对FOXO蛋白的磷酸化发生在细胞核中，与BAD一样，磷酸化的T24和S256由14-3-3蛋白结合，从而取代靶基因中的FOXO转录因子并触发其从细胞核中输出。通过这种机制，Akt阻断FOXO介导的靶基因转录，从而促进细胞凋亡、细胞周期阻滞和代谢过程（见下文）。FOXO蛋白的一个重要促凋亡靶点是BH3-only蛋白BIM，它在细胞因子退出后刺激造血谱系中的细胞死亡(Dijkers等人，2002年). 此外，当FOXO因子未磷酸化且活性时，可诱导促凋亡细胞因子Fas配体（FasL；Brunet等人，1999年). Akt通过抑制BH3-only蛋白促进生存的第三个靶点是MDM2（或人类的HDM2），这是一种E3泛素连接酶，可触发p53降解。Akt磷酸化S166和S186上的MDM2，从而促进MDM2向细胞核的移位，在细胞核中负调控p53功能(梅奥和唐纳，2001年;Zhou等人，2001b). p53的两个转录靶点是BH3-only蛋白Puma和Noxa，它们似乎是p53诱导凋亡的基本靶点(Villunger等人，2003年). 然而，下调这些p53靶点对Akt介导的细胞存活的相对重要性尚未得到彻底研究。

Akt的其他直接靶点对抑制凋亡的重要性还不太清楚。Akt磷酸化高度保守的N末端调节位点（GSK3α-S21，GSK3β-S9）上的GSK3亚型，这种磷酸化使激酶失活(Cross等人，1995年). 虽然GSK3有许多底物可以解释这种Ser/Thr激酶的促凋亡作用（在Frame和Cohen，2001年)，最近发现前生存的Bcl-2家族成员MCL-1是GSK3抑制的直接靶点(Maurer等人，2006年). 凋亡线粒体途径中Bcl-2家族成员的下游是由caspase-9启动的caspase家族蛋白酶级联。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9经过蛋白质水解处理，并在线粒体释放细胞色素c时从其原氨酸蛋白酶形式激活。因此，Akt激活通过上述对Bcl2家族成员的影响阻止原氨酸酶-9的处理。Akt还被发现直接磷酸化人蛋白酶-9上的S196，这种磷酸化与体外caspase-9蛋白酶活性的降低有关(Cardone等人，1998年). 当与激活的Akt共表达时，procaspase-9-S196A突变体在诱导凋亡方面比野生型caspase-9更有效，表明caspase-8磷酸化在Akt的抗凋亡作用中起作用。然而，围绕半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9-S196的序列对于Akt底物来说是不寻常的，因为+1位置是P，并且Akt在肽磷酸化实验中强烈选择了这种脯氨酸定向位点(Alessi等人，1996b;Hutti等人，2004年). 此外，尽管Akt在阻止细胞凋亡中具有高度保守的作用，但并非所有哺乳动物中都存在这种Akt磷酸化位点，并且似乎仅限于灵长类的caspase-9。需要进一步的研究来确定胱天蛋白酶-9相对于Akt抑制的其他促凋亡蛋白的生理相关性。

Akt也有可能通过与其他途径的相互作用或通过对营养吸收和代谢的影响来发挥其一些细胞存活作用。例如，据报道，在某些条件下，PI3K-Akt途径激活NFκB生存信号或抑制JNK/p38凋亡信号（例如。，Kim等人，2001年;Ozes等人，1999年;Romashkova和Makarov，1999年). Akt信号对细胞生存的一个重要但更间接的影响是通过其在营养吸收、代谢和线粒体膜电位维持中的作用（在Plas和Thompson，2005年;罗比和海伊，2006年). 下面详细讨论了信号串扰和Akt对细胞代谢的影响。

细胞生长

Akt最保守的功能之一是它在促进细胞生长（即增加细胞质量）中的作用。主要的机制似乎是通过激活mTOR复合物1（mTORC1或mTOR-受体复合物），该复合物受营养素和生长因子信号调节。MTORC1是翻译起始和核糖体生物发生的关键调节因子，在细胞生长控制中起着进化保守的作用（综述于Wullschleger等人，2006年). 癌细胞和小鼠肿瘤模型对mTORC1抑制剂（如雷帕霉素）的PI3K-Akt途径的致癌激活增强了敏感性，这说明了Akt下游mTORCl激活的重要性（在萨巴蒂尼，2006年). 虽然Akt激活已被证实会影响mTORC1的下游底物，如S6K1和真核生物起始因子4E（eIF4E）结合蛋白1（4E-BP1），但Akt调节mTORCl向这些靶点的信号传递的机制更难确定。有人建议Akt直接磷酸化S2448上的mTOR，这通常与mTORC1激活有关，但突变分析未能证明这种磷酸化的任何功能意义(Scott等人，1998年;Sekulic等人，2000年). 此外，最近发现S6K1而不是Akt负责该位点的磷酸化(蒋介石和亚伯拉罕，2005年;霍尔茨和布莱斯，2005年).

几个独立实验室使用的补充方法果蝇属遗传学和哺乳动物细胞生物学发现，结节性硬化综合征2（TSC2，也称为结节蛋白）肿瘤抑制因子是mTORC1信号的关键负调控因子(高和潘，2001;Goncharova等人，2002年;Tapon等人，2001年)Akt介导的磷酸化抑制TSC2功能(Inoki等人，2002年;Manning等人，2002年;波特等人，2002年). Akt已被证明直接磷酸化TSC2上的两个位点（全长人类蛋白上的S939和T1462），这两个位点在果蝇属TSC2，并且可能磷酸化两个或三个额外位点（S981和S1130/S1132）。这些不同位点对Akt调节不同刺激物下游TSC2的相对重要性尚未确定。然而，TSC2的各种磷酸化位点突变体（S/T到A）可以主要阻断Akt介导的mTORC1信号的激活(Cai等人，2006年;Inoki等人，2002年;Manning等人，2002年). TSC2与其结合伴侣TSC1（也称为hamartin）形成复合物，作为Ras相关小G蛋白Rheb的GTP酶激活蛋白（GAP），当处于GTP结合活性形式时，它会强烈激活mTORC1(图1; 已在中审阅曼宁和坎特利，2003年). 因此，Akt通过抑制TSC2间接激活mTORC1，从而允许Rheb-GTP激活mTORC 1信号。

最近，发现第二个Akt底物参与mTORC1调控。像TSC2(Manning等人，2002年)40 kDa富含脯氨酸的Akt底物（PRAS40）通过Akt磷酸底物抗体进行鉴定，发现它是一种与胰岛素反应的14-3-3结合的主要蛋白质(Kovacina等人，2003年). PRAS40以生长因子和营养调节方式与14-3-3蛋白结合的能力被独立鉴定（称为p39）(Harthill等人，2002年). 尽管该蛋白的功能尚不清楚，但Akt可在T246上直接磷酸化PRAS40(Kovacina等人，2003年)这种磷酸化后来被证明对14-3-3结合很重要(Vander Haar等人，2007年). 应该注意的是，T246对Akt磷酸化位点的要求最低，但相对于其他Akt底物，它的得分明显较低(表S1)这表明其他激酶也可能磷酸化这个位点。重要的是，已发现PRAS40与mTORC1相关，并且似乎对mTORCl信号传导具有负调节作用(Sancak等人，2007年;Vander Haar等人，2007年). PRAS40T246A突变体的过度表达可以阻断S6K1的Akt激活，表明Akt介导的PRAS40在T246的磷酸化刺激mTORC1信号传导。此外，在果蝇属名为Lobe，其中包含一个与T246相似的站点，Lobe的行为类似于PRAS40果蝇属S2电池(Sancak等人，2007年). 在TSC2磷酸化的同时需要Lobe磷酸化可能解释了在果蝇属表达TSC2的Akt磷酸化位点突变体(董和潘，2004). 因此，Akt激活mTORC1的机制似乎有两个平行的，也许是功能冗余的机制(图1). 确定TSC2和PRAS40在不同生理条件下对Akt介导的mTORC1激活的相对重要性将是一件有趣的事情。

除了mTORC1通过其下游靶点增强蛋白质合成的能力外，Akt刺激细胞大小增加的其他合成代谢过程尚不明确。Akt在营养吸收和代谢中的mTORCI依赖性和独立性功能都可能促进细胞生长（例如。，爱丁格尔和汤普森，2002年;Plas和Thompson，2005年). 除了增加蛋白质含量外，为了使细胞变大，还必须增加膜的生物合成。Akt的一个建议目标是ATP柠檬酸裂解酶（ACL；Berwick等人，2002年)，其将柠檬酸盐转化为胞质乙酰辅酶A，从而为脂质生物合成提供必要的构建块。然而，ACL上提出的Akt磷酸化位点（S454；P-S-R-T-A-S-F）缺乏关键的−5 R。在上述Akt功能丧失小鼠模型中检查该位点的磷酸化将是重要的。

细胞增殖

虽然Akt最为人所知的是通过与Erk对细胞增殖的控制平行的途径促进细胞存活和生长，但Akt激活也可以通过影响细胞周期调节的多个下游靶点刺激增殖。几个小组独立地发现Akt磷酸化p27^基普1T157上的细胞周期素依赖性激酶抑制剂(Liang等人，2002年;Shin等人，2002年;Viglietto等人，2002年)通过14-3-3结合导致细胞溶质隔离(Sekimoto等人，2004年). 阻止p27定位于细胞核会减弱其细胞周期抑制作用。p27（p27-T157A）磷酸化突变的表达阻断了各种组成活性Akt衍生物的增殖效应(Liang等人，2002年;Shin等人，2002年;Viglietto等人，2002年). 然而，Akt介导的p27磷酸化对所有系统中的增殖都没有影响，因为T157在啮齿动物版本的p27中并不保守。Akt还通过磷酸化和抑制FOXO转录因子抑制p27表达(Medema等人，2000年). Akt还被发现磷酸化细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21^Cip1/WAF1T145是Scansite上的低得分Akt位点，与p27一样，这种磷酸化导致p21胞质定位(Zhou等人，2001a). 有趣的是，有人认为Akt1（而不是Akt2）磷酸化并抑制p21，而Akt2似乎结合并稳定p21，从而阻止细胞周期进展(Heron-Milhave等人，2006年). Akt还可能通过磷酸化和激活MDM2以及随后下调p53介导的p21转录来抑制p21的表达(梅奥和唐纳，2001年;Zhou等人，2001b).

已经讨论过的靶点Akt依赖性磷酸化，如GSK3、TSC2和PRAS40，也可能通过调节参与细胞周期进入的蛋白质的稳定性和合成来驱动细胞增殖。GSK3介导的G1细胞周期蛋白cyclin D和cyclin E的磷酸化及其转录因子c-jun公司和c-myc、，它们都在G1-S期细胞周期转换中起着核心作用，以蛋白酶体降解为目标(Diehl等人，1998年;Wei等人，2005年;Welcker等人，2003年;Yeh等人，2004年). 因此，Akt对GSK3的磷酸化和抑制应能增强这些蛋白质的稳定性。Akt信号也控制对细胞周期进展重要的蛋白质的翻译，主要通过TSC2和PRAS40的磷酸化以及随后mTORC1的激活。尽管mTORC1以其促进细胞生长的作用而闻名，但它是细胞增殖的关键调节器。mTORC1抑制剂（如雷帕霉素）的主要细胞作用是导致G1细胞周期停滞，Akt介导的细胞增殖和致癌转化最近被证明依赖于mTORC1的激活(Skeen等人，2006年). Akt信号传导通过mTORC1对4E-BP1的抑制导致eIF4E的激活，并且eIF4E促进许多靶mRNA的帽依赖性翻译，包括编码细胞周期蛋白D1和c-Myc的那些（综述于Mamane等人，2004年). 因此，与细胞生存和生长一样，Akt通过多种互补的下游途径控制细胞增殖。

PI3K-Akt信号在细胞周期其他阶段的过渡中是否重要尚不清楚。在一些细胞系中，Akt活性在细胞周期的G2/M期升高，即使存在DNA损伤，Akt-激活也可以通过有丝分裂促进进展(坎德尔等人，2002年;Shtivelman等人，2002年). 解释这一观察结果的一种机制是Akt直接磷酸化S280上的DNA损伤检查点激酶Chk1(King等人，2004年;Puc等人，2005年). S280磷酸化通过刺激Chk1易位到胞浆来阻断检查点功能，在胞浆中，Chk1与DNA损伤敏感激酶ATM和ATR隔离(Puc等人，2005年). 因此，PTEN抑癌基因的缺失会因组成性Akt激活和Chk1磷酸化而导致检查点缺陷，这可能会导致这种情况下的基因组不稳定。

血管生成

Akt通过对内皮细胞和产生血管生成信号的细胞（如肿瘤细胞）的作用，在生理和病理血管生成中发挥重要作用。在内皮细胞中，PI3K-Akt途径被血管内皮生长因子（VEGF）强烈激活Olsson等人，2006年)上述Akt靶点的磷酸化可能有助于内皮细胞的存活、生长和增殖。此外，Akt通过S1177的直接磷酸化激活内皮一氧化氮合酶（eNOS）(Dimmeler等人，1999年;Fulton等人，1999年). 由激活的eNOS产生的NO的释放可以刺激血管舒张、血管重塑和血管生成（在Morbidelli等人，2003年). Akt信号通路还通过mTORC1依赖性翻译（综述于Gordan和Simon，2007年;塞门扎，2003年). 内皮细胞和其他细胞中的HIFα激活导致VEGF和其他血管生成因子的表达和随后的分泌，从而通过自分泌和旁分泌信号刺激血管生成。最后，内皮细胞的主要亚型Akt1是内皮细胞正常迁移所必需的(Ackah等人，2005年)尽管尚未确定相关的下游目标。

细胞代谢

作为对生长因子的响应，Akt信号通过多种下游靶点以细胞内和细胞类型特异的方式调节营养素的吸收和代谢。Akt最重要的生理功能之一是对胰岛素作出反应，剧烈刺激葡萄糖摄取。胰岛素应答组织中的主要亚型Akt2在胰岛素刺激脂肪细胞时与含有葡萄糖转运蛋白4（Glut4）的小泡相关(Calera等人，1998年)Akt激活导致谷氨酸转位到质膜(Kohn等人，1996年). 虽然Akt刺激谷蛋白4移位的精确分子机制仍在深入研究中，但Rab-GAP AS160（也称为TBC1结构域家族成员4；TBC1D4）已成为Akt参与这一过程的重要直接靶点(Eguez等人，2005年;Sano等人，2003年). AS160上五个假定的Akt位点被磷酸化，以响应胰岛素，其中S588和T642使用Scansite程序得分最高。重要的是，这两个位点突变为丙氨酸显著阻断胰岛素刺激的谷氨酸转位(Sano等人，2003年). 目前的模型是，Akt介导的AS160上某些位点组合的磷酸化抑制了其GAP活性，从而允许Rab-family GTPase负载GTP并刺激谷氨酸小泡移位。然而，最近的研究表明AS160对这一过程的调控机制是依赖的(Bai等人，2007年)和其他参与谷氨酸转位各个步骤的候选Akt底物已被鉴定，包括PIKfyve(Berwick等人，2004年). 谷氨酸1是大多数细胞类型中的主要葡萄糖转运蛋白，与谷氨酸4不同，它似乎主要通过表达水平的改变进行调节。通过Akt介导的TSC2和PRAS40磷酸化激活mTORC1，可以促进谷蛋白1基因的HIFα依赖性转录和谷蛋白1 mRNA的cap依赖性翻译（例如。，Taha等人，1999年;Zelzer等人，1998年). 人类癌症中PI3K-Akt途径激活和HIFα积累的频繁发生可能解释了肿瘤中观察到的高水平谷氨酸1和葡萄糖摄取增强（综述于Majumder和Sellers，2005年;塞门扎，2003年). 除了葡萄糖摄取外，Akt还被建议以mTORC1依赖的方式调节其他营养物质（如氨基酸）转运蛋白的细胞表面表达(爱丁格尔和汤普森，2002年). 然而，Akt和mTORC1的这种作用的机制和更广泛的适用性目前尚不清楚。

Akt激活还可以改变细胞内的葡萄糖和脂质代谢。葡萄糖进入细胞后，通过己糖激酶的作用转化为活性形式的6-磷酸葡萄糖。已证明Akt能刺激己糖激酶亚型与线粒体的结合，线粒体更容易磷酸化葡萄糖，但Akt的直接靶点目前尚不清楚（综述于罗比和海伊，2006年). 6-磷酸葡萄糖可以通过转化为糖原来储存，也可以通过糖酵解分解代谢来产生细胞能量，而Akt信号可以调节这两个过程。在肌肉和肝脏中尤其重要的是，Akt介导的GSK3磷酸化和抑制可阻止GSK3的磷酸化并抑制其命名底物糖原合成酶，从而刺激糖原合成。Akt活化也会增加糖酵解速率(Elstrom等人，2004年)这可能是导致肿瘤细胞高度糖酵解的主要因素。Akt提高糖酵解速度的能力，至少部分是由于其通过HIFα促进糖酵酶表达的能力（例如。，Lum等人，2007年;Majumder等人，2004年;Semenza等人，1994年). Akt介导的FOXO1磷酸化和抑制也以细胞-对照依赖的方式促进了葡萄糖的稳态，因为FOXOl促进了肝脏葡萄糖的生成并调节了参与代谢控制的细胞的分化（参见Accili和Arden，2004年). 在肝细胞中，Akt还可以通过PGC-1α上S570的直接磷酸化来抑制糖异生和脂肪酸氧化(Li等人，2007年)，它是一种协同激活剂，可以与FOXO1和其他转录因子协同调节基因。Akt信号通过磷酸化和抑制GSK3来调节脂质代谢。如上所述，GSK3对底物的磷酸化通常靶向它们进行蛋白酶体降解，并且GSK3已被证明能促进固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）的降解，固醇调节元件结合蛋白是一种转录因子，可启动胆固醇和脂肪酸生物合成相关基因的表达(Sundqvist等人，2005年). 因此，Akt介导的GSK3抑制促进SREBP稳定性并提高脂质生成。如上所述，还建议Akt直接激活ACL(Berwick等人，2002年)注意，该酶上的相关磷酸化位点不符合Akt位点的最低共识。随着对PI3K-Akt途径在代谢性疾病和肿瘤代谢中的作用的强烈兴趣继续存在，很可能会发现Akt信号传导影响到中枢代谢的许多其他领域。

细胞迁移与侵袭

直到最近，Akt在控制细胞迁移、细胞外基质侵袭和最终转移中的作用还很难确定。令人惊讶的是，Akt1的激活被发现可以减少乳腺上皮细胞的迁移，并且Akt1可以防止上皮细胞向间充质细胞的转变，这种转变类似于转移所需的事件(Irie等人，2005年;Yoeli-Lerner等人，2005年). 已经探索了这种令人惊讶的Akt功能的两种独立机制。第一项发现Akt1对乳腺癌细胞系体外迁移和侵袭特性的抑制作用涉及一条导致活化T细胞核因子（NFAT）转录因子降解的途径(Yoeli-Lerner等人，2005年). 然而，Akt1介导的NFAT降解的分子机制目前尚不清楚。第二组研究发现，小干扰RNA敲除Akt1，而不是Akt2，导致乳腺上皮细胞迁移增加(Irie等人，2005年). 特别是，Akt1的缺失导致Erk1和Erk2的激活增加，这是增强迁移所必需的。同样，Akt1而非Akt2在该系统中抑制Erk信号的机制仍然未知。有趣的是，小鼠肿瘤模型也表明Akt1抑制转移(Hutchinson等人，2004年)而Akt2促进转移(Arboleda等人，2003年). 然而，Akt1和Akt2对上皮细胞迁移的这些差异作用可能不会转化为其他细胞类型。事实上，利用缺乏特定Akt亚型的小鼠胚胎成纤维细胞进行的细胞迁移研究表明，Akt1促进迁移，Akt2抑制迁移，对成纤维细胞迁移有相反的影响(Zhou等人，2006年). 这些研究证明了PI3K-Akt通路和其他通路之间串扰的重要性，以及人们逐渐认识到Akt的三种亚型可能具有不同的细胞功能。

与其他路径的串扰

在过去十年中，对信号转导通路的布线进行了广泛的研究，发现了一种复杂程度，即没有一条通路是孤立运行的，而这些通路是细胞内完全集成网络的一小部分。PI3K-Akt途径确实如此，我们在此仅讨论三个示例。一些研究表明，Akt信号可以激活多种刺激物下游的NF-κB转录因子，如肿瘤坏死因子（TNFα）和血小板衍生生长因子（PDGF；例如。，Ozes等人，1999年;Romashkova和Makarov，1999年). 虽然PI3K-Akt和NF-κB通路之间可能存在多水平的串扰，但一种机制被认为是Akt直接磷酸化IκB激酶α（IKKα）上的氨基酸残基T23，从而导致NF-κ的上游激酶活化(Ozes等人，1999年). 然而，到目前为止，Akt和IKKα之间的这种联系尚未在体内得到最终验证。Akt还通过抑制c-Raf阻断Erk信号传导（Raf1；隆美尔等人，1999年;Zimmermann和Moelling，1999年). Akt可以直接磷酸化T259上的c-Raf，这可能导致Akt对Erk通路的抑制作用(Zimmermann和Moelling，1999年). 与NF-κB一样，Akt和Erk信号之间的串扰并不普遍，似乎只在特定环境中发生。除Erk外，应激激活的MAPKs JNK和p38也被Akt信号抑制。Akt可以直接磷酸化凋亡信号调节激酶1（ASK1，也称为MAPKK5）上的氨基酸残基S83，ASK1是JNK和p38通路中的上游活化激酶(Kim等人，2001年). Akt以依赖S83的方式阻断凋亡刺激诱导的ASK1激活。因此，通过这种串扰可以在PI3K-Akt生存信号和JNK/p38凋亡信号之间建立平衡。

Akt异构体与其他AGC激酶之间的底物选择性

从上面的讨论中可以明显看出，Akt磷酸化了参与多种细胞过程的许多不同靶点，并且Akt不太可能在每种情况下都达到所有这些靶点。除了在各种条件下底物表达的差异外，Akt在其底物利用方面也可能存在刺激特异性差异。尽管有很多可能的解释，包括时间因素、亚细胞定位和激酶激活程度，但决定底物选择性的机制还不清楚。最近对缺乏Akt活化激酶mTORC2成分的小鼠胚胎成纤维细胞的观察表明，S473处的Akt磷酸化是其正确磷酸化FOXO蛋白N末端位点的能力所必需的，但Akt-S473的磷酸化似乎不需要Akt介导的其他FOXO位点或TSC2和GSK3位点的磷酸化(Guertin等人，2006年;哈辛托等人，2006年). 因此，有人认为S473磷酸化可以决定不同底物的利用(哈辛托等人，2006年). 另一个可行的解释是，不同底物，甚至单个底物上的不同位点，需要不同水平的Akt活性才能达到饱和或磷酸化到我们可以实验检测的程度（即使用可用的磷酸特异性抗体）。为此，人们早就知道S473磷酸化对Akt的生长因子刺激不是必需的，但它确实会导致Akt活性增加5到10倍(Alessi等人，1996年a). 然而，据我们所知，在没有S473磷酸化的情况下，没有生理刺激导致T308磷酸化。尽管这是一种有趣的可能性，但显然还需要进一步的工作来支持S473规定子状态切换机制的模型。

Akt研究的一个令人兴奋的领域是越来越多的研究表明Akt具有异构体特异性功能。这三种Akt亚型非常相似，特别是在其激酶域内，并且它们在体外不太可能具有可区分的底物特异性。此外，Akt1和Akt2广泛表达，许多细胞系表达所有三种亚型。然而，小鼠敲除已经揭示了三种Akt亚型的不同生理功能：Akt1缺陷小鼠表现出发育缺陷，Akt2缺陷小鼠存在葡萄糖稳态缺陷，而Akt3缺陷小鼠则表现出大脑发育缺陷（参见Dummler和Hemmings，2007年). 尽管联合敲除表明三种亚型之间存在功能冗余，但由于每种亚型的缺失而导致的不同表型表明，在细胞水平上可能存在功能差异。第一个明确的例子是Akt在刺激脂肪细胞中谷氨酸转位中的作用，发现Akt2而不是Akt1是主要的亚型负责（例如。，Katome等人，2003年). 第二个例子是上面讨论的关于Akt1和Akt2对细胞迁移的差异效应的例子(Irie等人，2005年;Zhou等人，2006年). 在这两种情况下，必须存在一种异构体特异性底物，而其他异构体对该底物的识别能力较差。最近一项关于两种Akt-S473磷酸酶PHLPP1和PHLPP2的作用的研究，这两种酶对三种Akt亚型有不同的调节作用，强调了Akt底物是亚型特异性的程度(Brognard等人，2007年). 在siRNA介导的敲除三种Akt亚型中的每一种后，对六种已知Akt底物的磷酸化状态的调查完美地表明，每种亚型都具有独特和重叠的底物特异性。需要更多的工作来确定观察到的特异性是否适用于所有细胞系，最重要的是，是什么决定了这种特异性。

Akt信号研究中的另一个复杂因素是，在某些情况下，其他AGC家族成员可以磷酸化先前被定性为真正Akt靶点的位点。这通常发生在刺激或基因损伤在Akt激活缺失的情况下强烈激活AGC激酶的情况下。例如，S6K1可以在mTORC1-S6K1信号传导增强的条件下磷酸化其Akt位点上的GSK3，这触发了一种阻止Akt生长因子激活的负反馈机制(Zhang等人，2006年). 然而，在Akt保持活性并能够磷酸化特定位点的情况下，其他AGC激酶也可能与Akt冗余。这似乎是FOXO3a上T32的情况，Akt和密切相关的AGC激酶SGK都可以在PI3K激活刺激下磷酸化该位点(Brunet等人，2001年). 这种补偿性和冗余机制在Akt信号中有多广泛尚不清楚，但在研究新环境中任何看似特征明确的目标时，应牢记替代调控的潜力。

Akt研究的未来

在过去的十年里，人们对Akt的调节和功能有了令人难以置信的了解。然而，明确认识到Akt信号缺陷是多种人类疾病的基础，这使得对下游靶点和功能的澄清对我们理解和治疗此类疾病至关重要。随着我们敲除、敲除或药理学抑制特异性Akt亚型和相关AGC激酶的能力显著提高，之前鉴定的底物应该得到更严格的证实。更先进的动物模型，如编码三种Akt亚型的催化失活突变体的敲除蛋白，与完全敲除相比，对功能补偿的敏感性更低，可能会提供更准确的异构体特异性底物和功能的图片。编码缺乏Akt磷酸化位点底物的Knockin突变体将允许关键地确定体内相关性以及特定磷酸化事件对特定生理和病理状态的贡献。关于细胞内Akt底物特异性的决定因素，仍然存在许多困难的问题。这三种Akt亚型在调节、定位和底物利用方面有何不同？Akt亚型和其他AGC激酶之间的功能冗余度是多少？哪些底物受到这种冗余的影响，这是如何规定的？Akt亚型是否使用与磷酸化位点分离的对接位点来识别底物？不同的Akt激活刺激如何影响底物选择性？进一步明确PI3K-Akt通路不同下游分支之间的串扰以及与其他信号通路之间的串音在Akt激活的最终生理结果中的作用也很重要。我们掌握Akt信号的复杂电路并预测改变更大网络的特定组件的后果的能力将需要系统生物学方法作为遗传学和生物化学的补充。尽管在过去的十年里，我们一直在组装零件清单，但将其拼凑在一起并弄清楚其真正工作原理的挑战性工作仍在前方。

补充材料

致谢

脚注

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