跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
开发生物。作者手稿；于2007年10月9日在PMC上市。
以最终编辑形式发布为：
开发生物。2003年3月1日；255(1): 178–191.
数字对象标识：10.1016/S0012-1606（02）00047-7
预防性维修识别码：PMC2002545型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院2377
PMID：12618142

PI3-激酶和PIP的作用三颌下腺分支形态发生

梅琳达·拉森,马修·霍夫曼,酒井隆行（Takayoshi Sakai）,贾斯汀·奈鲍尔,1 乔纳森·米切尔,2和肯尼思·山田*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

小鼠颌下腺（SMG）上皮在胚胎发育过程中经历广泛的形态发生分支，这是建立其腺结构的第一步。然而，SMG分支形态发生所需的特定信号通路尚不清楚。通过E13小鼠SMG器官培养，我们发现磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶）抑制剂、沃特曼和LY294002显著抑制SMG的分支形态发生。去除间充质的上皮原基的分支形态发生同样受到抑制，表明PI 3-激酶抑制剂直接作用于上皮。免疫染色和Western分析表明，PI3-激酶的p85亚型在上皮中的表达水平高于间质。PI 3-激酶的一个靶点Akt/蛋白激酶B（PKB）显示在Ser473在PI 3-激酶抑制剂存在的情况下，通过Western分析。PI3-激酶的主要脂质产物，磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP三)在PI 3-激酶抑制剂存在下，通过膜转运载体外源性地添加到SMG中，发现其可以刺激分裂形成，这是分支形态发生的第一步。总之，这些数据表明，PI3-激酶通过PIP在小鼠SMG上皮分支形态发生的调节中发挥作用三通路。

关键词：分支形态发生，唾液腺，下颌下腺，器官培养，磷脂酰肌醇3-激酶，磷脂酰甘油3,4,5-三磷酸，Akt，抑制剂，小鼠，时间推移显微镜

介绍

颌下腺是研究分支形态发生的经典模型(伯恩菲尔德和威塞尔出版社，1970年；Grobstein和Cohen，1965年；斯普纳和威塞尔出版社，1972年). 在发育过程中，颌下腺作为口腔上皮向周围间质的突出物开始发育。分枝形态发生的第一步是分裂形成，在单个芽的表面形成可见的裂痕或凹痕。虽然有一些证据表明需要稳定事件，但尚不清楚是否有信号来指定裂缝的位置(Hieda和Nakanishi，1997年；宫崎骏，1990年). 然后裂口加深，将单个芽分成多个芽，直到可能出现终止信号。然后，这一事件序列重复，统称为分支形态发生过程。虽然增殖最终是腺体生长和后期形态发生所必需的，但早期分支并不依赖于细胞增殖(Nakanishi等人，1987年；史普纳等人，1989年). 相反，分支依赖于多种过程，如细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用、基质降解和细胞形状变化(Hieda和Nakanishi，1997年).

生长因子为许多细胞过程提供了驱动力。与控制分枝形态发生有关的两个主要生长因子家族是表皮生长因子（EGF）(鹿岛和格蕾西克，1997年；森田和野川，1999年；Partanen和Thesleff，1987年)和成纤维细胞生长因子（FGF）家族(霍夫曼等人，2002年). EGFR1缺失小鼠唾液腺上皮内分支减少的观察结果证实了EGFR1参与分支形态发生(贾斯科尔和梅尔尼克，1999年). 使用抑制剂方法研究唾液腺中的EGF信号，结果表明抑制Erk1/2（p44/p42 MAPK）信号部分抑制EGF刺激的分支形态发生(鹿岛等人，2000年)表明该信号通路参与分支形态发生。FGF家族也参与了小鼠颌下腺的早期发育。FGFR2IIIb-null小鼠缺乏唾液腺，因为它们在分支形态发生开始之前经历了发育不全(De Moerlooze等人，2000年；Sekine等人，1999年)，FGF10-null小鼠表现出类似的表型(Ohuchi等人，2000年；Sekine等人，1999年). FGFR1抑制剂SU5402限制SMG在器官培养中的分支形态发生(霍夫曼等人，2002年). 细胞外基质粘附分子的整合素家族也在分支形态发生中起作用。在器官培养中，抗整合素α6种抗体抑制分支形态发生(Kadoya和Yamashina，1993年；Kadoya等人，1995年)，EGF可以调节整合素αSMG中的6表达(鹿岛和格蕾西克，1997年)，包含整合素αEGF刺激分枝形态发生的6条途径。然而，除了Erk1/2外，没有发现分支形态发生所必需的细胞内信号分子。

器官培养系统是细胞培养和体内研究之间的宝贵中间环节，有助于研究需要组织组织的发育过程。为了确定SMG分支形态发生过程中参与信号传递的分子，我们在器官培养系统中使用了一种化学抑制剂筛选方法。虽然阵列分析的基因剖析技术最近被应用于唾液腺的发育，但用这种方法鉴定出的细胞内信号分子很少(霍夫曼等人，2002年；Melnick等人，2001年)因为低丰度或高周转率的基因低于检测极限。此外，基因图谱技术无法识别翻译后事件，如磷酸化。然而，在形态分析中使用化学抑制剂，可以中断信号转导通路，并确定特定分子是否影响分支形态发生过程。

在这项研究中，我们发现磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶）抑制剂抑制分支形态发生。我们还报道了PI3-激酶抑制剂直接作用于上皮细胞，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP三)PI3-激酶的下游产物可以刺激裂缝的形成。这些数据表明PIP3-激酶途径三在颌下腺发育过程中，形成被刺激参与分支形态发生。

材料和方法

体外器官培养

从Harlan（印第安纳波利斯，IN）获得定时妊娠雌性小鼠（ICR株），在12dpc（胚胎第12天，或E12天，分支开始之前）或13dpc（E13天，分支初始轮之后）时取出胚胎。该小鼠株E13处的SMG在发育上可被视为介于前面描述的“晚期初芽”和“假腺体”阶段之间(Jaskoll等人，2002年). 经历分裂的上皮SMG结构在文献中被称为“早期终末芽”、“终末片”、“小叶”和“芽”；在本手稿中，我们将这些结构简单地称为“芽”

用手术刀分离下颌骨切片，并在解剖显微镜下从这些切片中取出带有舌下腺的下颌下腺（以下简称SMG）（SV6，Carl Zeiss，Oberkochen，德国）。将SMG培养在37°C下空气/介质界面的膜上1–72 h。将五个或更多腺体放置在Nucleopore Track-Etch膜上（新泽西州克利夫顿沃特曼）（13 mm，0.1μM） 浮于250μ补充转铁蛋白（1.25）的DMFTV标准培养基L[DMEM/F12（1:1）（Invitrogen，Carlsbad，CA）μg/ml），抗坏血酸（3.75μg/ml）、青霉素（10 U/ml）和链霉素（10μ（g/ml）]置于玻璃底50毫米微孔皿中（MatTek Corp，Ashland，MA）。将SMG保存在冰上，直到添加抑制剂（时间0），然后在37°C、5%CO下培养2在指定的时间内，在潮湿的环境中。培养基通常每24小时更换一次。

对于无间质实验，SMG用1.6 U/ml dispase（Roche，Basel，Switzerland）在37°C的Hanks盐溶液（Invitrogen）中消化20分钟，并用DMEM/F12+5%BSA中和，然后用钨针从上皮中去除间质(高桥和野川，1991年). 在20个细胞的滤器上培养上皮雏形μ每升12 mg/ml Matrigel（BD Biosciences，加州圣何塞）(Royce等人，1993年)如前所述，在20 ng/ml EGF和200 ng/ml FGF7存在下(森田和野川，1999年). 在缺乏外源性生长因子的情况下，上皮原基不会生长或分支（数据未显示）。无间充质实验包括每个条件下至少三个SMG，并重复至少三次。

分枝形态发生分析

信号转导抑制剂（加利福尼亚州圣地亚哥的Calbiochem或密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich）根据其溶解度在DMSO、50%乙醇或DMEM-F12培养基中重新悬浮，并以所示浓度加入常规培养基中。对于每个实验，每个处理至少使用五种E13 SMG，并且测试每个抑制剂的至少三种浓度。在接近其公布IC的浓度下对抑制剂进行了分析50在亚毒性水平下的值。毒性被认为是通过亮场显微镜成像时上皮细胞的明显变暗，在操作上被定义为如果将含有抑制剂的培养基替换为新鲜培养基，SMG在24小时后不会恢复增殖的状态。在该系统中，发现以下化合物在这些水平下具有毒性：herbimycin A，1μM；染料木黄酮，250μM；薰衣草素，500μM；冈田酸，1μM；和芹菜素，50μM.对照介质中的载药浓度与抑制剂中的浓度相同。在任何治疗中，二甲基亚砜的浓度都不超过0.2%v/v，并且在此浓度下不会影响颌下腺的生长或形态。在所有实验中，含抑制剂的培养基在24小时后更换。按照制造商的建议储存抑制剂，必要时在实验前立即重新配制。

除非另有说明，否则使用安装在Axiover 25显微镜（卡尔蔡司）上的数码单反相机（日本东京富士FinePix）在2、22和44小时拍摄照片。将培养物置于培养箱中2小时后拍摄初始照片；此时，SMG已在过滤器上扩散，但尚未开始分支。使用带有预定义标准的盲法程序手动计算每个唾液腺的芽总数，并通过MetaMorph（宾夕法尼亚州唐宁镇通用成像公司；V4.6）自动将数据制成表格。数据被导入GraphPad Prism软件（V3.0a，加州圣地亚哥），用于绘图和统计分析。对于每个处理，通过将芽数除以每个SMG的起始数来评估每个时间点的生长，平均这些值，并将结果表示为任意单位的折叠变化芽/腺体（AU）。对于抑制剂筛选和比较多个处理的实验，将每个处理的平均值归一化为对照，并表示为对照的百分比。抑制剂筛选的结果表示为每个处理使用五个腺体的代表性实验中AU的对照百分比；每个实验至少重复一次。报告的结果表1在产生最大抑制作用且在24小时后不会产生毒性的最低浓度下进行测量。

表1

细胞信号调节剂对唾液腺分支形态发生的影响（E13）

抑制剂潜在目标浓度(微米）
芽/腺对照的百分比±SEM
范围最优的一22小时44小时
受体酪氨酸激酶
 除莠霉素蛋白质酪氨酸激酶0.1–10.564 ± 9*ND（无损检测）b条
 金雀异黄素蛋白质酪氨酸激酶0.25–2502.552 ± 14c（c）9 ± 7c（c）
 拉文德斯汀蛋白激酶10–505082 ± 1361 ± 4*
 第638条酪氨酸激酶、HGFR、磷脂酶D50–10010094 ± 10ND（无损检测）
 AG1433型PDGFR公司β，KDR/Flk-1505066 ± 7ND（无损检测）
磷酸酶类
 冈田酸蛋白磷酸酶PP2A、PP1、PP2B0.050–0.1000.156 ± 2562 ± 15
 钙青霉素A磷酸酶PP2A、PP10.001–200.178 ± 2056 ± 9†
 钒酸盐酪氨酸磷酸酶，钠+/K（K）+ATP酶、酸性和碱性磷酸酶0.4–2004079 ± 540 ± 6*
细胞质激酶/其他
 KN-62型钙调素依赖性蛋白激酶21–2010113 ± 18102 ± 14
 KN-93型钙调素依赖性蛋白激酶20.5–1198 ± 22ND（无损检测）
 SKF86002型p38，环氧合酶，5-脂氧合酶1–2020110 ± 12134±22
 ZM336372型cRaf，第38页α，第38页β20.02–22101 ± 22132 ± 25
 芹菜素CK2、MAPK、PKC、FGFR25–504079 ± 964 ± 15*
 雷帕霉素p70S6K，mTOR0.0001–105104 ± 7111 ± 8
 星孢菌素PKC、MLCK、PKA、PKG、CaMK0.001–0.0202087 ± 12d日96 ± 9d日
 溶血磷脂酸激活PKC、腺苷酸环化酶、G蛋白、酪氨酸激酶、MAPK5–505092 ± 20113 ± 12
 LY294002型PI 3-激酶0.5–502522 ± 4*13 ± 3*
 沃特曼宁PI 3-激酶0.001–0.1000.0156 ± 16†50 ± 14*

注：。在22和44小时计算每个治疗组的小叶/原基数量，并将其归一化为对照组。值是从代表性实验中得出的，n个=5。

一用于获取22和44小时报告数据的浓度，见材料和方法。
b条尚未完成。
c（c）使用E12 SMG进行定量。
d日芽大小减小。
*P（P）≤ 0.05;
†P（P）不成对、双尾≤0.1t吨假设方差相等的检验。

如图和文本所示，进行了统计分析。对于抑制剂筛选，所报告的治疗组和对照组之间差异的显著性由非配对双尾模型确定t吨测试，假设每个实验中的方差相等，尽管实验之间的方差不同。进行单因素方差分析（ANOVA），以确定对多个处理进行比较的实验中每个处理的平均值之间的统计差异。保守的Bonferroni多重比较后检验与方差分析相结合，以比较实验中平均值之间的差异。

对于结合了两种抑制剂的分支形态发生分析，均以其近似IC添加50这个器官培养系统的价值观。IC50根据之前的独立剂量反应实验对每种抑制剂进行了估算。尽管所示数据来自一个具有代表性的实验，但组合实验至少重复了三次。

定时显微镜

SMG在微孔培养皿中在核孔过滤器上预培养2小时20人在场μM LY或控制介质。对于延时显微镜，E13 SMG在37°C下与5%CO孵育2以及安装在尼康Diaphot倒置显微镜上的环境室中的增湿空气，并使用冷却CCD相机（Photometrics CH320；Roper Scientific，Trenton，NJ）或安装有冷却CCD相机的Axiover 100倒置显微镜（Carl Zeiss）进行成像（MicroMAX:1300Y；Princeton Instruments，Mon-mouth Junction，New J）。使用MetaMorph软件通过5倍物镜每10分钟采集一次图像，持续20小时。根据需要调整图像的亮度、对比度和对齐度，并将其组装成电影使用MetaMorph。

裂缝形成分析

对于裂隙形成分析，PtdIns（3,4,5）P三diC公司16（PIP三)通过航天飞机PIP系统（犹他州盐湖城梯层研究实验室）添加到E13 SMG培养基中。项目实施计划三以50的浓度与载体1（C1，硫酸新霉素）混合μ在室温下（RT），允许复合物形成10分钟。PIP三-将C1复合物添加到预热的SMG-DMFTV培养基中，然后添加到培养物中。PIP的吸收三在培养过程中，通过使用荧光共焦显微镜（LSM510，蔡司）观察NBD标记的PIP，初步证实了SMG的作用三（PIP三-C类6NBD，C公司16)用3%多聚甲醛在1×PBS中固定全山SMG的上皮和间质，RT时15分钟，加入标记的PIP后10分钟三文化媒体。使用未标记的PIP进行裂孔形成测定三。对于裂缝形成分析，SMG的采集如前所述，但5–12 SMG是按顺序成对放置在过滤器上，以便对来自同一胚胎的成对SMG进行比较±PIP三此外，在添加PIP之前，它们一直保持在RT状态三-C1或C1，然后在正常条件下培养。项目实施计划三-通过更换整个培养基，每小时添加一次C1或C1。在2小时和8小时对SMG进行数字摄影。根据分支形态发生分析所述，从数字图像中计算上皮表面出现的裂缝数量，在MetaMorph中列出表格，并使用Prism软件绘制图表。PIP的统计分析三实验是使用配对、双尾t吨测验。使用代表性实验的数据重复三次或更多次裂痕形成分析。

免疫荧光

E13 SMG在器官培养中培养24小时，并在4°C的温度下在4%多聚甲醛、5%蔗糖和1×PBS中固定过夜。固定SMG在制造商推荐的1×PBS、0.1%Triton X-100、20%驴血清和鼠对鼠（M.O.M.）封闭试剂（Vector Laboratories，Burlingame，CA）中渗透并封闭。SMG在4°C的稀释液（1×PBS，0.01%Triton X-100，含7%蛋白质浓缩物）（M.O.M.试剂盒；Vector Laboratories）中的一级抗体中孵育过夜，然后在稀释液中的RT中与二级抗体孵育1h。每次抗体孵育后，将SMG在含有0.05%吐温20的1×PBS中洗涤3×10 min。免疫染色至少重复三次。

抗体浓度和来源如下：PI 3-激酶，p85 1:100（06-497；UBI，Watham，MA）；罗丹明阴茎肽，1:350（分子探针，尤金，俄勒冈州）；和抗硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（perlecan），1:100（MAB1948；Chemicon，Temecula，CA）。间接免疫荧光的次级抗体是菁染料结合的AffiniPure F（ab′）2驴抗鼠或兔IgG（H+L）片段，与多种血清蛋白的交叉反应性最小（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）。

西方分析

SMG在含有抑制剂或载体对照物的培养基中培养，培养时间为所示时间段。为了制备富含上皮或间充质的提取物，按照“体外器官培养”下的材料和方法中所述的酶法和物理分离细胞类型。整个E13 SMG、上皮、，或间充质置于微量离心管中，立即冷冻在干冰/甲醇浴中并储存在−80°C或溶解在完整的RIPA缓冲液中（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，1 mM钒酸钠，1 mM氟化钠，1 mM苯甲基磺酰氟，1 mM EDTA，每10 ml缓冲液含有一片完整的迷你蛋白酶抑制剂片（罗氏））。用探针声波仪在冰上以40的振幅对RIPA缓冲液中的SMG进行超声处理10 s，并在14000×克在4°C下持续20分钟。使用Micro-BCA蛋白质分析（皮尔斯、罗克福德、伊利诺伊州）和5或10测定蛋白质浓度μ在1.5-mm 4–12%的SDS-PAGE凝胶（Invitrogen）上，每车道装载g蛋白质。将蛋白质转移到硝化纤维素中并用蓬松染色以确认转移效率。在1×TBS-T（Tris缓冲盐水，0.1%吐温20）中的5%脱脂牛奶中封闭膜1小时，并在4°C下与一抗孵育过夜，其中1%牛奶在1×TB S-T中孵育，二抗在1%牛奶中室温下孵育1小时，1×TBS-T。在每个抗体在1×T培养三次10分钟后清洗斑点。使用化学发光显影液（Super Signal West Dura；Pierce）显影印迹，并使用富士LAS-100化学发光成像仪在欠饱和水平下使用曝光时间进行分析。在剖面模式下，使用图像量规（V3.3）（富士），利用背景减法和每个波段内像素密度的积分，对斑点进行量化。每个波段的像素密度标准化为每条车道的肌动蛋白，以控制任何加载误差。图形在Prism中编译，结果以任意单位（AU）显示。每个印迹重复两到三次，每个实验重复两到3次。所示斑点具有代表性，图表是根据所示斑点生成的。

从所示来源获得的抗体按以下浓度使用：PI 3-激酶p85，1:4000（06-497；UBI）；Akt，1:2500（9272；细胞信号，马萨诸塞州贝弗利）；磷酸化Akt（丝氨酸473)，1:2500（9271S；细胞信号）；β-肌动蛋白，1:10000（克隆AC-74；Sigma）；E-钙粘蛋白，1:5000（610181；BD转导）；和波形蛋白1:5000（克隆13.2；Sigma）。使用的二级抗体是HRP结合的驴抗兔或鼠免疫球蛋白（Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ），使用比例为1:10000。

结果

PI 3-激酶抑制剂影响唾液腺分支形态发生

为了确定SMG发育过程中分支形态发生所需的候选信号转导途径，我们采用了抑制剂筛选策略。我们在单轮分支（E13）后从小鼠胚胎中获取颌下腺，并在器官培养中生长。在培养基中，我们添加了信号转导抑制剂，并在抑制剂存在的情况下监测腺体分支，与对照SMG进行比较。在22和44小时时，我们拍摄了每个SMG，然后按照材料和方法中的描述计算每个腺体的芽数。初步抑制剂筛选结果总结如下表1.

我们发现，一些抑制剂不影响分支形态发生，而少数抑制剂以统计显著的方式抑制分支。毫不奇怪，受体酪氨酸激酶的全局抑制剂，包括herbimycin、genistein和lavendustin，显著抑制了分支形态发生，但这些抑制剂并不确定特定的途径。磷酸酶抑制剂，可能被认为是对抗激酶作用的，实际上在一定浓度范围内抑制了分支形态发生。在所测试的细胞质激酶抑制剂中，很少有显示出显著效果。然而，芹菜素（一种多激酶抑制剂）在高浓度下对分支形态发生表现出中度抑制。本研究中检测到的几种抑制剂对分枝形态发生有轻微影响，但这些影响在统计学上并不显著。

相比之下，磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶）抑制剂具有对分枝形态发生的影响(表1);因此，我们重点测试PI 3-激酶途径的作用。图1A显示了延时显微镜（请参见电影1在http://wwwdir.nidcr.nih.gov/dirweb/cdbrb/DMD/larsen/DB/movies.asp)对照SMG和用PI3-激酶抑制剂LY294002（LY）处理的SMG在20μM.当对照腺体在20小时内经历多轮分支时，经LY处理的腺体只经历一轮分支。在LY处理的SMG中，在裂开开始之前，芽比对照处理的腺体中的芽增大，裂开形成过程本身较慢，表明LY抑制裂开形成，这是SMG分枝形态发生的初始步骤。LY对分支形态发生的抑制通常与最近的一份报告一致，该报告中发现LY限制了输尿管芽上皮的分支形态发生(Tang等人，2002年). 然而，在肾脏中，PI 3-激酶参与抑制输尿管芽的生长，而不是在输尿管分支时不发生的裂缝形成。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms23377f1.jpg

PI 3-激酶抑制剂在器官培养中抑制唾液腺分支形态发生。（A）E13 SMG用20μM LY294002或对照介质并观察用延时显微镜观察20小时，显示的是第一张和最后一张对照图像经LY处理的SMG（参见http://wwwdir.nidcr.nih.gov/dirweb/cdbrb/DMD/larsen/DB/movies.asp对于电影1）在20μM LY294002相对于20小时时的对照腺体。（B，C）PI 3-激酶抑制剂LY和沃特曼（wmn）以增加的浓度添加到SMG器官培养物中。E13 SMG培养物中LY（B）和wmn（C）的剂量反应显示年-轴。LY对SMG分支的影响可以通过从生长介质中去除抑制剂来逆转。所示为24小时的SMG：控制（D），10μM LY（E）和50 nM wmn（F）。68小时后，对照腺体（G）继续分支，用LY（h）处理的SMG仍然受到抑制。（一） 用LY处理SMG 24小时，然后切换到对照培养基（LY-wash），SMG已恢复分支。（J） 用10定量抑制μ24小时的M LY和从培养基中取出LY后SMG的恢复，用芽/腺体表示，标准化为2小时每个腺体的芽数，并用任意单位（AU）与时间表示。通过单因素方差分析，所有样本之间的差异（24小时时的LY和LY-wash除外）在P（P）<0.05，68小时时LY和LY-wash之间的差异在P（P）<0.0001，不成对，双尾t吨检验，假设方差相等。比例尺，100μ米。

通过比较两种结构不同的PI 3-激酶抑制剂（LY，作用于ATP结合位点）和沃特曼（wmn）（真菌代谢物，共价结合PI 3-激酶并不可逆转地阻断催化活性）的作用，定量分析了PI 3-激酶抑制剂的作用和特异性。两个LY(图1B)和wmn(图1C)有效抑制E13腺体的分枝形态发生，呈剂量依赖性。我们发现IC50E13 SMG中LY和wmn的值约为4μM和4 nM，而报告的IC50LY的值为1.4μM，并且纯化的胞质制剂中的wmn为5nM。因此，PI3-激酶抑制剂在SMG器官培养中的剂量依赖性有效性与报告值相当。

为了确认LY的抑制作用是无毒的和可逆的，我们用抑制剂处理腺体24小时，在24小时将抑制剂洗掉，然后在68小时检查腺体(图1D-I). LY的作用是完全可逆的。计算洗脱实验中LY抑制的统计显著性(图1D-I)并被发现在P（P）通过单向方差分析，24小时和68小时<0.05，如图1J。LY治疗和LY洗脱之间的差异在P（P）<0.0001依据t吨去除抑制剂后44h进行测试。总之，这些数据表明，PI 3-激酶抑制剂显著抑制SMG分支形态发生，从而表明PI 3-激酶参与唾液腺分支形态发生。

在缺乏间充质的情况下，抑制剂可抑制裂隙的形成和分支

由于上皮-间充质相互作用与SMG分支形态发生有关(吉尔伯特，2000)，我们询问PI 3-激酶抑制剂是否直接作用于上皮。我们用酶促和物理方法从E13上皮原基中去除间充质，并在Matrigel中培养分离的上皮(Royce等人，1993年)是一种基底膜提取物，在EGF和FGF7的存在下，它们以前被证明在缺乏间质的情况下支持颌下腺原基的生长和分支(森田和野川，1999年). 在没有间充质的情况下，LY294002和沃特曼宁都能抑制颌下腺上皮原基的裂形成和分支(图2C和D，分别）相对于控件(图2B)这些数据表明，PI 3-激酶抑制剂直接作用于上皮细胞，间质中的PI 3-激酶信号可能不需要SMG分支形态发生。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms23377f2.jpg

PI 3-激酶抑制剂抑制无间充质的SMG培养物中的分支形态发生。（A） 分离E13 SMG，酶法和物理去除间充质。（B） 缺乏间充质的SMG在Matrigel中培养48小时，培养基中含有20 ng/ml EGF和200 ng/ml FGF7，发生分支形态发生。（C，D）SMG上皮雏形在Matrigel中生长，含有EGF和FGF7的培养基在PI 3-激酶抑制剂存在下培养48小时，其分支减少：20μM LY（C）和50 nM wmn（D），表明PI 3-激酶抑制剂直接作用于上皮细胞。比例尺，100μ米。

PI 3-激酶定位于胚胎唾液腺上皮

典型I类PI 3-激酶由一个调节亚基和一个催化p110亚基组成，调节亚基是通过受体酪氨酸激酶和/或适配器分子将催化亚基靶向膜所必需的。LY和wmn的分子靶点包括I类和II类PI 3-激酶。而IC50对于wmn和1，I类分子的值约为1 nMμ对于LY，对于II类分子，它们分别为50–450 nM和19 nMμM分别表示wmn和LY(Fruman等人，1998年)表明，在这一系列实验中，我们主要影响I类PI 3-激酶。I类PI 3-激酶的调节亚单位以两种p85亚型存在，α和β，以及p55亚型和p85的两个剪接变体α为了证实PI 3-激酶在胚胎小鼠唾液腺中表达，我们使用识别p85亚型和PI 3-激酶调节亚单位剪接变异体的抗体对E13和E12雏形的总细胞提取物进行了Western免疫印迹分析。我们在两种细胞提取物中都检测到85 kDa的条带(图3A)表明PI 3-激酶存在于分支前和分支阶段。为了确定PI 3-激酶的组织定位，我们对完整的E13雏形进行免疫染色，并通过共焦显微镜检查PI 3-激酶p85亚基的表达模式。我们比较了PI 3-激酶的染色模式(图3B)抗珠光体聚糖抗体(图3C)它识别基底膜，以便我们区分上皮和间充质。我们还检测了结合肌动蛋白的阴茎肽的染色模式(图3D)，作为组织渗透的控制。我们在上皮和间质中都检测到PI3-激酶，但在上皮中的水平更高。定位模式实际上与使用单克隆PI 3-激酶p85抗体（克隆4；BD Biosciences-Transduction）获得的定位模式相同（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms23377f3.jpg

PI3-激酶在胚胎SMG中表达。（A） 用识别PI 3-激酶p85亚型的抗体探测E12和E13 SMG提取物，在两种提取物中均观察到表观分子量为85 kDa的条带。E13 SMG被固定，免疫染色，并通过共焦显微镜检查。图中所示为单个芽的单个部分，标记有：（B）抗p85抗体，（C）基膜标记物perlecan，和（D）结合肌动蛋白丝并显示标记分子有效渗透的罗丹明-球蛋白。（E） 三个通道的合并。PI 3-激酶主要定位于上皮（e），部分定位于间质（m）。比例尺，20μ米。

为了证实PI 3-激酶在上皮细胞中的优先定位，我们从E13 SMG的上皮细胞中物理分离间充质，制作每种制剂的细胞提取物，并通过Western blot分析比较上皮细胞和间充质富集提取物中可检测到的PI 3-激酶的数量(图4A). 上皮标记物E-cadherin和间充质标记物vimentin证实了细胞分离技术的有效性。对上皮细胞和间充质细胞的西方分析证实了p85亚单位在上皮中的优先表达(图4A). 使用从上皮和间充质室RNA制备的cDNA进行RT-PCR同样表明，PI 3-激酶mRNA在上皮中的表达是间充质中的2.5倍（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms23377f4.jpg

E13 SMG中PI 3-激酶和下游靶点Akt的Western分析。（A） 生成富含上皮（E）和间充质（M）的细胞提取物，并通过西方分析进行分析。使用上皮标记物E-cadherin和间充质标记物vimentin来确认分离的有效性。与免疫定位一致，PI 3-激酶主要在上皮细胞中表达，而Akt在两个细胞室中表达。（B） （A）中西方分析的定量，以每条带相对于每条车道肌动蛋白控制的相对像素密度表示。（C） 用LY（25μM） 或wmn（50 nM）1.5、3、7或25 h。提取物用抗pAkt（Ser473)、Akt和肌动蛋白抗体。（D） Western blot在（C）中的定量表示为每条通道中每条带相对于肌动蛋白控制的相对像素密度，并在每个时间点进行标准化以控制，这表明Akt在Ser473与LY的潜伏期增加相关。在25小时和1.5–7小时时，wmn治疗显示出类似的效果（数据未显示）。

Akt在上皮细胞和间质中表达，在Ser473在LY294002存在下检测到

由于大多数细胞类型中PI 3-激酶的主要间接靶点是Ser/Thr激酶Akt/PKB（蛋白激酶B），因此我们通过对上皮和间充质富集提取物的Western分析来检测Akt的表达(图4A)并量化了这些结果(图4B). Akt在上皮和间质中均能检测到同等水平。为了确认Akt的表达模式，我们对发育中的整个唾液腺进行了免疫染色，并通过共焦显微镜进行了检查。在证实Western分析的过程中，我们发现Akt在上皮和间充质中都可检测到表达（数据未显示）。

活性的调节是复杂的，涉及到Akt膜的移位，这可以由PIP诱导三(Stephens等人，1998年)，然后在Thr进行磷酸化308和Ser473.苏氨酸磷酸化308由磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）介导，以响应PI 3-激酶的激活。而Ser的磷酸化来源473尚不清楚，它是必须磷酸化才能激活的位点（有关综述，请参阅Scheid和Woodgett，2001年). 为了确定PI 3-激酶抑制剂是否影响Akt的磷酸化状态，从而影响其活性，我们采集了总唾液腺提取物，并通过Western blotting检测了Akt磷酸化。如所示图4C，并在中进行了量化图4D我们发现473通过抑制PI 3-激酶以时间依赖性方式抑制。从1.5到7小时，Akt磷酸化的抑制作用增加(图4D). 尽管在存在LY294002抑制剂的情况下24小时后，pAkt仍被显著抑制（数据未显示），但在24小时添加新抑制剂后，其水平进一步降低，如图4D（总时间，25小时）。此外，我们定位了活化的磷酸化形式的Akt，pAkt（Ser473)，在上皮和间质中均检测到，但在用LY治疗3小时的SMG中未检测到（数据未显示）。这些发现证实了PI 3-激酶抑制剂有效地渗透到上皮细胞中。此外，这些数据表明，Akt的失活与SMG发育过程中PI 3-激酶的抑制相关，并表明Akt可能在分支形态发生中发挥作用。

项目实施计划三刺激分支

为了确定PI3-激酶下游效应器的调节是否影响分支形态发生，我们使用脂质PIP三，是PIP磷酸化的结果2PI3-激酶在其3′位。确认PIP三我们检测了荧光标记形式的PIP的分布三连接到膜载体。项目实施计划三10分钟后在上皮细胞和间充质细胞中检测到（数据未显示）。为了确定是否可以通过添加PIP将SMG从PI3-激酶抑制剂的抑制作用中拯救出来三在系统中，我们添加了无标签的PIP三每隔1小时检查一次SMG形态，8小时检查SMG形态。PIP的短半衰期三需要每小时增加PIP三.自从我们分析了PIP的影响三在分枝过程中的某个时间点和一个周期完成之前，我们分析了裂的形成，而不是芽的形成。我们发现，在LY294002（20μM） 与对照组相比，裂数显著减少(P（P）< 0.05;图5E). 在10人在场的情况下μM LY、PIP三刺激性裂隙形成(图5B)相对于控件(图5A)，如放大倍数较高的视图所示图5B在里面图5D相对于中的对图5C当对该实验进行定量时(图5E)，发现PIP三-与对照组相比，刺激性裂隙形成在5μ这些数据表明PIP三可能参与在分枝形态发生期间刺激裂缝的形成。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms23377f5.jpg

项目实施计划三在LY抑制剂存在下刺激SMG分支。用含有10μM LY+托架C1（A和C）或10μM LY+C1+PIP三（B和D）。项目实施计划三相对于（C）中的成对腺体，存在10 mM LY（见D中高倍镜下的箭头）时刺激裂隙形成。（E） 计算每个腺体的裂口数，并绘制出与时间零点时每个腺体裂口数相关的图表，以AU表示。比例尺，100μm（A、B）和50μm（C，D）。

PI3-激酶信号部分独立于已知途径

我们希望确定我们已经确定的PI 3-激酶介导的途径是否是目前已知参与SMG分支形态发生的途径的一部分或独立于这些途径。我们使用LY和其他信号转导抑制剂进行分支分析。当LY的最大剂量（10μM；图6B)与Erk1/2抑制剂PD98059（50μM；图6C)LY对分枝的抑制作用更为显著。当LY和PD的最大剂量联合使用时，单独使用LY的抑制作用没有显著增加(图6D). 当该组合实验被量化并通过单向方差分析评估统计显著性时(图6E)，发现这些值存在显著差异(P（P）< 0.0001). LY和PD98059的作用与对照组和相互之间均存在显著差异(P（P）<0.0001），而LY和LY+PD98059之间的差异不存在(P（P）> 0.05;图6B)，由Bonferroni的多重比较后测试确定。我们还结合了LY和PD在其IC附近的浓度50级别并找到相同的结果（未显示数据）。这些数据表明，虽然LY对分支形态发生的影响大于Erk 1/2抑制剂的影响，但没有加性效应，这表明PI 3-激酶可能与Erk 1/2是同一途径的一部分。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms23377f6.jpg

PI 3-激酶抑制剂对SMG的作用不同于其他信号分子。44小时后，与对照SMG（A）相比，10μ经M LY处理的E13 SMG（B）表现出较少且较大的圆形芽，而50个μM PD98059处理的SMG（C）的芽数减少。10的组合μM LY和50μM PD98059（D）与（E）中量化的LY相比无显著差异。用EGFR信号抑制剂PD153035在50pM处理的SMG（F）显示出与对照相比芽数减少（a）。（G） 结合LY（5μM） 和PD15035（50 pM），与仅LY相比差异不大，可以定量观察（H）。（一） 用1.5处理SMGμFGFR1信号抑制剂M SU5402的茎伸长，芽结构异常。（J） 用LY（5）治疗SMGμM） 和SU5402（2μM） 显示了使人联想到这两种抑制剂的复合形态，以及量化时的加性抑制效应（K）。比例尺，100μ米。

由于Erk1/2被证明作用于EGF信号的下游，我们比较了LY和EGF受体（EGFR）抑制剂的作用。我们在其近似IC处添加了LY50该系统的值（5μM；图6B)并将其与特定EGFR抑制剂的最大剂量PD153035（50 pM；图6F). 同样，LY的作用大于EGFR抑制剂的作用，当这两种抑制剂在这些浓度下组合时，作用不是相加的(图6G). 本实验的定量和统计分析如所示图6H，通过方差分析表明平均值显著(P（P）< 0.05). 然而，仅LY与LY+PD153035之间没有显著差异。当LY与较大剂量的PD153035以及其他EGFR抑制剂（包括PD168393、PD156273和酪蛋白AG 1478）联合使用时，也发现了相同的结果（数据未显示）。这些结果与PI3-激酶信号是EGFR介导通路的组成部分的假设一致。

由于PI 3-激酶抑制剂对SMG分支形态发生的影响大于EGFR或Erk抑制剂，我们质疑PI 3-激酶是否可能是一个以上信号通路的组成部分。最近，FGFR抑制剂SU5402（SU）被发现可以抑制分支形态发生(霍夫曼等人，2002年). 我们以接近IC的浓度添加SU50在此系统中（2μM；图6I)发现它似乎限制了分枝形态发生的过程，但也影响了芽的形状，并增加了导管的长度，正如之前报道的那样(霍夫曼等人，2002年). 当LY和SU5402结合时，这两种抑制剂在最终形态中的作用是明显的(图6J)SMG表现出SU5402处理典型的细长不规则导管和LY处理典型的大而光滑的圆形芽。本实验定量(图6K)方差分析再次表明平均值之间存在显著差异(P（P）< 0.0001). 然而，LY和SU存在加性效应，通过Bonferroni的多重比较检验，LY与LY+SU5402之间的差异显著(P（P）< 0.01). 这些数据表明，在SMG分支形态发生过程中，PI3-激酶似乎不是通过FGFR1发出信号的成分。然而，除了对EGF介导的信号传导的明显贡献外，我们不能排除PI 3-激酶参与另一种参与分支形态发生的信号传导途径的可能性。

讨论

在这项研究中，我们已经表明，PI 3-激酶抑制剂通过直接作用于上皮细胞来负向调节SMG中的分支形态发生。与在分支中的作用一致，PI3-激酶主要定位在上皮内。我们通过添加PI3-激酶的直接靶点PIP，挽救了PI3-激酶抑制剂的作用三我们还报告了另一个PI3-激酶下游效应器Akt的磷酸化降低（473)随着PI 3-激酶抑制剂孵育时间的增加，与分支形态发生的抑制相关。总之，这些数据表明PI3-激酶参与分支形态发生，其作用是通过PIP信号传导介导的三可能还有Akt。自添加PIP以来三我们提出了一个模型，其中PIP三-依赖性信号引发分裂形成。或者，PIP三可能不会引发裂缝的形成，但可能会提供裂缝稳定信号。项目实施计划三由PIP磷酸化生成2也具有信号转导特性(捷克语，2000). 这些数据表明PIP的形成三而不是PIP的减少2是分支形态发生过程中PI 3-激酶信号下游的关键事件。由于对裂隙形成机制知之甚少，PIP的作用三SMG分支形态发生将是未来研究的主题。

因为化学抑制剂的特异性是抑制剂研究中的一个问题(Davies等人，2000年)，我们使用了两种化学上独立的PI3-激酶抑制剂，LY294002（LY）和wortmannin（wmn），并观察到两者对分枝形态发生的影响相同。据报道Wmn会影响PI4Kβ(梅耶斯和坎特利，1997年)，尽管没有达到本研究中使用的水平。LY对雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶点具有抑制作用(Brunn等人，1996年)然而，mTOR似乎不是SMG分支形态发生的靶点，因为雷帕霉素本身对分支没有影响(表1). 据报道，LY还可抑制DNA依赖性蛋白激酶(Hartley等人，1995年)和酪蛋白激酶-2（CK2）(Davies等人，2000年). 虽然我们发现芹菜素，一种CK2抑制剂，确实抑制了分支形态发生(表1)，芹菜素对CK2没有特异性，并且影响十几种不同的激酶(Pinna，2002年). 由于缺乏特异性CK2抑制剂，目前很难检测CK2在分枝形态发生中的作用。然而，通过这些研究，我们可以得出结论，PI 3-激酶参与了分支形态发生；然而，我们不能排除其他分子参与的可能性。

PI3-激酶是许多系统中许多信号转导途径的介质，包括EGF和FGF刺激的信号传导(Carballada等人，2001年；Okano等人，2000年；托克，2000). 与先前EGFR抑制剂适度抑制分支形态发生的数据一致(鹿岛和格蕾西克，1997年；鹿岛等人，2000年)，我们已经证明高度特异的EGFR抑制剂（已报道的IC5025 pM）抑制SMG器官培养中的分支形态发生。同样，我们发现PD98059适度抑制分支形态发生(图6C)与以前的报告类似(鹿岛等人，2000年). 在我们的培养体系中，不依赖于外部添加的生长因子，PI 3-激酶抑制剂LY的作用大于MAP激酶抑制剂PD98059的作用(图6E). 当LY与PD98059或PD153035组合时，该系统中没有加性效应。然而，当与FGFR1抑制剂SU5402结合时，对分支形态发生有一种组合效应，表明LY和SU5402影响不同的途径。支持PI 3-激酶不是FGF信号成分这一假设的其他证据来自无间质培养的结果。以前有报道称，在无间充质培养物中，EGF刺激芽形成，而FGF7刺激导管伸长(森田和野川，1999年). 在我们的无间充质培养中，LY(图2C)和wmn(图2D)似乎允许导管延伸但抑制分支。总之，这些数据表明，PI 3-激酶是表皮生长因子（EGF）的下游效应器，而不是生长因子（FGF）在SMG分支形态发生过程中的作用。

而EGFR抑制剂PD153035更具特异性(Bridges等人，1996年)比tryphostin RG50864(Nowak等人，1997年)之前用于证明EGF信号在SMG发育过程中的重要性(鹿岛和格蕾西克，1997年)，它不仅抑制EGFR1（ErbB1），还抑制EGFR家族成员ErbB2、-3和-4，表明这些家族成员中的一个或多个可能参与SMG分支形态发生。事实上，EGFR1不是PI3-激酶的强激活剂(Yarden和Sliwkowski，2001年). 此外，据报道，在刺激PI 3-激酶激活方面最有效的EGF家族成员是ErbB3(Soltoff等人，1994年). 在SMG分支形态发生过程中，尚不清楚哪个ErbB家族成员模拟PI 3-激酶。

事实上，PI 3-激酶抑制剂的抑制作用似乎大于EGF途径抑制剂，这表明PI 3-激酶可能参与参与分支形态发生的额外途径。分支形态发生的另一个刺激因子是整合素α如整合素对分支的抑制所示α器官培养中的6种抑制性抗体(Kadoya等人，1995年)但其机制尚不清楚。我们添加了一个抑制整合素的功能α6抗体（GoH3），并测定Akt在Ser的磷酸化473作为PI 3-激酶活性的指示物。然而，我们发现GoH3对Akt磷酸化没有影响（数据未显示），这表明PI 3-激酶不介导整合素α6信号。PI3-激酶可能参与SMG分支形态发生的另一个可能未知的途径。

PI 3-激酶的其他下游介质可能参与分支形态发生尚不清楚。由于Akt磷酸化的丢失与LY的增加和分支的抑制有关，因此Akt也可能参与其中。与这种可能性相一致的是，ML-9在35岁时抑制分支形态发生μM（未显示数据）。虽然ML-9抑制Akt磷酸化(Hernandez等人，2001年)在这些水平上，它也是肌球蛋白轻链激酶和蛋白激酶A的抑制剂。雷帕霉素除了抑制mTOR外，还抑制p70S6激酶（p70S6K），后者是一些PI 3-激酶活性的下游介体。然而，由于雷帕霉素不抑制分枝形态发生(表1)，p70S6K似乎在分支形态发生中不起作用。由PI 3-激酶信号激活的其他分子，包括蛋白激酶C的亚型(Nakanishi等人，1993年；Toker等人，1994年)和Rac(霍金斯等人，1995年)，是分支形态发生的潜在靶点。未来的研究将寻求识别PI3-激酶/PIP下游的特定分子三在分枝形态发生中。

增殖、迁移、细胞形状变化、基质合成、基质降解和细胞生理学中的其他变化是分支形态发生过程的组成部分。每个分支器官的过程不同。与肾不同，肾的分支形态发生始于输尿管芽的生长，而肾的分支则始于SMG中的裂隙形成。有趣的是，尽管涉及不同的机制，但PI 3-激酶在肾脏和SMG分支的启动中发挥作用。在SMG中，很明显PI3-激酶/PIP三虽然还不清楚是否涉及其他生理机制，但PI3-激酶的作用似乎并不取决于增殖的变化，在裂缝形成的启动中起作用。在存在PI 3-激酶抑制剂的情况下，根据BrdU掺入分析（数据未显示），上皮内的增殖保持不变。目前尚不清楚PI3-激酶是否会影响SMG裂形成过程中的某些细胞迁移过程，就像在输尿管芽生长过程中的活动细胞迁移过程一样(Tang等人，2002年). 未来，鉴定PI3-激酶/PIP的下游介导物将是一件有趣的事情三信号传导，以了解小鼠SMG分支形态发生过程中该通路的详细机制。

补充材料

补充电影1

单击此处查看。（520万澳元）

补充电影2

单击此处查看。（360万美元）

致谢

我们感谢Catherine Galbraith对这份手稿的批评性阅读和Harry Grant的校对。这项工作得到了NIH拨款DE-14322（给M.L.）的部分支持。

参考文献

  • Bernfield MR，Wessells NK公司。上皮形态发生的细胞内外控制。Symp-Soc Dev生物。1970;29:195–249.[公共医学][谷歌学者]
  • Bridges AJ、Zhou H、Cody DR、Rewcastle GW、McMichael A、Showalter HD、Fry DW、Kraker AJ、Denny WA。酪氨酸激酶抑制剂。8 4-（3-溴苯胺）-6,7-二甲氧基喹唑啉类似物（PD 153035）的构效关系异常陡峭，它是表皮生长因子受体的一种有效抑制剂。医学化学杂志。1996;39:267–276.[公共医学][谷歌学者]
  • Brunn GJ、Williams J、Sabers C、Wiederrecht G、Lawrence JC，Jr、Abraham RT。磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、沃特曼和LY294002对雷帕霉素哺乳动物靶点信号功能的直接抑制。EMBO J。1996;15:5256–5267. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Carballada R，Yasuo H，Lemaire P.磷脂酰肌醇-3激酶在爪蟾中胚层诱导期间与ERK MAP激酶在FGF通路中平行作用。发展。2001;128:35– 44.[公共医学][谷歌学者]
  • 捷克议员。PIP2和PIP3：细胞表面的复杂作用。单元格。2000;100:603– 606.[公共医学][谷歌学者]
  • Davies SP，Reddy H，Caivano M，Cohen P.一些常用蛋白激酶抑制剂的特异性和作用机制。生物化学杂志。2000;351:95–105. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • De Moerlooze L、Spencer-Dene B、Revest J、Hajihosseini M、Rosewell I、Dickson C。成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）的IIIb亚型在小鼠器官发生期间间充质-上皮信号传递中的重要作用。发展。2000;127:483–492.[公共医学][谷歌学者]
  • Fruman DA，Meyers RE，Cantley LC。磷酸肌醇激酶。生物化学年度收益。1998;67：481–507。[公共医学][谷歌学者]
  • 吉尔伯特·旧金山。发育生物学。Sinauer Associates公司。；马萨诸塞州桑德兰：2000。[谷歌学者]
  • Grobstein C，Cohen J.胶原酶：体外对胚胎唾液上皮形态发生的影响。科学。1965;150:626– 628.[公共医学][谷歌学者]
  • Hartley KO，Gell D，Smith GC，Zhang H，Divecha N，Connelly MA，Admon A，Lees-Miller SP，Anderson CW，Jackson SP。DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位：磷脂酰肌醇3-激酶和共济失调毛细血管扩张症基因产物的一种相对物。单元格。1995;82:849– 856.[公共医学][谷歌学者]
  • Hawkins PT、Eguinoa A、Qiu RG、Stokoe D、Cooke FT、Walters R、Wenstrom S、Claesson Welsh L、Evans T、Symons M等。PDGF通过激活磷脂酰肌醇3-激酶刺激GTP-Rac的增加。当前生物量。1995;5:393– 403.[公共医学][谷歌学者]
  • Hernandez R、Teruel T、Lorenzo M.Akt介导胰岛素诱导棕色脂肪细胞葡萄糖摄取和上调GLUT4基因表达。FEBS信函。2001;494:225–231.[公共医学][谷歌学者]
  • Hieda Y，Nakanishi Y。小鼠胚胎颌下腺的上皮形态发生：与上皮组织和间充质的关系。开发增长不同。1997;39:1– 8.[公共医学][谷歌学者]
  • Hoffman MP、Kidder B、Steinberg Z、Lakhani S、Ho S、Kleinman HK、Larsen M。小鼠颌下腺发育的基因表达谱：FGFR1通过BMP和FGF依赖机制调节体外的分支形态发生。发展。2002;129：5767–5778。[公共医学][谷歌学者]
  • Jaskoll T，Melnick M.颌下腺形态发生：正常胚胎小鼠中TGF-α/EGF、IGF、TGF-β、TNF和IL-6信号转导的阶段特异性表达以及TGF-beta2、TGF-beta3和EGF-r无效突变的表型效应。Anat记录。1999;256:252–268.[公共医学][谷歌学者]
  • Jaskoll T、Zhou YM、Chai Y、Makarenkova HP、Collinson JM、West JD、Hajihosseini MK、Lee J、Melnick M.胚胎颌下腺形态发生：正常小鼠中FGFs、BMPs、Pax6和Pax9的阶段特异性蛋白定位以及FgfR2-IIIc（+/Delta）、BMP7（−/−）和Pax6（−/-）小鼠中异常SMG表型。细胞组织器官。2002;170:83–98.[公共医学][谷歌学者]
  • 卡多亚Y、卡多亚K、Durbeej M、Holmvall K、Sorokin L、Ekblom P。抗层粘连蛋白-1和整合素α6亚基E3结构域的抗体干扰颌下腺分支上皮形态发生，但以不同的方式。细胞生物学杂志。1995;129:521–534. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kadoya Y，Yamashina S.发育中小鼠颌下腺α6整合素亚基的分布。组织化学与细胞化学杂志。1993;41:1707–1714.[公共医学][谷歌学者]
  • Kashimata M，Gresik EW公司。表皮生长因子系统是小鼠胎儿颌下腺发育的生理调节器，并调节α6整合素亚基的表达。开发动态。1997;208:149–161.[公共医学][谷歌学者]
  • Kashimata M、Sayeed S、Ka A、Onetti-Muda A、Sakagami H、Faraggiana T、Gresik EW。ERK-1/2信号通路参与EGF刺激胎鼠颌下腺分支形态发生。开发生物。2000;220:183–196.[公共医学][谷歌学者]
  • Melnick M，Chen H，Min Zhou Y，Jaskoll T。发育中的胚胎颌下腺对NF-kappaB抑制的功能基因组反应。BMC开发生物。2001;1:15. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Meyers R，Cantley LC。一种沃特曼敏感的人磷脂酰肌醇4-激酶的克隆和表征。生物化学杂志。1997;272:4384– 4390.[公共医学][谷歌学者]
  • 宫崎骏M.胚胎小鼠颌下腺的分支形态发生：扫描电镜研究。Arch Histol细胞。1990年；53：157–165。[公共医学][谷歌学者]
  • Morita K，Nogawa H.体外小鼠唾液上皮分支形态发生中依赖EGF的小叶形成和依赖FGF7的柄伸长。开发动态。1999;215:148–154.[公共医学][谷歌学者]
  • Nakanishi H、Brewer KA、Exton JH。磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸对蛋白激酶Cζ同工酶的激活。生物化学杂志。1993;268:13–16.[公共医学][谷歌学者]
  • Nakanishi Y，Morita T，Nogawa H。体外培养的小鼠胚胎颌下腺上皮早期形成裂隙不需要细胞增殖。发展。1987;99:429– 437.[公共医学][谷歌学者]
  • Nowak F，Jacquemin-Sablon A，Pierre J.表皮生长因子受体信号级联作为上皮细胞中酪蛋白（RG 50864）的靶点。对丝裂原活化蛋白激酶和丝裂原激活蛋白激酶活性的矛盾影响。生物化学药理学。1997;53:287–298.[公共医学][谷歌学者]
  • Ohuchi H、Hori Y、Yamasaki M、Harada H、Sekine K、Kato S、Itoh N。FGF10是小鼠多器官发育中FGF受体2 IIIb的主要配体。生物化学与生物物理研究委员会。2000;277:643– 649.[公共医学][谷歌学者]
  • Okano J、Gaslightwala I、Birnbaum MJ、Rustgi AK、Nakagawa H.Akt/蛋白激酶B亚型受表皮生长因子刺激的差异调节。生物化学杂志。2000;275:30934–30942.[公共医学][谷歌学者]
  • Partanen AM，Thesleff I.不同发育阶段小鼠胚胎牙齿和其他胚胎组织中125I-表皮生长因子结合的定位和定量。开发生物。1987;120:186–197.[公共医学][谷歌学者]
  • Pinna LA。蛋白激酶CK2：对正典的挑战。细胞科学杂志。2002;115：3823–3878。[公共医学][谷歌学者]
  • Royce LS、Kibbey MC、Mertz P、Kleinman HK、Baum BJ。人类颌下腺下夹层导管细胞在基底膜基质上培养时表现出腺泡表型。区别。1993;52:247–255.[公共医学][谷歌学者]
  • Scheid MP，Woodgett JR.PKB/AKT：基因模型的功能见解。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2:760–768.[公共医学][谷歌学者]
  • Sekine K、Ohuchi H、Fujiwara M、Yamasaki M、Yoshizawa T、Sato T、Yagishita N、Matsui D、Koga Y、Itoh N、Kato S.Fgf10对肢体和肺的形成至关重要。自然遗传学。1999;21:138–141.[公共医学][谷歌学者]
  • Soltoff SP、Carraway KL、3rd、Prigent SA、Gullick WG、Cantley LC。ErbB3参与表皮生长因子激活磷脂酰肌醇3-激酶。分子细胞生物学。1994;14:3550–3558. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Spooner BS，Bassett KE，Spooner BS.，Jr胚胎唾液腺上皮分支活动在实验上独立于上皮扩张活动。开发生物。1989;133:569–575.[公共医学][谷歌学者]
  • Spooner BS，Wessells NK公司。唾液腺形态发生分析：细胞质微丝和微管的作用。开发生物。1972;27:38–54.[公共医学][谷歌学者]
  • Stephens L、Anderson K、Stokoe D、Erdjument-Bromage H、Painter GF、Holmes AB、Gaffney PR、Reese CB、McCormick F、Tempst P、Coadwell J、Hawkins PT。介导磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸依赖性激活蛋白激酶B的蛋白激酶B激酶。科学。1998;279:710–714.[公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi Y，Nogawa H.小鼠唾液上皮在由膜过滤器从间质分离的基底膜样基质中的分支形态发生。发展。1991;111:327–335.[公共医学][谷歌学者]
  • 唐美杰，蔡毅，蔡素江，王永科，Dressler GR。尿毒症芽对RET激活的反应是由磷脂酰肌醇3-激酶介导的。开发生物。2002;243:128–136.[公共医学][谷歌学者]
  • Toker A.作为磷脂酰肌醇3-激酶信号传导介质的蛋白激酶。摩尔药理学。2000;57:652– 658.[公共医学][谷歌学者]
  • Toker A、Meyer M、Reddy KK、Falck JR、Aneja R、Ane ja S、Parra A、Burns DJ、Ballas LM、Cantley LC。新型多磷酸肌醇化物PtdIns-3,4-P2和PtdIns-3,4,5-P3激活蛋白激酶C家族成员。生物化学杂志。1994;269:32358 –32367.[公共医学][谷歌学者]
  • Yarden Y，Sliwkowski MX。解开ErbB信令网络。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2:127–137.[公共医学][谷歌学者]