Polycomb Complex 2需要用于E-钙粘蛋白蜗牛1转录因子抑制^{▿ †}

ES细胞的衍生、培养和类胚体的形成。

如前所述进行胚胎干（ES）细胞的衍生、培养和类胚体形成（ES分化）(30,31).

免疫组织化学。

石蜡切片取自胚胎第7.5天（E7.5）野生型或Suz12-缺陷型(31)小鼠胚胎或E9.5、E15和E18野生型胚胎。切片在二甲苯中脱蜡并重新水化。用高压锅在pH为9的Tris-EDTA缓冲液中进行15分钟的蜗牛1抗原回收。对于Suz12免疫组化，在37°C下用2 N HCl进行抗原恢复30分钟。将载玻片在硼酸盐缓冲液中清洗，并在0.01%胰蛋白酶中消化2分钟。用4%H封闭内源性过氧化物酶₂O（运行）₂将切片置于添加有3%牛血清白蛋白和抗蜗牛单克隆抗体的磷酸盐缓冲盐水中孵育15分钟1(12)和抗Suz12(31)一夜之间。E7.5胚胎用兔抗Suz12多克隆抗体（Upstate）染色。按照制造商的说明，使用Envision系统（丹麦Glostrup Dako）检测结合抗体。切片用苏木精复染。

瞬时转染和逆转录病毒感染。

RWP-1细胞在标准条件下生长(34)用脂质体和Plus试剂（Invitrogen）瞬时转染。使用Phoenix Gag聚合酶产生细胞通过磷酸钙转染方法生成逆转录病毒载体。SW-620和HT29-Snail1(1)在聚布林（4μg/ml；Sigma）存在下感染病毒上清液。

对于荧光素酶报告子分析，50 ng CDH1启动子[pGL3-E-cad（−178/+92）]，野生型或三个E盒突变的形式(1)转染RWP-1细胞。在存在小干扰RNA（siRNA）的情况下，以Suz12（200 ng）或GFP（200 ng的）作为对照，用pcDNA3-Snai1-HA共同转染细胞。猿猴病毒40-雷尼利亚荧光素酶质粒（1ng）共转染以控制转染效率。萤火虫的活动和雷尼利亚根据制造商的说明，在转染后48小时分析荧光素酶。

实时RT-PCR。

通过实时逆转录-PCR（RT-PCR）测定E-cadherin和Snail1的表达水平(三,34). 转染或感染后48小时，使用Gene Elute哺乳动物总RNA试剂盒（Sigma）提取总RNA。使用补充材料中表S1所示的引物，对RNA水平进行三次定量测定。采用ABI PRISM 7900HT序列检测系统进行RT-PCR和数据采集。

ChIP分析。

如前所述进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析(34)为了检测内源性启动子。对于外源性CDH1启动子，将1μg CDH1的启动子[pGL3-E-cad（−178/+92）]（野生型或三个E盒突变的形式）转染到RWP-1中，该RWP-1稳定转染有野生型或P2A突变的蜗牛1。电池（4×10⁶)用1%甲醛交联10分钟。在室温下，细胞在缓冲液IP1（50 mM Tris，pH 8，2 mM EDTA，0.1%NP-40和10%甘油）中溶解10分钟。然后在IP2缓冲液（50 mM Tris、pH 8、10 mM EDTA和1%十二烷基硫酸钠[SDS]）中溶解获得的颗粒。在40%的条件下进行五次超声波处理，持续10秒（Branson），以产生200-1500 bp的DNA片段。在IP缓冲液（16.7 mM Tris，pH 8，167 mM NaCl，1.2 mM EDTA，1.1%Triton X-100，0.01%SDS）中使用抗Snail1、抗Suz12、抗K27me3和无关免疫球蛋白G（Sigma）进行免疫沉淀。用洗脱缓冲液（100 mM Na）处理样品₂一氧化碳_三1%十二烷基硫酸钠和蛋白酶K），并在65°C下培养过夜，以逆转甲醛交联。使用GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒（Amersham）纯化DNA。用定量PCR Sybr绿色染色（Qiagen）检测启动子区域。在输入样本中通过定量PCR分析两个启动子（野生型和突变型）的转染效率，使用针对荧光素酶基因。采用ABI PRISM 7900HT系统进行PCR和数据采集。根据参考文献，ChIP结果相对于输入量进行了量化14.

PRC2组分的耗尽会影响肿瘤细胞中Snail1对CDH1的抑制。

此外，还利用肿瘤细胞系研究了PRC2在Snail1抑制CDH1表达活性中的作用。针对Suz12的siRNA的异位表达阻断了PRC2活性，显著降低了该蛋白的内源性水平（参见补充材料中的图S1）。Suz12基因敲除完全阻止了Snail1下调RWP-1细胞中CDH1 mRNA水平的能力（图。​（图3A，3A级，左侧面板）。研究了这种siRNA对蜗牛1对CDH1启动子的抑制作用的影响。如图所示。​图3B，3B公司，上皮细胞中Snail1的表达降低了CDH1启动子的活性，这种作用取决于该启动子中三个E盒的完整性（另见参考文献1). Suz12 siRNA的同时表达减少了Snail1对该启动子的影响，尽管它并没有完全消除它（图。​（图3B3B公司).

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图3。

PRC2下调影响肿瘤细胞系中Snail1对CDH1的抑制。（A） 将携带Suz12和Snail1特异siRNA的逆转录病毒与RWP-1细胞共感染或共转染Suz12与Zeb1的siRNA（siSuz12）后，通过qRT-PCR测定CDH1 mRNA水平。GFP的siRNA（siGFP）用作对照。转染后和RNA分离前用嘌呤霉素选择细胞48小时。图中显示了三次实验的平均值±标准偏差（SD），共三次。关于用Snail1获得的CDH1 RNA在对照细胞中的抑制作用，Snail1在siSuz12细胞中的降低作用是显著的P（P）值<0.01（用星号表示）。（B） RWP-1细胞中指定形式的CDH1启动子（野生型[WT]和突变型[E1E2E3 mut]）的活性通过pGL3-E-cad（−178/+92）CDH1基因启动子、pcDNA-3-Snail1或pcDNA-3-Zeb1在抗Suz12或GFP的siRNA存在下的瞬时转染来测定。显示了平均值±SD（三次试验，一式三份）。星号表示在siGFP细胞与siSuz12细胞中CDH1启动子的抑制值显著不同P（P）值<0.01。（C） SW-620细胞感染了Ezh2突变体（H649L）、对照质粒（pBabe）或含有Suz12、Ezh2（siEzh2）或GFP特异siRNA的逆转录病毒作为对照。如上所述，通过qRT-PCR分析测定CDH1和PTEN mRNA水平。该图显示了一式三份的五次实验的平均值±SD。用单个星号表示的差异是显著的P（P）值<0.01。

如引言所述，CDH1的表达也受Zeb1阻遏物控制。我们检查了该阻遏物的作用是否也受PRC2控制。如图所示。​图3A3A级（右图），由Zeb1表达引起的CDH1 mRNA水平的下调不受Suz12 siRNA的影响。当通过报告试验测定Zeb1对CDH1启动子活性的影响时，也得到了类似的结果：Suz12的缺失并没有显著改变Zeb1抑制CDH1的启动子（图。​（图3B）。3B公司). 因此，这些结果表明Snail1和Zeb1使用不同的机制来直接抑制CDH1。

我们还分析了PRC2干扰对SW-620细胞CDH1mRNA水平的影响，SW-620是一种E-cadherin低、Snail1和Zeb1高表达的细胞系(1). 如图所示。​图3C，3C公司PRC2活性的破坏使CDH1基因失活。使用针对Ezh2或Suz12的siRNA或表达显性阴性Ezh2突变体（H694L）的siRNA获得类似的结果(20)（参见补充材料中的图S1）。Suz12 siRNA转染HT-29 M6和稳定转染Snai1的RWP-1细胞后，CDH1 mRNA水平得到了类似的上调（数据未显示）。

蜗牛1蛋白也抑制PTEN基因的表达。因此，我们还分析了PRC2失活对该基因mRNA水平的影响。如图所示。​图3C，3C公司，SW-620细胞中的Suz12 siRNA也上调PTEN mRNA，表明PRC2对蜗牛1阻遏的需求不限于CDH1基因。

蜗牛1向CDH1启动子招募PRC2复合物。

通过ChIP分析，仅在对照ES细胞分化后检测到Cdh1启动子序列与Snail1和Suz12结合（图。​（图4A），4A级)当该基因的表达受到抑制时（图。​（图2）。2). 当我们测定Cdh1启动子组蛋白H3（K27me3-H3）中三甲基化K27的水平时，也观察到类似的结果，因为这种赖氨酸的甲基化是PRC2活性的结果。正如预期的那样，在Suz12-null细胞中未检测到Suz12与Cdh1启动子中H3中K27的三甲基化的关联。令人惊讶的是，在这些细胞中也没有检测到Snail1与Cdh1启动子结合，这表明Polycomb复合物的存在对于稳定启动子处的Snail1抑制复合物是必要的。

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图4。

Suz12与CDH1启动子的结合依赖于蜗牛1。（A） Suz12的胚胎尸体^+/−或Suz12^−/−来源于ES细胞，在无LIF的情况下连续2天形成悬液，并在第9天收集。通过ChIP分析在未分化（ES）和分化（9d EB）状态下测定CDH1启动子中Snail1和Suz12的结合以及K27me3的水平。结果显示重复进行的两个实验的平均值±SD。用ChIP法测定稳定转染Snai1-HA的HT-29 M6细胞中Snai1-HA和Suz12的IgG、免疫球蛋白G（B）结合以及CDH1启动子中K27me3的水平。结果表明，三次试验的平均值为±SD。继续，控制。

用细胞系进行的ChIP分析也证实Suz12对CDH1启动子的招募是依赖于Snail1的。如图所示。​图4B，4B类在稳定表达Snai1的HT-29 M6克隆中检测到Snail1和Suz12的结合以及CDH1启动子中K27me3-H3的水平，但在对照克隆中未检测到。

我们还分析了Suz12在CDH1启动子的占有率是否依赖于CDH1基因启动子中E盒的完整性。我们用野生型CDH1启动子或含有突变E盒的启动子（E1E2E3 CDH1基因启动子）转染稳定的RWP-1-Snai1细胞。进行ChIP分析以分析Snail1、Suz12或K27me3-H3与异位启动子的相关性。如图所示。​图5A，5A级当三个E盒突变阻止了蜗牛1的结合时，用Suz12或K27me3-H3免疫沉淀的CDH1启动子数量显著降低。

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图5：。

PRC2结合和CDH1启动子中的活性需要Snail1结合位点和Snail1的SNAG结构域的完整性。稳定转染Snai1（A）或Snai1-P2A突变（B）细胞的RWP-1瞬时转染外源性CDH1启动子，野生型（WT）或三个E盒突变的形式（E1E2E3-Mut）。两种启动子的转染效率相同。通过ChIP分析测定外源性CDH1启动子中Snai1-HA、Snai1-P2A-HA和Suz12的结合以及K27me3的水平。结果表明，两次试验的平均值为±SD，共进行了三次。IgG，免疫球蛋白G。

我们还确定了Snai1 P2A突变体（一种无法抑制转录的突变体）是否(1)，能够将PRC2复合物募集到CDH1启动子。如图所示。​图5B，5亿与野生型相比，Snai1-P2A突变体没有诱导Suz12与CDH1启动子结合。因此，与该启动子相关的K27me3-H3水平低于表达野生型Snai1的细胞（图。​（图5B5亿).

蜗牛1缺失影响CDH1启动子中Suz12结合和K27me3-H3水平。如图所示。​图6A，6A级SNAI1特异性siRNA不仅破坏了Snail1蛋白与SW-620细胞中CDH1启动子的结合，也破坏了Suz12的结合。正如预期的那样，在没有Snail1的情况下，CDH1启动子中K27me3-H3的存在也减少了。

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图6。

PRC2招募依赖于蜗牛1。按照材料和方法中的描述进行ChIP分析，免疫沉淀SW-620细胞的交联核提取物，感染逆转录病毒构建物产生SNA1特异性小发夹RNA（siSnail1）或GFP特异性siRNA（siGFP）作为对照，并用嘌呤霉素选择48小时，分析CDH1启动子（A）和PTEN启动子（B）中的Suz12和K27me3。结果表明，两次试验的平均值为±SD，共进行了三次。IgG，免疫球蛋白G。

我们还检查了Snail1基因敲除是否也会影响Suz12与PTEN启动子的结合。在SW-620细胞的启动子区域观察到蜗牛1和Suz12的关联以及K27me3-H3的水平（图。​（图6B）。6亿). 通过使用特定siRNA下调Snail1的表达降低了Suz12的关联性，从而降低了PTEN启动子处的K27me3-H3水平。我们还分析了其他Snail1靶基因，如Snail1和MUC1启动子，我们获得了相同的结果（未显示）。因此，蜗牛1对PRC2的招募并不局限于CDH1启动子。

我们非常感谢Salvador Aznar Benitah的SNAI1特异性siRNA和有益的讨论，以及Berta Alsina的建议。我们还感谢马尔塔·加里多和阿尔瓦罗·扬斯提供的技术援助。

这项工作得到了丹麦国家研究基金会和丹麦医学研究委员会对K.H.的资助，也得到了科学技术部（SAF2003-02324和SAF2006-00339）对a.G.H.的支持。部分支持来自卡洛斯三世研究所（RTICCC，C03710）和加泰罗尼亚政府（2005SGR00970）也很感激。N.H.和M.E是教育部博士前研究金的获得者。S.P.得到了教育部博士后奖学金的支持。V.D.得到了La Cierva合同的支持。