SREBP活性受mTORC1调节并参与Akt依赖性细胞生长

Akt激活SREBP1

对敲除小鼠的研究表明，SREBP1a和1c选择性参与脂质生物合成的调节(Liang等人。，2002)脂肪生成基因的启动子在体内优先与SREBP1a结合(Bennett等人。，2004). 成熟的SREBP1可以在核裂解物中检测到，作为扩散带迁移到60-65kDa之间。图2A和2B表明，在Akt激活后2小时内可以检测到核mSREBP1的积累。mSREB1的诱导先于全长SREBP1的增加，这可以在Akt激活8小时后检测到(图2A、 2B和第3章). Akt激活4小时和8小时后，可以分别检测到FASN mRNA和蛋白表达的增加(图2C和2D）。甾醇阻断了核mSREBP1和FASN表达对Akt激活的诱导(图2E和2F）。甾醇诱导SCAP的构象变化，从而诱导INSIG结合，从而阻止SREBP/SCAP复合物的ER/Glgi易位和SREBP的加工(Sun等人。，2005). 观察到的对固醇治疗反应的flSREBP的诱导很可能是由于肝脏X受体（LXR）的激活(Repa等人。，2000) (图2F） ●●●●。

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图2

Akt诱导mSREBP1在细胞核内快速积累

（A） RPE myrAkt-ER细胞在含有1%LPDS的培养基中培养16小时，并用100 nM 4-OHT处理指定时间。制备核提取物并分析成熟SREBP1（mSREB1）的表达。在上清液中检测到全长SREBP1（flSREBP）。

（B） RPE细胞中响应Akt激活的成熟和flSREBP1水平的定量表示。

（C和D）细胞用100 nM 4-OHT处理指定时间。通过qPCR测定FASN的相对mRNA丰度。将数值归一化为GAPDH，并显示相对于溶剂处理对照的数值。图（D）显示了两个独立实验的代表性，实验重复进行。从与（C）平行处理的细胞制备的全细胞裂解物用于测定FASN、flSREBP1和磷酸化Akt-ER的丰度。

（E） 细胞在含有1%LPDS的培养基中培养，并在存在或不存在10μg/ml胆固醇和1μg/ml 25-羟基胆固醇（甾醇）混合物的情况下，用100 nM 4-OHT或溶剂处理2小时，并分析核提取物中mSREBP1的表达。

（F） 在存在或不存在甾醇的情况下，用100 nM 4-OHT处理细胞24小时。分析全细胞裂解物中FASN、flSREBP1和磷酸化Akt-ER的表达。

（G） 细胞在含有1%LPDS的培养基中培养16小时，然后置于无葡萄糖培养基或含有2.5 mM葡萄糖的培养基。如图所示，用2-脱氧葡萄糖（2-DG）和4-OHT处理细胞。制备核提取物并分析其是否存在mSREBP1。

（H） 在用100 nM 4-OHT刺激24小时之前，将细胞置于含有1%LPDS的无糖培养基或添加2.5 mM葡萄糖或葡萄糖和2-DG的培养基中30分钟。分析全细胞裂解物中FASN和全长SREBP1的表达。

（一） 用4-OHT处理细胞2小时，用或不用AICAR预处理30分钟。分析核提取物中是否存在mSREBP1。误差条代表SD。

Akt通过诱导葡萄糖转运蛋白表达和膜定位诱导葡萄糖摄取，并通过激活己糖激酶增强糖酵解活性(曼宁和坎特利，2007年). 接下来，我们询问是否需要葡萄糖来激活SREBP1的Akt依赖性。缺乏葡萄糖或使用2-脱氧葡萄糖（糖酵解抑制剂）治疗，可阻断mSREBP1的Akt依赖性积累(图2G） 并阻止SREBP靶基因的诱导(图2H） ●●●●。葡萄糖饥饿或糖酵解抑制后的能量消耗可能导致AMPK激活(哈迪和卡林，1997年). AICAR激活AMPK还阻止mSREBP1对Akt激活的反应(图2一） 并阻止SREBP靶基因的诱导(图S4). 这些结果表明，Akt对SREBP1的激活受细胞能量状态的调节。

SREBP1激活和脂质生成需要mTORC1

mTORC1的活性受生长因子信号转导、营养物质可用性和能量平衡调节(Sarbassov等人。，2005). 因此，我们测试了Akt对SREBP1的调节是否涉及mTORC1。雷帕霉素可阻止mSREBP1对Akt激活的核累积(图3A） ●●●●。同样，雷帕霉素治疗阻断了FASN和ACLY mRNA和蛋白水平的诱导(图3B和3C）。重要的是，雷帕霉素治疗完全消除了核糖体蛋白S6的磷酸化诱导，但仅对GSK3或ACLY的磷酸化有轻微影响，表明myrAkt-ER融合蛋白的活性不受雷帕霉素的影响(图3C） ●●●●。此外，雷帕霉素治疗还阻断了胰岛素依赖性诱导的FASN蛋白和mRNA(图S5A和S5B）和mTOR的异位表达足以在U2OS细胞中诱导mSREBP1和FASN的表达，而无myrAkt-ER激活(图S5C） ●●●●。

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图3

依赖Akt激活SREBP1和脂肪生成需要mTORC1活性

（A） RPE-myrAkt-ER细胞在含有1%LPDS的培养基中培养16小时，并用100 nM 4-OHT处理2小时，用或不用50 nM雷帕霉素预处理30分钟。制备核提取物并分析mSREBP1的表达。

（B） 细胞在含有1%LPDS的培养基中培养，并在存在或不存在50 nM雷帕霉素的情况下用100 nM 4-OHT或溶剂处理24小时。提取总RNA并通过qPCR分析ACLY和FASN的表达。将值归一化为GAPDH，并代表三个独立实验之一。

（C） 使用如（B）中处理的细胞的全细胞裂解物来确定FASN、ACLY和flSREBP1的丰度以及ACLY和GSK3α/β的磷酸化。

（D） 用1μg myc-SREBP1（aa 1-490）野生型或T426A/S430A突变体表达载体转染细胞。转染24小时后，将细胞置于含有1%LPDS的培养基中，用100 nM 4-OHT或溶剂在50 nM雷帕霉素存在或不存在的情况下处理24小时。使用9E10抗体测定myc-mSREBP1的丰度。

（E） 用SREBP1和SREBP2（BP1+BP2）、mTOR、raptor、rictor或非特异性对照的100 nM siRNA寡核苷酸转染细胞。转染72小时后，将细胞置于含有1%LPDS的培养基中，用4-OHT处理24小时。用裂解液确认沉默效率并测定FASN和ACLY的表达。

（F） 平行于（E）处理的细胞用于测定D-[6的掺入-¹⁴C] 葡萄糖，[2-¹⁴C] -丙酮酸或[1-¹⁴C] -将醋酸盐转化为脂肪组分。误差条代表SD。

成熟的SREBP蛋白高度不稳定，并通过泛素依赖途径快速降解(Hirano等人。，2001). 已经证明，GSK3可以磷酸化mSREBP。这种磷酸化使Fbw7泛素连接酶结合并诱导SREBP蛋白降解。接下来，我们询问Akt是否影响mSREBP的稳定性。Akt的激活增加了转染myc标记的野生型mSREBP1（氨基酸1-490）的水平(图3D） ●●●●。当GSK3的两个磷酸化位点突变为丙氨酸时，这种作用被消除。有趣的是，在雷帕霉素的存在下，仍然可以观察到外源野生型mSREBP的Akt依赖性积累，这表明mTORC1功能对于Akt激活后稳定mSREBP1是不必要的。此外，使用化学抑制剂SB216763抑制GSK3并不能阻止内源性mSREBP1的Akt依赖性积累、FASN蛋白的诱导或对Akt激活的FASN启动子活性的反应(图S6). 这些结果表明，内源性SREBP的Akt依赖性激活不仅涉及SREBP稳定性的调节，而且还暗示了一个额外的mTORC1依赖性途径，该途径有助于SREBP激活。

以前有人认为雷帕霉素治疗也会影响某些细胞类型中mTORC2的活性(Sarbassov等人。，2006). 我们自己的研究结果表明，长期使用雷帕霉素治疗可通过抑制此处使用的细胞系中的负反馈环而激活Akt磷酸化(图S7). 为了解决mTORC2在调节脂肪生成基因表达中的任何潜在参与，我们使用siRNA分别选择性地消除mTORC1或mTORC3的组成部分猛禽或猛禽的表达。沉默mTOR和猛禽显著降低S6磷酸化(图3E） rictor沉默导致苏氨酸450的Akt磷酸化降低(图S8)，已被证明是mTORC2的底物(Facchinetti等人。，2008; Ikenoue等人。，2008). 沉默mTOR或猛禽，但不沉默rictor，可阻止Akt依赖性诱导FASN和SREBP1表达(图3E） ●●●●。沉默mTORC1或mTORC2组分不会影响SREBP2的表达。沉默mTOR还可以阻断U2OS细胞中Akt依赖性FASN和ACLY的诱导(图S9). 我们还讨论了SREBP在响应Akt激活诱导从头脂质生物合成中的作用。图3F表明，沉默SREBP1和2会阻止葡萄糖、丙酮酸或醋酸盐并入细胞脂质。此外，mTOR或猛禽的沉默，而不是猛禽的沉默，消除了对Akt激活的脂肪生成诱导(图3F） ●●●●。

哺乳动物细胞生长需要SREBP

接下来，我们询问SREBP诱导脂肪基因表达是否参与哺乳动物细胞生长的调节。以SREBP1和2为靶点的siRNA寡核苷酸的转染以剂量依赖性的方式显著降低了RPE细胞中Akt激活引起的细胞大小增加(图4A和4B）。同样，当SREBP1和2被沉默时，对Akt激活的FASN表达诱导减少(图4C） ●●●●。当使用不同的siRNA序列沉默SREBP1和2时，获得了类似的结果（数据未显示）。这些结果表明，SREBP的激活和SREBP靶基因的表达是哺乳动物细胞体外高效生长所必需的。

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图4

沉默SREBP1抑制Akt诱导的哺乳动物细胞生长

（A） 用SREBP1和SREBP2（BP1+BP2）特异性的50或100 nM siRNA寡核苷酸或非特异性对照物转染RPE-myrAkt-ER细胞。转染后72小时，将细胞置于含有1%LPDS的培养基中，用100 nM 4-OHT或溶剂处理24小时，并测定细胞大小。

（B） 相对于溶剂对照，Akt活化后中位细胞体积（MCV）的变化。

（C） 用与（A）平行处理的细胞的全细胞裂解物测定FASN、SREBP1、SREBP2和磷酸化Akt-ER的水平。误差条代表SD。

SREBP在细胞和器官大小控制中的作用果蝇属

HLH106型已被鉴定为编码苍蝇中单一SREBP同种型的基因，dSREBP在其DNA结合域内显示出与人类SREBP1的显著序列同源性(Seegmiller等人。，2002).

我们首先测量了dSREBP或dFAS的瞬时沉默对细胞体积的影响果蝇属细胞系Kc167。图5A和5B表明，沉默dSREBP或dFAS会导致G1细胞的平均细胞体积和FSC显著降低。同时沉默TSC2并不能挽救观察到的细胞大小减少。有趣的是，Kc167细胞的胰岛素治疗导致脂肪酸和磷酸甘油酯水平增加，与哺乳动物细胞中Akt激活后的结果类似(图S10).

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图5

dSREBP的沉默降低了细胞和器官的大小果蝇属

（A） 在没有或存在dTSC2 dsRNA的情况下，用对应于GFP、dSREBP或dFAS的dsRNA处理Kc167细胞5天，并测定电子细胞体积。

（B） 用流式细胞仪（FACS）测定G1群体FSC-A。

（C） dSREBP RNAi在胚胎发生过程中使用无女儿-GAL4(da-GAL4）驱动程序。用qPCR方法检测二龄幼虫dSREBP（白条）和dFAS（灰条）的表达。转录水平归一化为肌动蛋白mRNA水平，代表三个独立的实验。（RNAi-S1，单插入，RNAi-S2和RNAi-S3，双插入）。

（D） 表达dSREBP RNAi的雌性苍蝇的代表性表型da-GAL4号机组驱动程序与控制程序的比较(yw公司).

（E） 表达dSREBP的苍蝇的翅膀^RNAi-S3在翅膀的背细胞层。

（F） 机翼控制面积分析(yw公司)、dSREBP^RNAi-S1、dSREBP^RNAi-S2和dSREBP^RNAi-S3. (^∗)p≤10⁻⁵.

（G） 表达dSREBP的果蝇翅膀^RNAi-S3在发育中的翅膀的后部。

（H） 对照苍蝇（白色条）或在翅膀后室表达SREBP RNAi-2（灰色条）或SREBP RNA Ai-3（黑色条）的苍蝇的翅膀面积变化。(^∗)p≤10⁻⁸.

（一） 如（G）所示，机翼前部和后部的高分辨率图像。

（J） 表达GFP（白条）或dSREBP的果蝇翅膀上皮细胞数量的变化^RNAi-S3（黑色条状物）在机翼的后部。误差条代表SD。

为了探讨dSREBP在体内细胞生长调节中的作用，我们在UAS启动子的控制下，产生了一系列表达反向重复RNA的转基因果蝇。使用三种不同的飞行路线（RNAi-S1、RNAi-S2和RNAi-S3）进行分析。使用没有女儿的(da）-镀锌4驱动因子导致幼虫中dSREBP和dFAS的表达降低(图5C） ●●●●。三个RNAi株系的沉默效率存在差异，RNAi-S3的沉默效果最强(图5C） ●●●●。胚胎发生过程中dSREBP的沉默导致幼虫和蛹期的剂量依赖性发育延迟和死亡(图S11). 成年后的苍蝇表现出显著的体型缩小、体重减轻和翅膀面积减小(图5D和第12节). RNAi-S3飞行系与da-GAL4号机组驱动程序。这与dSREBP在幼虫发育过程中的重要作用一致(Kunte等人。，2006).

胰岛素信号通路成分的缺失或过度表达以细胞自主方式影响细胞大小(Weinkove等人。，1999). 因此，我们询问了dSREBP是否在细胞的特定隔室中沉默果蝇属翅膀会影响细胞和器官的大小。图5E和5F显示dSREBP RNAi盒在背翼室的表达(MS1096-GAL4）导致成虫翅膀面积的剂量依赖性减少。类似地，使用雕刻的(英语）-GAL4驾驶员导致机翼后室面积缩小(图5G和5H）。此外，后室的缩小伴随着翅膀上皮细胞密度的增加(图5I和5J），表明dSREBP沉默会导致细胞尺寸减小。我们还研究了通过基因沉默以外的方式抑制dSREBP功能是否会导致类似的生长抑制。哺乳动物SREBP中N末端反式激活结构域的缺失导致SREBP功能的显性抑制(佐藤等人。，1994).MS1096加仑4-N末端缺失的dSREBP（DN75）或除N末端（DN75T）外跨膜结构域被删除的突变体的驱动表达导致翅膀面积显著减少(图S13).

细胞大小测定和流式细胞术

使用胰蛋白酶分离RPE-myrAkt-ER细胞，洗涤后再悬浮在PBS中。使用Z2-Coulter计数器（Multisizer II，Beckman-Coulter）一式三份测定电子细胞的平均体积。采用离心法收集Kc167细胞并进行上述分析。对于G1特异性细胞大小，将KC167细胞固定并用碘化丙啶染色，测定G1-FSC。实验至少重复了三次。

代谢物分析

收集了两毫升培养基样品，用于分析代谢物浓度。450微升培养基样品与50μl D混合₂O、 添加25μl 10 mM TSP钠用于化学位移校准和定量。如前所述，使用双相提取方法提取细胞内代谢物(Tyagi等人。，1996). 在600μl氘化氯仿中重新配制脂质提取物，并使用0.008%v/v四甲基硅烷作为化学位移基准（0 ppm）。在600μl D中重建水溶性代谢物₂O、 添加25μl 1 mM TSP用于定量和化学位移校准。质子核磁共振谱是使用Bruker 600 MHz（Bruker Avance）核磁共振系统获得的。水溶性和脂质代谢物的光谱峰根据Sitter等人。(2002)和Sze和Jardetzky（1990）分别是。代谢物水平被标准化为细胞数量，每个实验至少重复六次。

脂质合成

细胞在含有1%LPDS的培养基中，在100 nM 4-OHT或乙醇存在下生长24小时。2.5μCi/ml D-[6-¹⁴C] 葡萄糖（最终浓度45μM，Amersham），2.5μCi/ml[2-¹⁴C] -丙酮酸（166μM最终浓度）或10μCi/ml[1-¹⁴C] 添加-醋酸盐（最终浓度85μM，均为Perkin Elmer），并在37°C下培养细胞4小时。细胞在PBS中清洗三次，并在0.5%Triton X-100中溶解。通过连续添加2 ml甲醇、2 ml氯仿和1 ml dH提取脂质₂O.通过1000 rpm离心15分钟实现相分离。回收有机（低）相并干燥。脂质在Ultima Gold LSC鸡尾酒（Perkin Elmer）中溶解，并在Beckman LS 6500闪烁计数器上计数。每次测量重复进行，结果归一化为总蛋白质含量，实验重复至少两次。

细胞裂解和免疫印迹

对于总细胞裂解，用冰镇PBS清洗细胞，并将其溶解在裂解缓冲液中（1%Triton X-100、50 mM Tris pH 7.5、300 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM DTT和1 mM NaVO₄和蛋白酶抑制剂[Roche]）。核裂解物的制备如所述(Porstmann等人。，2005). 为了检测mSREBP，在裂解前用25μg/ml ALLN处理细胞1小时。在SDS-PAGE上分离等量的细胞裂解物，并将其印在PVDF膜（Immobilon）上。蛋白质通过免疫印迹和ECL检测进行检测。

RNA制备和定量PCR

使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）从RPE myrAkt-ER或Kc267细胞中分离出总RNA，并用DNase I（QIAGE）处理。用于制备来自果蝇属将10–20龄幼虫在液氮中均质并溶解在缓冲液RLT（QIAGEN）中，然后根据制造商的方案进行RNA纯化。使用2.5微克总RNA与SuperScript II RT和寡核苷酸dT引物（Invitrogen）进行第一链cDNA合成。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行实时PCR。所有反应至少进行两次。引物序列见补充实验程序.

转染和RNA干扰

根据制造商的说明，使用Fugene（Roche）转染RPE-myrAkt-ER细胞。转染后20小时，将细胞置于含有1%LPDS的培养基中，并用100 nM 4-OHT诱导，如图所示。

在基因检测实验中，使用DharmaFECT试剂1（Dharmacon）按照反向转染方案转染细胞。转染后20小时，将细胞分裂并分成平行培养物进行不同处理。SiRNA序列在补充实验程序.

对于Kc167细胞的耗竭实验，使用MEGASCRIPT T7转录试剂盒（Ambion）通过体外转录生成dsRNAs。引物序列见补充实验程序使用25μg dsRNA进行沉默，5天后对细胞进行分析。

转基因蝇类

由5′端的700 bp组成的序列dSREBP公司通过PCR从基因组DNA中扩增该基因，并将其作为反向重复序列插入pWIZ-UAST(Lee和Carthew，2003年). 转基因苍蝇产生于yw公司背景。将单个转基因插入染色体2和染色体3组合，以提高沉默效率。dSREBP公司^RNAi-S1：一次插入，dSREBP^RNAi-S2和dSREBP^RNAi-S3：两次插入。

UAS-Dp110WT、UAS-Dp110[KD]和dpp-GAL4/UAS-Dp110[KD]飞线已在前面进行了描述(Weinkove等人。，1999). MS1096-GAL4/UAS-Dp110WT苍蝇是Ernst Hafen（苏黎世联邦理工学院）赠送的礼物。dSREBP公司¹⁸⁹苍蝇是Robert B.Rawson（达拉斯德克萨斯大学西南医学中心）送的礼物。UAS-dSREBP航班从布卢明顿库存中心获得。dSREBP RNAi线T1是从维也纳获得的果蝇属RNAi中心。所有飞行路线的基因型见补充实验程序.

机翼面积和单元数分析

雄性苍蝇的翅膀在乙醇中脱水，装在Euparal（琼脂科学公司）并拍照。通过测量像素数确定机翼面积。细胞数量是通过计算前后翼室中固定大小区域的翼毛来确定的。除非另有说明，数据表示每个基因型至少20只翅膀产生的值。

我们感谢S.Marygold、B.Thompson和N.Tapon的有益讨论。我们也感谢J.Downward的建议和讨论。我们非常感谢E.Hafen、H.Stocker和R.Rawson提供航线。我们还感谢J.Ericsson提供材料。我们感谢S.Basu提供细胞株。我们感谢T.Gilbank产生转基因苍蝇，A.Schmukle帮助我们进行分析，感谢LRI设备园和FACS实验室提供的宝贵帮助。C.R.S.得到EMBO长期奖学金的支持。这项工作由英国癌症研究所资助。