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英国癌症杂志。2002年9月23日；87(7): 805–812.
2002年9月23日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.bjc.6600547
预防性维修识别码：项目经理2364258
PMID：12232767

2-脱氧评估-D类-葡萄糖作为化疗药物的细胞死亡机制

右左后,1,2 F W张,1和D Gius公司三
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摘要

营养缺乏已被证明会导致癌细胞死亡。为了利用营养剥夺作为抗癌治疗，我们研究了抗代谢产物2-脱氧-D-葡萄糖对乳腺癌细胞的影响在体外该化合物已被证明能抑制葡萄糖代谢。用2-脱氧-D-葡萄糖治疗人类乳腺癌细胞株会导致细胞生长以剂量依赖性的方式停止。2-脱氧-D-葡萄糖治疗可降低3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物转化试验测定的细胞存活率和克隆形成存活率，表明2-脱氧D-葡萄糖可导致乳腺癌细胞死亡。通过诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性和聚ADP-核糖聚合酶的裂解，发现2-脱氧-D-葡萄糖诱导的细胞死亡是由于细胞凋亡。通过Western blot分析测定，经2-脱氧-D-葡萄糖处理的乳腺癌细胞表达更高水平的谷氨酸转运蛋白，并且与未经处理的乳腺肿瘤细胞相比，其葡萄糖摄取增加。从这些结果中，我们得出结论，2-脱氧-D-葡萄糖治疗通过激活凋亡途径导致人类乳腺癌细胞株死亡。我们的数据表明，经2-脱氧-D-葡萄糖治疗的乳腺癌细胞通过最初表达高水平的葡萄糖转运蛋白而加速自身的死亡，葡萄糖转运蛋白允许增加2-脱氧D-葡萄糖的摄取，并随后诱导细胞死亡。这些数据支持通过诸如2-脱氧-D-葡萄糖的药剂将葡萄糖代谢作为化疗干预的位点的靶向。

英国癌症杂志(2002)87, 805–812. 数字对象标识：10.1038/sj.bjc.6600547 网址：www.bjcancer.com

© 2002英国癌症研究

关键词：细胞凋亡、乳腺癌、葡萄糖代谢、肿瘤代谢

肿瘤细胞依赖糖酵解来支持其代谢需求。即使在有氧条件下，肿瘤细胞仍然依赖糖酵解而非氧化磷酸化（Warburg效应），从而产生高糖需求以产生能量和支持代谢功能(沃堡，1956年;韦伯，1977年). 含有癌基因或癌病毒的培养细胞发生恶性转化，导致进入细胞的葡萄糖量绝对增加。这是通过谷氨酸1葡萄糖转运蛋白基因的转录激活介导的，导致葡萄糖转运蛋白mRNA和蛋白质水平的增加(伯恩鲍姆等, 1987;传单等, 1987). 与正常组织相比，许多人类癌症表达的谷氨酸1葡萄糖转运蛋白水平升高(山本等, 1990;尤尼斯等, 1996). 在人类乳腺癌中，高谷氨酸1表达往往与具有高增殖活性和组织学评分的肿瘤相关(Brown和Wahl，1993年;尤尼斯等, 1995). 这些发现导致了一种假设，即葡萄糖摄取的增加可能是维持恶性细胞生长和合成活性以及抑制细胞凋亡的重要调节点(格雷纳等, 1994;菅直人等, 1994;宾利（Bentley）等, 2001;范德海登等, 2001).

葡萄糖剥夺的实验条件已被证明在许多转化细胞系中引起凋亡(垫片等, 1998). 例如，已发现白细胞介素3依赖性淋巴瘤细胞系和MCF7/ADR乳腺癌细胞系中的葡萄糖剥夺可导致细胞凋亡(菅直人等, 1994;李等, 1997). 葡萄糖剥夺诱导的信号传导可能涉及多种相关机制，包括激酶的激活（丝裂原活化蛋白激酶、c-Jun N末端激酶、Lyn激酶）(加洛福罗等, 1996;古普塔等, 1997;线路接口单元等, 1997;李等, 1998)，改变细胞的氧化还原状态(布莱克本等, 1999;斯皮茨等, 2000)，或产生自由基(野村证券等, 1999).

葡萄糖剥夺可以用葡萄糖拮抗剂来模拟。葡萄糖类似物已被发现能显著抑制癌细胞中的葡萄糖代谢在体外和体内(球等, 1957;拉斯洛等, 1958;卡普兰等，1990年). 在已研究的许多葡萄糖类似物中，2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）已被证明在抑制葡萄糖代谢和ATP生成方面非常有效(拉斯洛等, 1960;耆那教等, 1985;卡普兰等，1990年). 2DG是葡萄糖的一种结构类似物，通过氢取代羟基，第二个碳原子上的葡萄糖有所不同(图1A)并通过代谢捕捉在癌细胞中选择性积累(加拉赫等, 1978)由于摄入增加(瓦基等, 1998;Rivenzon Segal公司等, 2000)细胞内己糖激酶或磷酸化活性较高(卡普兰等，1990年;阿罗拉等, 1992;瓦基等, 1997;阿洛伊等, 1999)和低细胞内磷酸酶水平(科恩和诺顿，1987年;纳尔逊等, 1996) (图1B). 2DG引起的细胞杀伤在几个细胞系中都有描述(耆那教等, 1985;卡普兰等，1990年;野村证券等, 1999;让开等, 2001).

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(A类)葡萄糖和2-脱氧-D-葡萄糖的结构比较。2DG和葡萄糖在第二个碳上不同。(B类)2-DG动作示意图。2DG通过葡萄糖转运蛋白进入细胞，并被己糖激酶磷酸化。由于细胞内磷酸酶2-DG-PO水平较低4被困在牢房里。二维订单4无法进行进一步的新陈代谢。细胞内高水平的2-DG-6-PO4引起己糖激酶的变构和竞争性抑制。这会抑制葡萄糖代谢。

为了利用癌细胞的葡萄糖代谢作为治疗靶点，我们研究了2DG在人类乳腺癌细胞中的作用。在所述的一系列实验中，我们证明2DG抑制乳腺癌细胞生长、克隆形成，并通过凋亡导致细胞死亡。经2DG治疗的乳腺癌细胞表达更高水平的谷氨酸转运蛋白，并表现出对葡萄糖的摄取增加，这表明细胞可能会因2DG治疗而增加其死亡。这些结果支持将葡萄糖代谢作为使用2DG等化合物进行化疗干预的靶点，因为转运蛋白表达和葡萄糖摄取增加的初始反应会导致细胞加速死亡。

材料和方法

细胞培养

细胞系SkBr3、MCF-7、BT474和MDA/MB468均来自ATCC，在添加10%热灭活胎牛血清、青霉素（100单位ml）的RPMI-1640培养基中生长−1)链霉素（100μg ml−1)和两性霉素B（0.25μg ml−1)在5%CO的增湿大气中237°C下95%的空气。在大多数实验中，细胞接种在2.5×106 使用前2天，每个直径为10厘米的组织培养板上的细胞数。

克隆存活试验

在4000个细胞处进行细胞培养−1在96-well板中，允许24小时附着，随后暴露4小时至2DG。以每60mm直径培养皿400个细胞的速度对细胞进行胰蛋白酶消化、计数和重新接种，并在37°C的湿润培养箱中不受干扰地培养14天。用甲醇：乙酸（3:1）固定并用0.25%结晶紫染色后计数菌落。含有25个以上细胞的菌落被评为阳性。每个数据点一式三份。将数据归一化为假处理对照细胞的电镀效率。假处理细胞的贴壁效率为38-50%，计算方法为观察到的菌落数除以贴壁的胰蛋白酶细胞数。误差条表示值的范围。每个数据点代表三个样本的平均值。

测量[14C] 3-O-甲基-葡萄糖（3-O-MG）摄取

实验前一到两天，在104 细胞厘米−2在6孔板中（直径为35mm的孔）。用8m培养细胞M（M）2DG 4小时，用温热PBS和950μl温热吸收介质（128 m）冲洗M（M）氯化钠，4.7米M（M）KCl，1.25米M（M）硫酸镁4，10米M（M）不2人事军官4，1.25米M（M）氯化钙2pH值为7.4）。如有指示，50μM（M）将细胞松弛素B添加到热吸收培养基中(哈姆拉希安等, 1999). 将平板在37°C下培养6分钟，然后再培养50μl[三H] 添加3-O-甲基葡萄糖（1 mM（M）3-O-甲基葡萄糖，20μCi ml−1第页，共页[14C] 3-O-甲基葡萄糖）。孵化持续指定时间。通过添加冷PBS停止反应。用冷PBS洗涤细胞五次，并用1m溶解细胞M（M）氢氧化钠。每个样品中取10微升用于蛋白质浓度分析（Bio-Rad DC蛋白质分析）。将闪烁液添加到样品的剩余部分中，以进行闪烁计数。葡萄糖摄取量按每μg蛋白质的μ摩尔摄取量计算。3-O-甲基-D-[14C] 葡萄糖（56 mCi mmol−1)购自Amersham Corp。

MTT分析

细胞（每孔2500个）在96周的培养板中一式四份。细胞粘附（24–48小时）后，添加含有2DG或对照培养基的实验培养基，并在37°C下继续培养指定时间。MTT（0.5毫克毫升−1在PBS中）添加到每个孔中，并在37°C下继续培养4小时。然后丢弃培养基，并向每个孔中添加200μl二甲基亚砜，以溶解有色的formazan产品。在摇床上搅拌镀液5分钟后，在550 nm的波长下，在扫描微量分光光度计平板读取器（Bio-Rad）上读取吸光度。所有数据都是相对于同一实验中未经处理的细胞表达的，这些实验标准化为100%(卡迈克尔等, 1987).

谷氨酸1蛋白Western blot分析

细胞在10岁时被培养4 单元格厘米−2并在2DG存在下生长，生长时间如图所示。在每个时间点，收集细胞，并通过添加HER缓冲液（250 mM（M）蔗糖，10米M（M）HEPES，1米M（M）乙二胺四乙酸（pH 8.0））。将溶液通过21g针头3-4次，使DNA片段化。使用Bio-Rad DC蛋白质测定法测定蛋白质浓度。样品与2×莱姆利裂解缓冲液（1×=2.4）混合M（M）甘油，0.14M（M）Tris，pH 6.8，0.21M（M）十二烷基硫酸钠，1.28M（M）巯基乙醇，0.3米M（M）溴酚蓝）。蛋白质（50μg）添加在10%分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：双丙烯酰胺20:1）上。凝胶在25 m内以200 V的电压运行M（M）特里斯，192米M（M）将甘氨酸、0.1%十二烷基硫酸钠和分解的蛋白质在4°C 22 V、25 m的温度下转移至硝化纤维素过夜M（M）特里斯，192米M（M）甘氨酸，20%v v−1甲醇缓冲液。为了阻止非特异性位点，过滤器与Blotto（5%脱脂奶粉，0.02%叠氮化钠，0.01%PBS中的消泡剂A）在室温下培养1小时。在室温下孵育1小时，用抗谷氨酸1多克隆抗体对斑点进行检测。该抗体是针对稀释为1:1000的C末端13个氨基酸（Mike Meckler博士赠送）生成的，或从DAKO购买(马歇尔等, 1993). 用PBS清洗膜，然后与二级抗体辣根过氧化物酶结合的驴抗兔IgG（稀释1:500）孵育1–2 h。在Blotto中冲洗膜，并使用增强化学发光法（ECL，Amersham Pharmacia Biotech）显示结合量。胶片曝光时间从10秒到1分钟不等。用0.5%的蓬松（Ponceau）在5%的TCA中对印迹进行染色，以确认抗体反应前蛋白质的均匀转移。如图所示，膜在100 m内被剥离M（M）β-巯基乙醇，2%十二烷基硫酸钠，62.5 mM（M）Tris-HCl pH 6.8，55°C，30分钟，并在室温下用抗肌动蛋白抗体（从Calbiochem中获得的1:40稀释）再进行1小时的保护。如前所述进行二级抗体培养和培养。

PARP蛋白印迹分析

如上所述生长细胞，并用含有62.5m的缓冲液裂解M（M）Tris pH 6.8，8M（M）去离子尿素、10%甘油、2%十二烷基硫酸钠和蛋白酶抑制剂储备溶液（最终浓度：1μg ml−1亮肽，1μg ml−1安替比林，1μg ml−1苯甲脒、胰蛋白酶抑制剂5μg ml−1，1微克毫升−1凝乳抑素，1μg ml−1肽抑制素A，87μg/ml−1PMSF）。对样品进行超声波处理20秒，以使DNA片段化。将含有50μg蛋白质的样品加热至65°C，并在7.5%凝胶上分离蛋白质。如上所述，将蛋白质转移到硝化纤维。在用Blotto封闭非特异性结合位点后，用1:5000（Biomol）稀释2.5小时的抗PARP抗体在室温下探测过滤器。用PBS清洗过滤器，然后在室温下用1:2000稀释的辣根过氧化物酶结合的二级抗体抗鼠Ig孵育1小时。如上所述，使用ECL测定抗体结合。阳性对照组为经2μM（M）staurosporine作用6h。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3测定

使用ApoAlert Caspase-3检测试剂盒（Clontech）测定Caspase 3活性。2×106 每个时间点使用细胞。在指定的处理后，通过添加50μl提供的裂解缓冲液对细胞进行裂解，并在冰上孵育10分钟。通过在14000转/分离心3分钟，去除不溶性碎片。50微升上清液与50微升提供的反应缓冲液混合。如有指示，每1m 0.5–1μlM（M）将DEVD-Fmk抑制剂与指示样品在37°C下预培养30分钟。5微升1 m底物M（M）将DEVD-pNA添加到每个样品中，并允许反应在37°C下运行1 h。将无底物培养的样品作为阴性对照。在405 nm处测量吸光度，并使用655 nm作为内部参考。

结果

2DG对细胞生长、克隆存活和生存能力的影响

葡萄糖缺乏已被证明会导致乳腺癌细胞株的凋亡(李等, 1997). 确定使用非代谢性葡萄糖类似物2DG是否可以获得类似的结果，2DG已知可以抑制葡萄糖代谢(灯芯等, 1957)在不同浓度的2DG存在下培养了四种人乳腺癌细胞系MCF-7、SkBr3、BT549和MDA/MB468。其中两种细胞系的代表性生长曲线如所示图2在第0天将2DG以4-12 m的浓度添加到细胞中M（M）如中所示图2A8 m处理后，MDA/MB468细胞的生长被完全抑制M（M）二维图形。4m处理M（M）2DG导致大约30%的细胞生长抑制。在所测试的乳腺癌细胞系中，SkBr3对2DG的生长抑制作用最敏感。细胞生长在4 m处被完全抑制M（M）2DG公司(图2B). 这表示培养基中2DG与葡萄糖的比率为1:4.25。这与以前的细胞培养研究一致，其中1份2DG与3份葡萄糖的比例抑制了约50%的糖酵解(拉斯洛等, 1960). 这些实验表明，2DG抑制乳腺癌细胞生长，这可能是由于生长停滞或细胞死亡，并且对抑制的基本位点的竞争有利于2DG。

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2-DG对乳腺癌细胞株生长的影响。SkBr3和MDA/MB468乳腺癌细胞系在没有或存在不同浓度2DG的情况下生长。在第0天添加2DG，并且在实验期间未改变培养基。每天测定细胞数。每个点代表三份培养物。

以前有报道称，正常细胞在缺乏营养或葡萄糖的情况下会退出细胞周期，而不是经历细胞死亡(垫片等, 1998). 为了确定2DG治疗是否导致细胞死亡或退出细胞周期，进行了克隆形成存活和MTT分析。在克隆形成存活实验中，用2DG处理SkBr3细胞4小时，在正常培养基中以低密度重新培养，并在14天后测定克隆形成。如中所示图3，2DG治疗后克隆存活率呈剂量依赖性下降。4m处理M（M）与未经处理的对照细胞相比，2DG处理4小时后，14天时细胞存活率降低50%。这些结果表明，2DG处理导致细胞死亡，表现为克隆原性降低，而不是从细胞周期中退出。

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2DG治疗后克隆存活率。用不同浓度的2DG处理SkBr3细胞4h，然后在低密度下进行再植。在电镀后14天对菌落进行计数，那些含有25个或更多细胞的菌落得分为阳性。每个点代表三个重复的培养基。

MTT被活细胞还原为有色的甲胎素产品，以前发现与克隆形成存活相关，并已用于化学敏感性测试(卡迈克尔等, 1987). 为了确定MTT的减少是否与克隆形成存活率平行，用不同浓度的2DG处理乳腺癌细胞株，并测量MTT的分光光度转换。如中所示图4,​，二维图2DG处理三种乳腺癌细胞株4小时后，在550 nm处的吸收呈剂量依赖性降低，表明MTT对其甲氧基氮产品的还原降低。1m处理M（M）2DG使SkBr3细胞的MTT降低约40%，MCF7细胞的MTT降低约25%，MDA/MB468细胞系无变化。当SkBr3细胞用3μM（M）2DG持续24小时，并允许恢复6小时，观察到MTT减少略有增加（50%与61%，数据未显示）。正如在细胞生长实验中观察到的那样，在本实验中，SkBr3细胞系似乎比MCF-7和MBA/MB468乳腺癌细胞系对2DG的作用更敏感。此外，这些结果与克隆形成存活试验的结果相一致，表明MTT转化与2DG处理细胞的存活相关。

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2DG处理后MTT转化率。将SkBr3、MDA/MB468和MCF7细胞与所示浓度的2DG孵育4 h。添加MTT，以分光光度法测定还原甲素产物的量。结果以对照未处理细胞的百分比表示。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性和经2DG处理的PARP裂解

克隆形成存活和MTT分析包括所有类型的细胞死亡，包括坏死和凋亡。凋亡细胞死亡是一个活跃的死亡过程，可以通过测量半胱氨酸蛋白酶的激活和关键酶的断裂来推断。为了确定2DG引起的细胞死亡是否与凋亡有关，对细胞进行了caspase 3活性和PARP裂解检测。Caspase 3是一种在细胞凋亡级联过程中被激活的必需蛋白酶(总额等, 1999). 采用基于半胱氨酸天冬氨酸脱氢酶3底物DEVD-pNA裂解的分光光度法测定2DG处理后SkBr3细胞中半胱氨酸蛋白酶3的活性。如中所示图52DG处理SkBr3细胞导致caspase 3活性随时间增加。用16m剂量处理后，半胱天冬酶3活性比对照细胞增加了三倍M（M）2DG作用6小时。通过与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂DEVD-FMK预培养，该活性受到抑制。

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2DG处理的SkBr3细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3激活。用16 mM（M）根据制造商的说明，采集细胞并使用分光光度法测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性。在16 m培养的细胞中添加底物前30 min添加caspase 3抑制剂DEVD-FMKM（M）2DG持续6小时。每个点代表三份培养物的平均值。对照细胞仅在培养基中培养6小时。

聚ADP-核糖聚合酶（PARP）参与细胞凋亡过程中的DNA切割。在细胞凋亡过程中，116 kDa PARP酶被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解为89 kDa形式，不再受到DNA缺口的刺激(沙阿等, 1995). 用2DG处理SkBr3细胞后测定PARP的裂解。在本实验中，用12 mM（M）2DG持续6小时或2μM（M）葡萄孢菌素。Staurosporine以前被证明是一种有效的凋亡诱导剂，并被用作阳性对照(塔法尼等, 2001). 通过使用PARP单克隆抗体的蛋白质印迹分析来确定PARP的裂解。如中所示图6，对照细胞检测不到PARP裂解产物的数量（通道1）。相反，含有2DG或staurosporine的SkBr3细胞产生89kDa PARP裂解产物。用2DG处理的细胞有大约20%的蛋白质裂解（第3道）。此外，2DG处理SkBr3细胞会导致DNA断裂（未公开数据）。这些结果以及caspase 3活性实验的结果表明，2DG在SkBr3细胞中引起的细胞死亡部分是通过凋亡发生的。

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用2-DG处理的SkBr3细胞对PARP的激活。用12 mM（M）2DG或2μM（M）staurosporine（+对照）。使用PARP单克隆抗体进行Western blot分析。显示正常（未分离）和PARP裂解产物。

2DG治疗对谷氨酸转运体表达和葡萄糖摄取的影响

Glut1葡萄糖转运蛋白是一种完整的膜糖蛋白，负责乳腺癌细胞的组成型葡萄糖摄取。肿瘤细胞中谷氨酸1蛋白表达增加，据报道在细胞应激和葡萄糖缺乏时增加(基茨曼等, 1993;布莱克本等, 1999). 谷氨酸1在第一外周环中包含一个N-糖基化共识序列。由于该位点的非均一糖基化，转运蛋白在SDS-PAGE凝胶上以宽带形式迁移(马歇尔等, 1993). 先前的研究表明，葡萄糖剥夺改变了谷氨酸1的糖基化模式，导致转运蛋白分子量较低，以大约37kDa的蛋白质形式迁移(基茨曼等, 1993). 这种转运体物种经过适当的运输到质膜(麦克马洪和弗罗斯特，1995年;麦克马洪等, 2000). 为了确定2DG对谷氨酸1转运体水平和糖基化模式的影响，在用8 mM（M）2DG持续48或72小时，并使用针对谷氨酸1的13氨基酸C末端片段制备的兔多克隆抗体通过Western blot分析测定谷氨酸1表达(马歇尔等, 1993). 全糖基化谷氨酸1以约47kDa的宽带迁移。这可以在中看到图7，车道1和3。显示高谷氨酸转运体表达的对照裂解物是从人类胎盘（第1通道）和从爪蟾注射人谷氨酸1表达载体的卵母细胞（第3通道）(卡拉扬诺波洛斯等, 2000). 通道2代表从假注射中分离的蛋白质爪蟾卵母细胞。SkBr3细胞用0或8 m培养M（M）2DG 48或72小时，并制备蛋白质提取物。如通道5和7所示，2DG处理导致谷蛋白1的低分子量糖类出现，其以37-kDa蛋白的形式迁移。这与从细胞中分离的蛋白质形成对比，这些细胞未与含有极低水平谷氨酸1蛋白的2DG孵育(图7，车道4和6）。此外，带的强度更大，反映了较高水平的谷氨酸1蛋白。用抗肌动蛋白抗体探测的同一个印迹显示，每个样品中肌动蛋白的含量相似。该实验表明，对SkBr3细胞进行2DG处理后，谷氨酸1蛋白和低分子量蛋白的数量增加，这可能是糖基化模式改变的结果。

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经2-DG治疗的乳腺癌细胞株中谷氨酸-1转运蛋白水平。用2DG处理SkBr3乳腺癌细胞48或72小时，8 mM（M）2DG（8）或不带2DG（0）。分离蛋白质，在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离大小。使用多克隆抗谷氨酸-1抗体进行Western blot。阳性对照是从人胎盘分离的蛋白质和从注射的谷氨酸1分离的膜非洲爪蟾卵母细胞（+对照）。假注射卵母细胞作为阴性对照（阴性对照）。显示谷蛋白1。分子量标记被标记。去除谷氨酸1抗体后，蛋白印迹与抗肌动蛋白抗体反应（下面板）。

为了确定2DG处理后葡萄糖摄取是增加还是减少，用8 mM（M）使用非代谢性葡萄糖类似物3-O-甲基葡萄糖（3-O-MG）2DG 4小时。3-O-MG未被细胞明显磷酸化，并在细胞外和细胞内空间之间达到平衡。细胞松弛素B抑制谷氨酸转运体对3-O-MG的特异性摄取(哈姆拉希安等, 1999). 如所示图8,​，3-O-MG型三-2DG处理细胞的O-MG摄取量是对照细胞的三倍。用细胞松弛素B预处理可抑制2DG治疗后观察到的3-O-MG摄取增加。该数据表明，2DG治疗乳腺癌细胞会导致葡萄糖摄取增加，这可能是由于谷氨酸1蛋白水平升高所致。

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经2-DG处理的SkBr3细胞的葡萄糖摄取。SkBr3细胞用8mM（M）2-DG和[14C] 测量3-O-甲基葡萄糖摄取。细胞松弛素B（50μM（M）)与放射性葡萄糖同时添加。

讨论

乳腺癌表现出葡萄糖摄取率增加，并表达高水平的葡萄糖转运蛋白(沃尔等, 1991;Brown和Wahl，1993年;尤尼斯等, 1995). 最近，据报道，葡萄糖剥夺会导致乳腺癌细胞凋亡(李等, 1997). 这些观察结果使我们假设，非代谢性葡萄糖类似物对葡萄糖代谢的干扰会导致乳腺癌细胞凋亡。先前的研究表明，不可代谢的葡萄糖类似物2DG对糖酵解的干扰可以通过干扰糖酵解导致细胞杀伤(卡普兰等，1990年;野村证券等, 1999;让开等, 2001). 本文的实验结果扩展了先前的观察结果，并通过证明2DG诱导的葡萄糖剥夺导致乳腺癌细胞系中细胞生长停止、克隆形成性降低和凋亡，证实了我们的假设。此外，经2DG处理的乳腺癌细胞表达更高水平的谷氨酸转运体，并显示氧化应激导致葡萄糖摄取增加。因此，由于应激细胞加速葡萄糖摄取的初始反应，2DG似乎是导致乳腺癌细胞死亡的有效药物。

据推测，葡萄糖摄取增加可能是维持恶性细胞生长和合成活性以及抑制凋亡的重要调节点(格雷纳等, 1994;菅直人等, 1994). 例如，c-Myc转化的大鼠成纤维细胞通过反激活上调葡萄糖转运和糖酵解基因表达(奥斯萨斯等, 2000). 这些细胞在停糖后会发生凋亡(垫片等, 1998). 在正常细胞中，生长受外部生长信号和营养支持的调节(Rathmell公司等, 2000;范德海登等, 2001). 相反，癌细胞对大多数外部生长信号失去了反应性，因此，以葡萄糖形式提供的营养物质可能在维持癌细胞生存能力方面发挥着独特的作用。因此，正常细胞和转化细胞以相反的方式对营养物质消耗或葡萄糖剥夺作出反应。正常细胞通过增加葡萄糖转运蛋白的表达或修饰进行补偿，而转化细胞则通过葡萄糖剥夺受到应激，导致一系列应激相关基因的表达，随后细胞死亡。在许多正常细胞类型中，葡萄糖缺乏导致葡萄糖转运的最大速度增加(基茨曼等, 1993). 这被归因于几种机制之一；转运体从细胞内小室向质膜的移位(哈斯佩尔等, 1991)谷蛋白1转运体糖基化模式的改变与蛋白质周转率的降低(麦克马洪和弗罗斯特，1995年)或通过增加m RNA和蛋白质的合成(里德等, 1990;冯德克朗等, 2000). 例如，前脂肪细胞系通过增加转运体表达对葡萄糖饥饿作出反应，这反映在谷氨酸1转运体mRNA和蛋白水平的升高(里德等, 1990). 3T3细胞通过将天然谷氨酸转运体转化为不完全糖基化形式，对葡萄糖剥夺作出反应，同时将基础转运增加4.5倍(里德等, 1990;麦克马洪和弗罗斯特，1995年). 在非转化细胞系中，长时间的葡萄糖剥夺会导致G细胞周期阻滞0/G公司1，这是可逆的(垫片等, 1998). 相反，许多转化细胞系最初通过表达一系列应激相关基因对葡萄糖缺乏作出反应，随后发生凋亡(Lee和Corry，1998年). 例如，在糖剥夺早期，MCF7/Adr细胞Lyn和c-Jun激酶水平增加，bFGF和c-Myc mRNA表达增加(加洛福罗等, 1996;古普塔等, 1997;线路接口单元等, 1997;李等, 1998). 这些结果支持了这样的假设，即癌细胞对葡萄糖剥夺特别敏感，葡萄糖剥夺会导致细胞应激和随后的细胞毒性。

葡萄糖缺乏可以用葡萄糖拮抗剂模拟。葡萄糖类似物已被发现能显著抑制癌细胞中的葡萄糖代谢在体外以及体内(球等, 1957;拉斯洛等, 1960). 在已经研究过的许多葡萄糖类似物中，2DG似乎是抑制糖酵解最有效的(拉斯洛等, 1958). 2DG是葡萄糖的一种结构类似物，在第二个碳原子上因氢取代羟基而有所不同，似乎选择性地积聚在癌细胞中(图1). 2DG通过葡萄糖转运蛋白扩散到细胞。一旦细胞内，2DG被己糖激酶磷酸化为2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸（2-DG-6-P）。2-DG-6-P不是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或磷酸己异构酶的底物(灯芯等, 1957). 因此，一旦形成，2-DG-6-P就不会进一步代谢，并且会在细胞中积累，直到被磷酸化酶去磷酸化(加拉赫等, 1978;科恩和诺顿，1987年;纳尔逊等, 1996). 在恶性细胞中，2DG的特异性积累归因于多种机制；葡萄糖转运蛋白表达增加导致摄取增加(瓦基等, 1998)己糖激酶活性或磷酸化活性增加，导致陷阱(卡普兰等，1990年;阿洛伊等, 1999)磷酸化酶活性低，导致积累(科恩和诺顿，1987年;纳尔逊等, 1996). 2-DG抑制糖酵解被认为是通过抑制关键糖酵酵解酶如磷酸己异构酶来实现的(霍顿等, 1982)以及高能化合物的消耗。2-DG-6-P可能是一个强大的P我导致细胞内储存耗尽的陷阱。低P我迅速导致ATP去磷酸化，同时AMP也随之增加。高AMP和低P我刺激AMP脱氨酶，将AMP转化为肌苷，导致腺嘌呤总量减少。低P我ATP使己糖激酶更容易受到G-6-P的抑制，这种抑制可能通过反馈抑制和/或变构抑制发生(阿德哈利等, 1996,1999).

己糖激酶可能是2DG诱导细胞凋亡的关键调节因子。己糖激酶是糖酵解反应的第一种酶葡萄糖+MgATP->葡萄糖-6-PO4+使葡萄糖进行代谢的MgADP。己糖激酶对葡萄糖的磷酸化确保葡萄糖通过促进沿下坡浓度梯度扩散进入细胞。在哺乳动物组织中发现了己糖激酶的四种同工酶，它们受到葡萄糖-6-PO产物的变构抑制4(威尔逊，1997年). II型己糖激酶是转化细胞中过度表达的亚型，其葡萄糖Km最高(帕里和佩德森，1983年;伦佩尔等, 1996). 许多恶性细胞系中己糖激酶II水平显著升高，与正常组织不同，50-80%的己糖激酶与线粒体部分结合，在线粒体部分，己糖激酶被认为优先获得线粒体内生成的ATP，并对葡萄糖-6-PO更具抗药性4抑制(Arora和Pedersen，1988年;阿罗拉等, 1992). 此外，己糖激酶形成拟议的通透性转换孔的一个组成部分，该孔参与线粒体在凋亡信号后的去极化(总额等, 1999). 最近发表的数据支持己糖激酶活性在Akt介导的细胞凋亡预防中的作用(戈特洛布等, 2001). 因此，癌细胞中表达的己糖激酶可能对2DG具有独特的敏感性，2DG可能通过其作为通透性过渡孔复合体的成员的作用对凋亡信号通路产生直接影响。

葡萄糖剥夺或2DG触发凋亡的相关机制可能是ATP耗竭后细胞能量状态失衡引起的应激相关信号的诱导。避免细胞凋亡的一种方法是保持有利的能量平衡。如果后者低于某一关键点，则通过表达应激相关基因来执行先前存在的凋亡程序(菅直人等, 1994). 先前的研究表明，2DG可抑制15-40%的葡萄糖使用率和糖酵解癌细胞株，导致近40%的受试细胞株的ATP水平降低(卡普兰等, 1991;德瓦尔卡纳特等, 2001). 由于氧化应激，葡萄糖剥夺导致MAP激酶途径激活(李等, 1998;布莱克本等, 1999;斯皮茨等, 2000). Bcl-2的过表达抑制了该途径，据报道，Bcl-2通过抗氧化途径抑制涉及线粒体的凋亡活性(霍肯贝里等, 1993;钟等, 1993;李等, 1997;Lee和Corry，1998年;垫片等, 1998). 这将支持在葡萄糖剥夺或2DG治疗诱导细胞凋亡中改变细胞能量平衡的作用。

在本报告中，我们提供的数据表明，2DG治疗乳腺癌细胞会导致细胞死亡，而细胞死亡部分是通过凋亡发生的。对四种乳腺癌细胞株进行了测试，它们对2DG的细胞毒性作用表现出不同的敏感性。SkBr3细胞对2DG的作用最为敏感，在浓度为4m时，克隆形成性降低50%M（M）2克。以前曾报道过2DG诱导细胞毒性的变异性，并与多药耐药表型相关(卡普兰等, 1991). 然而，2DG诱导细胞毒性的变化可能与摄取和处理的复杂性或促凋亡或抗凋亡蛋白的水平有关(阿蒙森等, 2000). 我们进一步证明，2DG导致细胞死亡，而不是通过克隆形成存活退出细胞周期。如capase 3和PARP激活所示，2DG诱导细胞死亡的机制似乎是凋亡。与克隆形成存活率相比，SkBr3细胞需要稍高浓度的2DG才能观察到大量的凋亡。这与2DG通过细胞凋亡以外的方法导致细胞死亡（如坏死）是一致的(斯佩兰迪奥等, 2000;Tannock和Lee，2001年). 葡萄糖剥夺导致葡萄糖摄取增加和谷氨酸转运体表达增加(费希尔和弗罗斯特，1996年). 在这些条件下，合成了一种不完全糖基化的谷氨酸1，它作为37kDa蛋白质迁移(里德等, 1990;基茨曼等, 1993;麦克马洪等, 2000). 我们的实验表明，用2DG治疗乳腺癌细胞也有类似的反应。乳腺癌细胞经2DG治疗后，葡萄糖摄取增加，谷蛋白1葡萄糖转运蛋白表达增加。检测到一种分子量较低的谷氨酸1蛋白，它可能代表一种不完全糖基化形式。根据我们的结果，我们假设，作为对2DG的初始反应，经2DG治疗的乳腺癌细胞会因葡萄糖转运增加而加速自身死亡。

2DG的两个特性，即抑制糖酵解和在癌细胞中优先积累，为进一步研究2DG作为抗肿瘤药物的作用机制奠定了基础。我们推测，最初用2DG处理的癌细胞由于细胞内能量耗尽而表现出应激反应。应激反应导致葡萄糖转运蛋白表达水平增加，葡萄糖摄取增加，从而使更多的2DG进入细胞。由于细胞内高浓度的2DG，己糖激酶和己糖磷酸异构酶被抑制，能量储存如ATP进一步耗尽，细胞激活细胞死亡途径。癌细胞依赖糖酵解来产生能量，并且似乎对葡萄糖缺乏和2DG的影响特别敏感(卡普兰等, 1991). 我们观察到的对乳腺癌细胞具有细胞毒性的2DG浓度在体外是可以实现的体内(莫汉蒂等, 1996). 在几种实验性恶性肿瘤动物模型中，2DG治疗可抑制肿瘤生长(拉斯洛等, 1960;科恩和诺顿，1987年;让开等, 2001). 2DG的临床经验很好，但有限(朗道等, 1958;莫汉蒂等, 1996). 我们认为肿瘤特异性葡萄糖类似物（如2DG）对葡萄糖代谢的干扰可能是其他治疗方式的有效药物或敏化剂，尤其是在多药耐药细胞中。

致谢

作者感谢Jeffrey Moley博士、Kelle Moley博士和John Phay博士的有益讨论，感谢Mary Carayannopoulis博士从注射的谷氨酸1卵母细胞中提供蛋白质，感谢Mike Mueckler博士提供谷氨酸1抗体。

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文章来自英国癌症杂志由以下人员提供英国癌症研究