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.2008年8月；28(15):4772-81.
doi:10.1128/MCB.00323-08。 Epub 2008年6月2日。

多梳复合物2是蜗牛1转录因子抑制E-cadherin所必需的

尼古拉斯·赫兰兹 1, 迭戈·帕西尼, Víctor Míaz公司, 克拉拉·弗朗西, 阿兰萨·古铁雷斯, 纳塔莉亚·戴夫, 玛丽亚·埃斯克里娃, 英玛·埃尔南德斯·穆尼奥斯, 卢西亚诺·迪克罗斯, 克里斯蒂安·赫林, 安东尼奥·加西亚·德·埃雷罗斯, 桑德拉·佩罗
附属公司

多梳复合物2是蜗牛1转录因子抑制E-cadherin所必需的

尼科拉斯·埃尔兰兹等人。 分子细胞生物学. 2008年8月.

摘要

转录因子Snail1是E-cadherin（CDH1）基因表达的阻遏物，对触发上皮-间质转化至关重要。蜗牛1抑制CDH1，直接结合其启动子并诱导Zeb1阻遏物的合成。在本文中，我们证明了蜗牛1而不是Zeb1对CDH1的抑制依赖于多梳抑制复合物2（PRC2）的活性。PRC2组分之一Suz12的胚胎干细胞无效，显示Cdh1 mRNA水平高于对照胚胎干细胞。在肿瘤细胞中，PRC2活性的干扰阻止了蜗牛1下调CDH1并部分解除CDH1的能力。染色质免疫沉淀分析表明，Snail1增加了Suz12与CDH1启动子的结合以及组蛋白H3中赖氨酸27的三甲基化。此外，共免疫沉淀实验表明，蜗牛1与Suz12和Ezh2相互作用。总之，这些结果表明，Snail1将PRC2招募到CDH1启动子，并需要该复合物的活性来抑制E-cadherin的表达。

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数字

图1。
图1。
Suz12中E-cadherin的表达改变−/−E7.5胚胎。E7.5 Suz12的矢状截面+/−或Suz12−/−用抗E-cadherin（a和c）或蜗牛1（b和d）抗体对胚胎进行免疫染色。下部面板显示同一部分的放大倍数较高。放大倍数：上面板，×200；下面板，×400。还显示了面板c和d中下部图像的详细信息。mes，中胚层；ect，外胚层；末端，内胚层。
图2。
图2。
Suz12的E-cadherin表达模式发生改变−/−ES细胞。Suz12的胚胎尸体+/−或Suz12−/−在没有LIF的情况下，让ES细胞形成悬滴2天，并在指定的时间点收集。通过qRT-PCR测定E-cadherin（Cdh1）和Snail1（Snai1）mRNA水平。
图3。
图3。
PRC2下调影响肿瘤细胞系中Snail1对CDH1的抑制。（A） 将携带Suz12和Snail1特异siRNA的逆转录病毒与RWP-1细胞共感染或共转染Suz12与Zeb1的siRNA（siSuz12）后，通过qRT-PCR测定CDH1 mRNA水平。GFP的siRNA（siGFP）用作对照。转染后和RNA分离前用嘌呤霉素选择细胞48小时。图中显示了三次实验的平均值±标准偏差（SD），共三次。关于用Snail1获得的CDH1 RNA在对照细胞中的抑制作用，Snail1在siSuz12细胞中的降低作用是显著的P（P）值<0.01（用星号表示）。（B） RWP-1细胞中指定形式的CDH1启动子（野生型[WT]和突变型[E1E2E3 mut]）的活性通过pGL3-E-cad（−178/+92）CDH1基因启动子、pcDNA-3-Snail1或pcDNA-3-Zeb1在抗Suz12或GFP的siRNA存在下的瞬时转染来测定。显示了平均值±SD（三次试验，一式三份）。星号表示在siGFP和siSuz12细胞中CDH1启动子的阻遏值显著不同P（P）值<0.01。（C） SW-620细胞感染了Ezh2突变体（H649L）、对照质粒（pBabe）或含有Suz12、Ezh2（siEzh2）或GFP特异siRNA的逆转录病毒作为对照。如上所述，通过qRT-PCR分析测定CDH1和PTEN mRNA水平。该图显示了一式三份的五次实验的平均值±SD。用单个星号表示的差异是显著的P（P）值<0.01。
图4。
图4。
Suz12与CDH1启动子的结合依赖于蜗牛1。（A） Suz12的胚胎尸体+/−或Suz12−/−来源于ES细胞，在无LIF的情况下连续2天形成悬液，并在第9天收集。通过ChIP分析在未分化（ES）和分化（9d EB）状态下测定CDH1启动子中Snail1和Suz12的结合以及K27me3的水平。结果显示重复进行的两个实验的平均值±SD。用ChIP法测定稳定转染Snai1-HA的HT-29 M6细胞中Snai1-HA和Suz12的IgG、免疫球蛋白G（B）结合以及CDH1启动子中K27me3的水平。结果表明，三次试验的平均值为±SD。继续，控制。
图5：。
图5：。
PRC2结合和CDH1启动子中的活性需要Snail1结合位点和Snail1的SNAG结构域的完整性。稳定转染Snai1（A）或Snai1-P2A突变（B）细胞的RWP-1瞬时转染外源性CDH1启动子，野生型（WT）或三个E盒突变的形式（E1E2E3-Mut）。两种启动子的转染效率相同。通过ChIP分析测定外源性CDH1启动子中Snai1-HA、Snai1-P2A-HA和Suz12的结合以及K27me3的水平。结果表明，两次试验的平均值为±SD，共进行了三次。IgG，免疫球蛋白G。
图6。
图6。
PRC2招募依赖于蜗牛1。按照材料和方法中的描述进行ChIP分析，免疫沉淀SW-620细胞的交联核提取物，感染逆转录病毒构建物产生SNA1特异性小发夹RNA（siSnail1）或GFP特异性siRNA（siGFP）作为对照，并用嘌呤霉素选择48小时，分析CDH1启动子（A）和PTEN启动子（B）中的Suz12和K27me3。结果表明，两次试验的平均值为±SD，共进行了三次。IgG，免疫球蛋白G。
图7。
图7。
PRC2组分和蜗牛1在体内相互作用。将稳定转染Snai1-HA的（A至C）RWP-1细胞（A）和HT-29 M6（B和C）进行裂解，并用抗Suz12（A和B）或抗HA（C）抗体进行免疫沉淀（IP）。免疫复合物通过Western blotting（WB）分析，使用HA（A和B）、Suz12（A和B）或Ezh2（C）抗体。IgG、免疫球蛋白G（D）SW-620细胞被裂解，并用针对蜗牛1的单克隆抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀蜗牛1中Ezh2的存在通过Western blotting（D）进行分析。（E） 用抗Suz12抗体免疫沉淀稳定转染Snai1-HA或Snai1-P2A突变体的RWP-1细胞。通过Western blotting分析是否存在Snail1-HA和Snail1-P2A-HA突变。以稳定转染pcDNA-3的RWP-1细胞作为对照（续）。
图8。
图8。
蜗牛1和Suz12在小鼠胚胎的间充质细胞中共存。通过对Snail1和Suz12的免疫组织化学分析，对从小鼠胚胎获得的矢状面切片进行分析。（A） E7.5胚胎的矢状切面。放大倍数：上面板，×200；下面板，×400。mes，中胚层；ect，外胚层；末端，内胚层。（B） 公式9.5。放大倍数：上面板，×200；下面板，×400。nt，神经管；nl，神经腔。（C） 图15。放大倍数，×400。dc，皮肤冷凝物。（D） 图18。放大倍数，×400。dp，毛乳头；b、 灯泡。
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