临床实验免疫学。2006年10月；146(1): 169–180.
炎症性肠病巨噬细胞中组织蛋白酶B、L和D及组织蛋白酶抑制的潜在治疗作用体内
,* ,* ,* ,* ,* ,† ,* ,* ,*和*
F Obermeier公司
*德国雷根斯堡雷根斯堡大学第一内科
K Schreiter公司
*德国雷根斯堡雷根斯伯格大学内科I系
N Dunger公司
*德国雷根斯堡雷根斯伯格大学内科I系
J Scholmerich出版社
*德国雷根斯堡雷根斯伯格大学内科I系
*德国雷根斯堡雷根斯伯格大学内科I系
†德国雷根斯堡大学病理学研究所
摘要
组织蛋白酶D（CTSD）、B（CTSB）和L（CTSL）对蛋白质的细胞内降解非常重要。组织蛋白酶表达增加与炎症疾病相关。我们之前已经证明了炎症性肠病（IBD）患者炎症粘膜中肠巨噬细胞（IMAC）中CTSD的诱导表达。在这里，我们研究了IBD期间IMAC中CTSB和CTSL的调节以及CTSD和CTSB/CTSL抑制的影响体内从正常和炎症粘膜中分离出人IMAC。对CTSB和CTSL mRNA进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。免疫染色用于确认PCR结果。应用胃蛋白酶抑制素A（CTSD抑制剂）、CA-074（CTSB抑制剂）和Z-Phe-Tyr-aldehyde（CTSL抑制剂）在小鼠右旋糖酐-硫酸钠（DSS）结肠炎模型中研究组织蛋白酶抑制作用。从IBD粘膜分离的IMAC中CTSL mRNA显著上调。免疫染色显示，蛋白表达上调主要见于粘膜损伤区域。在小鼠DSS结肠炎中抑制CTSD之后，疾病得到改善。与对照组相比，经抑制剂治疗的小鼠表现出显著的组织学评分（HS）较低和结肠减少较少。同样，同时抑制CTSB/CTSL后，结肠炎明显改善。IBD患者IMAC组织降解组织蛋白酶的表达增加。抑制CTSD和CTSB/CTSL后，实验性结肠炎得到改善。组织蛋白酶抑制预防粘膜损伤可能为IBD的治疗提供一种新的途径。
关键词：组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织酶L、DSS结肠炎、炎症性肠病、抑制、巨噬细胞
介绍
近年来，对克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）发病机制的认识取得了巨大进展。在识别风险基因和动物模型的遗传学研究中，粘膜屏障在预防细菌入侵和随后的炎症方面的重要性已得到证实。粘膜损伤和粘膜愈合的相关性已被广泛讨论。
在正常情况下，胃肠道免疫系统在对微生物病原体的免疫反应和对局部共生菌群的耐受性之间保持微妙的平衡，这种耐受性部分由参与识别或传递炎症信号的表面受体的下调介导[1–三]. 炎症性肠病（IBD）患者的粘膜屏障可能会泄漏，导致抗原和促炎分子（包括肠腔细菌和细菌产物）的不受控制的摄取。正常无炎症（NI）粘膜中的肠巨噬细胞（IMAC）显示出参与细菌和先天免疫系统快速反应的分子下调。这些下调的表面分子包括CD14、Toll样受体（TLRs）2和4、人类白细胞抗原D相关（HLA-DR）、CD11b/CD18和CD11c/CD18，它们被讨论为革兰氏阴性菌和T细胞共刺激分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2）的替代结合蛋白[2–6]. 这表明IMAC调节免疫反应的能力较低。此外，氧化爆发活性降低表明肠粘膜在分化过程中“脱敏”[7–10]. 然而，在粘膜炎症期间，IMAC表达T细胞共刺激分子，表明炎症粘膜中的IMAC已恢复调节免疫反应的能力[4,6]. 此外，人类粘膜炎症过程中核因子（NF）κB的激活表明参与了炎症过程[11].
当我们通过阵列和消减杂交筛选研究正常IMAC和炎症相关巨噬细胞之间的基因表达差异时，我们发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）和组织蛋白酶D（CTSD）等组织降解酶的显著诱导[8,12]. 这导致我们调查组织蛋白酶家族的其他成员。
溶酶体组织蛋白酶的蛋白水解和破坏特性已被证明在退行性疾病以及慢性炎症疾病中发挥作用。CTSL被发现由肿瘤细胞株分泌，并被认为在组织侵袭和转移过程中有助于基底膜成分的降解[13]. 其胶原酶和弹性蛋白酶降解活性与关节硬化和肺气肿等疾病的发病机制有关[14]. 溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B（CTSB）和组织蛋白酶L（CTSL）可能参与骨质疏松、癌症转移、类风湿性关节炎和感染性疾病[15–17]. 然而，这些组织蛋白酶在疾病过程中作为预后因素的有用性是有争议的[18]. CTSB表达增加与肿瘤分期之间存在相关性[19,20].
此外，组织蛋白酶家族的蛋白酶参与细胞外基质（ECM）蛋白的重塑[21]. 炎症反应期间富含弹性蛋白的组织的破坏与含有高水平弹性分解酶（如CTSB和CTSL）的巨噬细胞的局部积聚有关[22]. 天冬氨酸蛋白酶CTSD具有启动蛋白水解级联反应、降解和重塑细胞外基质的潜力[23]. CTSD-deficient小鼠出生正常，但在出生后第26天因大量肠坏死、血栓栓塞和淋巴细胞减少而死亡[24]. 正如我们已经证明IBD粘膜诱导IMAC中CTSD mRNA和蛋白表达一样，我们假设组织蛋白酶参与肠道炎症和粘膜组织损伤。
因此，我们首先研究了IBD患者IMAC中CTSB和CTSL的表达，发现其表达上调，尤其是在组织损伤和粘膜溃疡区域。随后，我们在实验性结肠炎模型中测试组织蛋白酶抑制对炎症程度的影响。
材料和方法
患者
手术标本取自结直肠癌手术患者（对照组）结肠粘膜的健康区域，或CD或UC患者的炎症结肠粘膜。组织学评估由经验丰富的IBD病理学家进行。IBD患者接受5-氨基水杨酸（5-ASA）和/或类固醇治疗。治疗对结果没有影响。这项研究得到了雷根斯堡大学道德委员会的批准。
13个未检测到炎症的结肠样本作为NI纳入研究。12个CD和4个UC样本具有中度至重度炎症。UC患者的标本取自降结肠或乙状结肠，CD患者的标本则取自升结肠或乙形结肠。
人固有层单核细胞（LPMNCs）的分离
通过轻轻摇晃，将肠上皮细胞（IEC）在37°C的无钙无镁Hanks平衡盐溶液（HBSS）中与1 mmol/l乙二胺四乙酸（EDTA）孵育30分钟，从粘膜标本中去除。随后，根据最近描述的一项方案，分离出人类固有层单核细胞（LPMNC）[25]. 在37°C的温度下，将标本置于含有1 mg/ml I型胶原酶（=336 U/ml）、0.3 mg/ml脱氧核糖核酸酶（DNaseI；德国曼海姆Boehringer）和0.2 mg/ml透明质酸酶的10 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中培养45分钟。在用1·5 ml PBS和500µl胎牛血清（FCS）细胞分散和洗涤后，最终在～690℃进行Ficoll密度梯度离心20分钟克无制动）用于单核细胞的分离。仔细去除间期，用PBS清洗细胞。
人IMAC的分离纯化
如最近所述，将从正常和IBD粘膜标本中分离的LPMNC与配备有单克隆小鼠抗人巨噬细胞CD33抗体的MicroBeads（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany）孵育，并用AS分离柱纯化两次[25]. 磁性标记细胞保留在柱中。将柱从磁场中取出后，洗脱残留部分。将洗脱的细胞通过第二个AS分离柱以提高IMAC的纯度[25]. 使用藻红蛋白（PE）结合的山羊抗鼠IgG抗体（Caltag；Medac，汉堡，德国）通过荧光激活细胞分选仪（FACS）分析确认最终纯度>95%的IMAC。
CTSB和CTSL的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
用polyT磁珠（挪威奥斯陆戴纳）从CD33中分离出Poly（A）-RNA+电池符合制造商的协议。IMAC在裂解/结合缓冲液中再次悬浮。将小瓶置于永磁体（MCP®-E-1；Dynal）的磁场中5分钟，以去除携带CD33抗体的免疫磁性微珠。悬浮液与Dynabeads oligo（dT）混合25并旋转5分钟。将裂解液清洗三次。脱除寡毛酵母（dT）中的mRNA25在65°C下在20µl洗脱液中进行2分钟。
使用RT-PCR系统（美国麦迪逊市普罗米加）在42°C下15分钟反应中逆转录Poly（A）-RNA。对于PCR，使用的引物如下：CTSL上游GACAGGACTGGAGAG；CTSL下游GTTTCCCTTCCCTGTATTC；CTSB上游TCGGATGTGGTCAACTATG；CTSB下游TCCAAGCTTCAGAGAGTAG。
为了测试cDNA的代表性和全长基因，使用Gene Checker™Kit（荷兰韭菜英威特罗根）中的5′β-actin、3′β-attin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、6K氯氰菊酯和2K氯氰化物引物集进行RT–PCR。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳和尺寸标准（GeneRuler™；MBI Fermentas，St.Leon-Rot，德国）。
塔克Man®–PCR
从CD33中分离出Poly（A）-RNA+细胞并如上所述进行逆转录。CTSB和CTSL的表达水平通过塔克Man®–PCR在384孔板中作为单管反应（20µl）。使用的引物如下：CTSL正向TAGAGGCACAGTGGACCAAGTG；CTSL反向ACTGCTCTCCATCCTTCTTC；CTSB正向TCAACTATGTCAACAAACGGAATACC；CTSB反向CAAGTAGCTCATGTCCA CGTTGTA。使用的探针（CTSL:5′-AGGCGATGCACACACAGATACTACGGCA-3′，CTSB:5′-TGGCAGGCCGGGCACAACTT-3′）用6-羧基荧光素（FAM）标记5′，用6-羧四甲基罗丹明（TAMRA）标记3′。塔克Man®–PCR使用1µl cDNA、1µl上游和下游引物（18µM）、1μl探针（5µM塔克Man Mastermix（Applied Biosystems，Foster City，USA），最终体积为20µl，使用无菌H2O.使用适当的GAPDH试剂盒（Applied Biosystems）作为参考，同时测量GAPDH表达。循环如下：50℃持续2分钟，95℃持续10分钟，然后重复44次：95℃持续15秒，60℃持续1分钟。
石蜡包埋切片的脱脂
石蜡嵌入部分被切割（5µm），漂浮在软化水上，放置在载玻片上，并在60°C下烘烤60分钟。用二甲苯对载玻片脱蜡10分钟，并在分级乙醇系列中再水化（99%、95%、70%乙醇和PBS各5分钟）。为了进行去鳞，在95°C下用目标提取溶液（S2031，Dako，Hamburg，Germany）培养切片30分钟。用1%过氧化氢在PBS中淬灭内源过氧化物酶30分钟。在PBS中将载玻片清洗三次。
免疫组织化学
为了鉴定人体组织中的CTSL阳性细胞，用小鼠抗人CTSL抗体（7µg/ml；IgG1，单克隆抗体（MCA）2066，Serotec，德国杜塞尔多夫），识别人前体和成熟形式的CTSL。小鼠免疫球蛋白1（7µg/ml；M-5284，小鼠IgG1κ; Sigma，Taufkirchen，Germany）被用作同型对照。生物素结合羊抗鼠二级抗体（1/500稀释；（IgG（H+l），115-065-062；Jackson ImmunoResearch，Hamburg，Germany）和Vectastain ABC-elite-standard系统（#PK-6100；Vector Laboratories，Burlingame，USA）相继被应用。清洗后，用NovaRED®（AEC，Vector Laboratories）培养组织进行红色免疫染色。
双重标记免疫组织化学
为了证明粘膜巨噬细胞表达CTSL，将载玻片与0.3%过氧化氢在PBS中孵育30分钟，以抑制剩余的过氧化物酶。清洗后，用小鼠抗人CD68/异硫氰酸荧光素（FITC）（7µg/ml；F7135，克隆KP1，IgG1，Dako）。将纯化的小鼠同种（7µg/ml）作为对照。随后，应用羊抗鼠抗荧光素-辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（1/25稀释；NEF 710，NEN®；美国马萨诸塞州波士顿）和Vectastain ABC-elite标准体系（同型：M-5284，小鼠IgG1κ; 西格玛）。将载玻片在0.01%联苯胺盐酸盐（BDHC；Sigma）和0.03%硝普钠（Sigma。在显微镜下监测蓝色反应产物的形成，并用水中断。为了进行半定量分析，通过评估放大200倍或400倍的四个高倍视野，分别测定红色、蓝色和双染细胞。
免疫荧光
免疫荧光法检测人体组织中CTSB阳性细胞。如上所述，阻断内源性过氧化物酶。为了减少非特异性结合，将载玻片在1%牛血清白蛋白（BSA）/PBS中孵育30分钟。在PBS中洗涤后，应用抗人前体和成熟形式CTSB的多克隆兔抗人抗体（5µg/ml；IgG，AHP 591；Serotec）。对于阴性对照，用相同稀释度的兔免疫球蛋白部分（X0903；Dako）代替一级抗体。然后将载玻片与山羊抗兔-Alexa488二级抗体（1/300稀释；IgG（H+l），A110-08（Molecular Probes，尤金，俄勒冈州，美国）孵育。为了证明CTSB表达细胞是巨噬细胞，再次用0.3%过氧化氢在PBS中冲洗切片30分钟，以抑制静息过氧化物酶。洗涤后，将样品与小鼠抗人CD68抗体（0.5µg/ml；M0814，克隆KP1，IgG1κ、 Dako）。纯化小鼠同种型（小鼠IgG1κ、 M-5284；西格玛）作为阴性对照。接下来，将载玻片涂上生物素结合的山羊抗鼠Alexa546二级抗体（1/300稀释；IgG（H+l），A110-03；分子探针）。细胞核是用固定介质（Vectashield®；Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA，USA）染色的4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）。用显微镜在400倍放大的荧光灯下分别捕获免疫荧光绿（Alexa488）、红（Alexa546）和/或蓝（DAPI）染色切片（每个高倍视野）（Leitz DM RBE；Leica，Bensheim，Germany）。
动物模型
使用体重为20–25 g的雌性Balb/c小鼠（德国苏尔兹菲尔德Charles River）。除了结肠炎诱导期外，他们还吃了水即兴创作动物研究得到了当地机构审查委员会的批准。
为了诱导急性结肠炎，小鼠在饮用水中接受2.5%右旋糖酐-硫酸钠（DSS），持续7天。用于实验的小鼠年龄匹配，同时接受DSS治疗。对照组饮用正常饮用水。
组织蛋白酶抑制体内
抑制剂在含有无菌PBS的5%二甲基亚砜（DMSO）中稀释，并在−20°C下保存，直至使用。通过同时腹腔注射5 mg/kg体重来抑制CTSB和CTSL我-从结肠炎诱导后的第3天开始，每天7天内，针对CTSB的反式环氧琥珀酰基-Ile-Pro-OH丙胺（CA-074）（德国莱茵州韦尔市巴舍姆）和针对CTSL的5 mg/kg体重的Z-Phe-Tyr-aldehyde（巴舍姆）。同时抑制CTSB和CTSL的原因是，由于关于半胱氨酸型组织蛋白酶潜在重叠底物特异性的信息相互矛盾，因此很难验证CTSB与CTSL特定的作用。
根据相同方案，通过腹腔注射10 mg/kg体重的合成胃蛋白酶抑制素A（英国汉普郡Chemicon）来抑制CTSD。对照组接受PBS和相应体积的DMSO。每组由五只小鼠组成。
小鼠组织学评分的评估
为了评估组织学评分，移除结肠远端三分之一处的1cm，并按照描述进行评分[26]. 分别对小鼠进行评分。每个分数代表两个部分的平均值。组织学检查是盲法进行的。
统计分析
数据表示为平均值±标准偏差（s.d.）或平均值的标准误差（s.e.）。使用SigmaPlot 8·0进行统计分析t吨-测试和spss软件适用于Windows版本12.0。在P（P）-值<0.05。
结果
CTSB和CTSL mRNA在人IMAC中的表达
采用RT-PCR方法分析IBD患者正常和炎症粘膜IMAC中CTSB和CTSL mRNA的表达。我们发现CTSD mRNA仅在从炎症粘膜中分离的IMAC中表达，与此相反，所有样本的IMAC都有CTSB和CTSL mRNA表达().
（a） 一名无炎症（NI）粘膜患者和两名炎症性肠病（IBD）患者[溃疡性结肠炎（UC）、克罗恩病（CD）]CD33阳性肠巨噬细胞（IMAC）中组织蛋白酶B和L mRNA的表达。如图所示，CTSB、CTSL和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。阳性对照（+）：酶切CTSB或CTSL DNA片段的凝胶提取；阴性对照（–）：无DNA。本实验分别与不同患者的IMAC独立进行三次。（b） 对照组（NI）和IBD患者IMAC中CTSB和CTSL表达分析。从粘膜标本的IMAC中分离mRNA，通过逆转录和扩增塔克man®–PCR。如图所示，组织蛋白酶/GAPDH mRNA比率（任意单位）。每个方框包含每个患者三重mRNA定量的平均值。显示了接受测试的患者数量。对照组和IBD患者IMAC中均检测到CTSB和CTSL的表达。CTSL在IBD中的表达显著增加(*P（P）< 0·05). CTSB在IBD中有较高表达的趋势。
然而，当我们使用塔克Man®–PCR显示，与对照粘膜IMAC相比，IBD IMAC中CTSL的表达显著上调，高达10倍(). IBD粘膜中CTSB的mRNA表达也有增加的趋势；然而，由于炎症相关IMAC中CTSB mRNA表达的高度变异性，这种差异并不显著。结合我们对CTSD mRNA表达的研究结果，这些结果表明在粘膜炎症期间IMAC组织蛋白酶mRNA的诱导。
CTSL蛋白在人粘膜中的蛋白表达
用免疫组织化学方法比较无炎症和严重炎症的人结肠标本中CTSL的蛋白表达。在组织学无火焰粘膜患者的标本中检测到CTSL蛋白()以及UC患者的炎症粘膜组织()和CD患者(). CTSL阳性细胞在上皮下聚集，优先位于隐窝附近。在同型中没有检测到特殊染色(). 粘膜溃疡和单核细胞聚集区CTSL阳性细胞数量较高().
免疫组织化学法检测人肠粘膜组织蛋白酶L（CTSL）表达细胞。用NovaRED（棕色）和巨噬细胞标记物CD68（盐酸联苯胺（BDHC）（蓝色反应产物）观察CTSL阳性细胞。（a） 对照粘膜中的单色CTSL阳性细胞（棕色）。用苏木精对细胞进行复染。（b–e）对照组（b）、溃疡性结肠炎（UC）（c，d）和克罗恩病（CD）（e）患者的粘膜中，CTSL（棕色）可与巨噬细胞（蓝色）共存。黑色箭头表示双染色细胞。CTSL阳性巨噬细胞聚集在严重炎症和组织损伤区域（c，e）。（f） 同型对照（无火焰粘膜）。（g） 对照粘膜中的单染色巨噬细胞（蓝色）。在第一步免疫染色中，未检测到CTSL同型对照抗体的免疫染色（棕色）。原始放大倍数为200×（a，b，c，f）和400×（d，e，g）。该图代表了另外两个实验。
为了鉴定表达CTSL的细胞类型，我们应用了双标记免疫组织化学。我们之前已经证明，IBD患者的IMAC表达CTSD[12]. CTSL阳性细胞的分布()导致我们认为他们很可能是IMAC。CD68被用作特征性巨噬细胞标记物，BDHC显示为细胞内蓝色沉积物(). 在CD68阳性的IMAC中检测到无火焰粘膜组织和IBD患者粘膜中的CTSL。此外，可见少量CTSL阴性IMAC().
进行了三种同型染色：用相应的同型抗体替换初级抗CTSL抗体，或用抗CD68抗体或两者替换。如果使用同种型对照抗体代替抗CD68，则在粘膜中仅检测到CTSL阳性细胞的棕色免疫染色。当两种主要抗体都被替换时，CTSL和CD68免疫染色均未检测到(). 用同型抗体替换抗CTSL抗体后，只检测到蓝色CD68免疫抑制().
CTSB在人粘膜中的蛋白表达
通过免疫荧光染色比较无炎症和严重炎症的结肠标本的CTSB蛋白表达。在组织学无火焰粘膜标本中检测到CTSB蛋白()以及UC患者的炎症粘膜组织()和CD患者(). 通过用同型对照物替代一级抗体，未检测到免疫荧光（数据未显示）。对三名对照组和三名因CD或UC而出现严重炎症的患者的标本进行CD68染色。CTSB蛋白的表达可定位于IMAC的无火焰粘膜(（合并）和UC患者的组织(，合并）和CD患者(，合并）。表达IMAC的CTSB在溃疡和组织损伤区域再次聚集。
免疫荧光检测非炎症性肠病（NI）患者和炎症性肠疾病（IBD）患者的人类肠粘膜中组织蛋白酶B（CTSB）表达细胞。石蜡包埋切片对CTSB（绿色）、巨噬细胞特异性CD68（红色）和二氨基苯吲哚（DAPI）进行荧光单染和双染。在NI患者（a）、溃疡性结肠炎患者（b）和克罗恩病患者（c）的粘膜中检测到表达CTSB的肠巨噬细胞（IMAC）。白色箭头表示双染色细胞。原始放大倍数400×。该图代表了另外两个实验。
通过三种同型对照物，用主要抗CTSB抗体替换、抗CD68抗体替换或用相应的同型抗体两者替换，可确保特异性免疫染色（数据未显示）。
由于CTSB和CTSL（以及CTSD，此处未显示）的蛋白表达与炎症和粘膜损伤相关，我们打算通过抑制小鼠DSS模型中的蛋白酶来研究组织蛋白酶对结肠炎病理生理学的贡献。
实验性结肠炎中CTSD活性的抑制
在急性DSS结肠炎模型中研究了IMAC-CTSD表达对结肠炎病理生理学的贡献以及CTSD抑制对肠道炎症的影响。小鼠接受DSS治疗7天，并从第3天起用胃蛋白酶抑制素A治疗7天。第10天处死小鼠，评估结肠长度和组织学评分。在非抑制剂治疗的结肠炎组中，肛门发炎和血性腹泻等特征性结肠炎症状最为突出，而在胃蛋白酶抑制素A治疗的动物中，这些症状几乎不存在。
CTSD抑制可改善DSS诱导的结肠炎的所有参数。对照组动物在实验期间接受水代替DSS溶液，但体重没有明显减轻(). PBS治疗的结肠炎组体重减轻了17.1%与pepstatin A治疗组的9.3%，P（P）< 0·001 (). 结肠炎后结肠长度通常会缩短。与胃蛋白酶抑制素A治疗组相比，未治疗结肠炎小鼠的结肠长度（9.6±1.1cm）显著缩短（11.0±1.3cm，P（P）= 0·039;). 没有DSS诱导的结肠炎的小鼠结肠长度正常，H为12.5±1.3 cm2O/PBS组，H组为12.7±0.9 cm2O/胃蛋白酶抑制素A组(). 未经治疗的结肠炎小鼠的组织学评分（HS）为3.6±0.5与胃蛋白酶抑制素A治疗组为2.1±0.8，P（P）< 0·03 (). 正如预期的那样，未经DSS治疗的小鼠没有发生炎症，PBS组的组织学评分为0.6±0.9，胃蛋白酶抑制素a治疗组为0.4±0.4。值得注意的是，DSS/PBS对照组的所有小鼠（100%）都出现了上述典型结肠炎症状的强烈炎症，而在抑制剂治疗组中，只有五分之二的小鼠（40%）出现了这种炎症症状。组织切片如所示DSS诱导的结肠炎小鼠出现严重炎症，组织破坏明显，单核细胞浸润()而胃蛋白酶抑制素A处理的小鼠只有轻微炎症()没有溃疡的迹象。未经DSS治疗的小鼠未发生炎症().
抑制剂处理小鼠的体重过程与PBS治疗对照小鼠。由于死亡或提前杀死四只小鼠导致从第8天起体重曲线发生误导性变化，因此只显示了实验前7天的体重。箭头表示第一剂胃蛋白酶抑制素A。数据点为各组的平均值±平均值的标准误差(n个= 5). 右旋糖酐-硫酸盐-钠/磷酸盐缓冲盐水（DSS/PBS）组的体重变化表现出显著差异与DSS/胃蛋白酶抑制素A组（方差分析，P（P）<0.001）以及与H2O/胃蛋白酶抑制素A组（方差分析，P（P）= 0·006).
有和没有实验性结肠炎的pepstatin A处理的小鼠（三角形）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的小鼠（圆形）的结肠长度。水平线表示平均值。除右旋糖酐-硫酸盐-钠/PBS组包含四只小鼠外，每组包含五只小鼠(*P（P）= 0·039).
右旋糖酐-硫酸钠诱导小鼠结肠炎的组织学表现。根据组织学评分（HS）为2.1±0.8（灰色三角形），消化抑素A治疗的结肠炎小鼠出现炎症，而磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗的对照组出现炎症，根据3.6±0.5（严重炎症，黑圈）。没有结肠炎但用抑制剂（深灰色三角形）和PBS处理的对照（灰色圆圈）处理的小鼠没有出现炎症。水平线表示每组的平均值。评分由一名独立人员（F.O.）进行盲法评分(*P（P）< 0·03).
苏木精和伊红（H&E）染色的小鼠结肠组织相邻切片的显微照片。（a） 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的右旋糖酐-硫酸钠（DSS）-结肠炎小鼠的结肠切片；（b） 胃蛋白酶抑制素a治疗的DSS-结肠炎小鼠结肠切片；（c） 接受纯净水和胃蛋白酶抑制素a处理的小鼠结肠；（d） 接受纯净水和PBS治疗的小鼠结肠。在胃蛋白酶抑制素a治疗的小鼠中发现粘膜增厚、淋巴滤泡增大和炎性细胞积聚显著减少。放大100倍。
实验性结肠炎中CTSB和CTSL活性的抑制
为了测试CTSB和CTSL是否有助于肠道粘膜的炎症和组织损伤，研究了抑制剂对DSS诱导的结肠炎的治疗作用。小鼠在饮用水中接受DSS 7天。从第3天到第9天，同时腹腔注射特定抑制剂CA-074（用于CTSB）和Z-Phe-Tyr-aldehyde（用于CTSL），以联合抑制CTSB和CTSL。
每天测量体重，第10天终止实验，评估结肠长度和组织学评分。在所有测试参数中，抑制剂降低了结肠炎的严重程度。非抑制剂治疗的DSS组中，肛门发炎和血性腹泻等特征性结肠炎症状显著。
未经治疗的DSS组10天后体重减轻25%与抑制剂治疗组为6%(;P（P）< 0·01). 未治疗组结肠长度为9.1±1.2 cm与治疗组为10.6±0.8cm(;P（P）< 0·048). 未经治疗的动物的组织学评分为3.5±0.5，而抑制剂治疗组为1.8±1.3(,P（P）= 0·029). 在DSS/PBS对照组中，所有小鼠（100%）都出现了典型的结肠炎症状，表现为肛门发炎和血性腹泻。值得注意的是，在抑制剂治疗组（DSS/抑制剂）中，五分之一（20%）的小鼠甚至出现了可见的肠道炎症。在未经治疗的结肠炎小鼠中，组织切片显示严重炎症，粘膜严重破坏，伴有溃疡、大淋巴滤泡、粘膜下层增厚和浸润细胞()而抑制剂治疗组仅出现轻度炎症().
抑制剂处理小鼠的体重过程与磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的对照小鼠。组织蛋白酶B（CTSB）和CTSL同时腹腔注射，CTSB每天给予5 mg/kg CA-074，CTSL每天给予Z-Phe-Tyr-alded。箭头表示抑制剂的第一剂量。经抑制剂处理的小鼠（开环）体重减轻显著降低与PBS处理的对照组（实心圆圈）（方差分析，P（P）< 0·01). 数据点是每组的平均值±平均值的标准误差(n个= 5).
组织蛋白酶B（CTSB）和CTSL-抑制剂处理的小鼠（开环）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的对照小鼠（填充环）的结肠长度。水平线表示每组的中值(*P（P）=0.48）。
（a） 抑制剂治疗小鼠和磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗小鼠的组织学评分（HS），无论是否患有实验性结肠炎。抑制剂处理的右旋糖酐-硫酸钠（DSS）-结肠炎小鼠的HS为1.8±1.3，而PBS处理的对照组HS为3.5±0.5（严重炎症）。水平线表示每组的平均值(n个= 5). 评分由一名独立人员（F.O.）进行盲法评分(*P（P）= 0·029). （b） 苏木精和伊红染色的小鼠结肠组织相邻切片的显微照片。（i） 用PBS治疗的DSS-结肠炎小鼠的结肠切片。结肠炎的特征是粘膜增厚，淋巴滤泡大，炎症细胞大量涌入。（ii）用抑制剂治疗的DSS-脊髓灰质炎小鼠的结肠切片。放大100倍；m、 肠粘膜；f、 淋巴滤泡。
讨论
在本论文中，我们展示了（1）在粘膜炎症期间诱导IMAC中CTSL（以及在较小程度上CTSB）的表达，以及（2）IMAC产生的蛋白酶CTSD、CTSB和CTSL的重要病理生理作用，因为它们在DSS诱导的结肠炎中受到抑制后，疾病得到明显改善。为了证明在IMAC中存在CTSB和CTSL，我们使用人类组织样本中的巨噬细胞标记CD68进行了双重标记免疫组织化学。
组织蛋白酶在炎症性疾病中的参与先前已经被证实[15–18]. 在通过消减杂交和亲和矩阵分析进行的mRNA筛选中，我们发现IBD患者IMAC中组织降解酶的诱导和CTSD的特异性诱导与控制粘膜[8,12]. 与对照组相比，用胃蛋白酶抑制素A抑制CTSD后，抑制剂处理的小鼠的炎症得到改善，表现为体重减轻较少，结肠缩短和组织学评分较低。同样，使用特定CTSB抑制剂CA-074和特定CTSL抑制剂Z-Phe-Tyr-aldehyde同时抑制CTSB和CTSL可降低炎症程度，如相同参数所示。
天冬氨酸蛋白酶CTSD是半胱氨酸蛋白酶家族的一员。与其他蛋白酶不同，蛋白酶主要是分泌性蛋白质，Pro-CTSD被分类到溶酶体。在正常生理条件下，Pro-CTSD和CTSD均不会分泌，也不会在细胞外发现。溶酶体半胱氨酸蛋白酶CTSB和CTSL参与胞外和胞内蛋白质的降解。CTSB和CTSL还参与抗原处理，与CTSD协同作用，并在主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类限制性抗原提呈期间形成肽受体二聚体[27,28]. 组织蛋白酶B、D、H和L的蛋白水解活性在从II类分子上的较大多肽产生抗原肽到T细胞中起着重要作用[27,28]. 包括组织蛋白酶B、L和D在内的几类蛋白酶被认为参与了蛋白质的溶酶体周转，同时降解基底膜和周围ECM[29]. CTSB被认为是其他蛋白酶的激活剂，而蛋白酶反过来又介导降解过程[30]. 与CTSD不同，组织蛋白酶B和L是分泌蛋白。在干扰素-γ处理的巨噬细胞和脂多糖（LPS）激活的树突状细胞（DC）中观察到，炎症刺激上调成熟CTSL的细胞外积累[31].
巨噬细胞动员蛋白酶并参与ECM在许多组织破坏性疾病中的病理生理重塑，例如关节炎、骨吸收或转移。CTSB和CTSL表达CD68阳性的人类单核细胞在类风湿关节炎患者中发挥重要作用，参与关节破坏和骨侵蚀[32]. 蛋白酶如人肺泡巨噬细胞-CTSL对ECM的重塑被认为在肺气肿中发挥作用[33]. 此外，在慢性肺部炎症期间，分离的肺泡巨噬细胞中组织蛋白酶L、B、H和S的活性强烈增加[34]. 小鼠急性腹膜炎诱导后，腹腔巨噬细胞中的CTSB活性受到刺激[35]. 我们的数据现在也表明组织蛋白酶在IBD中的病理生理作用。由于这些蛋白酶由IMAC表达，这进一步突出了这些细胞的作用。
组织蛋白酶如何参与炎症性肠病的病理生理学？通过其对分泌的CTSB和CTSL的细胞外和细胞内蛋白的蛋白水解活性，以及巨噬细胞损伤或凋亡，释放的CTSD可能破坏ECM成分，导致组织破坏、粘膜损伤、屏障缺陷和细菌入侵。在健康个体中，组织蛋白酶的蛋白水解作用仅限于细胞过程和代谢中受控的蛋白质降解。在IBD患者中，组织蛋白酶的蛋白水解也可能由细菌入侵触发，导致组织破坏和炎症。
我们的数据表明，IMAC衍生组织蛋白酶不仅可能在IBD的病理生理学中发挥重要作用；它们也为IBD治疗提供了一个新的靶点。迄今为止，大多数治疗策略的目的是通过抑制T细胞（或巨噬细胞）来减少炎症，而我们的数据支持另一种抑制组织破坏的概念。组织蛋白酶是治疗的理想靶点。在细胞内，它们发挥着重要作用，尤其是对巨噬细胞功能。出生后不久，CTSD基因敲除导致死亡[24]. CTSB和CTSL的联合纯合缺失在出生后第二周到第四周也是致命的。杂合组织蛋白酶敲除不显示异常表型，也不致命[36].
另一方面，我们设置中使用的抑制剂不会穿过细胞膜，而是留在细胞外。这意味着在治疗方法中，组织蛋白酶的细胞外作用可以被选择性地阻断，而组织蛋白酶在细胞内的基本功能保持不变。
致谢
本研究得到了德国联邦科学院（SFB 585，Ro 1236/3-2）和BMBF Kompetenznetz–CED（G.R.，H.H）的支持。我们感谢雷根斯堡大学外科以及内镜科的内镜医生和护士的出色合作。
工具书类
1Caradona L、Amati L、Magrone T、Pellegrino NM、Jirillo E、Caccavo D.炎症性肠病中的肠道细菌、脂多糖和相关细胞因子：生物学和临床意义。内毒素研究杂志。2000;6:205–14.[公共医学][谷歌学者] 2Pavli P、Van de Maxwell LPE、Doe F.人类结肠树突状细胞和巨噬细胞的分布。临床实验免疫学。1996;104:124–32. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Hausmann M、Kiessling S、Mestermann S等。Toll样受体2和4在肠道炎症期间上调。胃肠病学。2002;122:1987–2000.[公共医学][谷歌学者] 4Rogler G，Hausmann M，Spottl T.T细胞共同刺激分子在炎症性肠病粘膜的肠巨噬细胞上上调。欧洲胃肠病肝病杂志。1999;11:1105–11.[公共医学][谷歌学者] 5Ingalls RR、Arnaout MA、Delude RL、Flaherty S、Savedra R、Jr、Golenbock DT。CD11/CD18整合素：三种新型LPS信号受体的特征。临床生物研究进展。1998年；397:107–17.[公共医学][谷歌学者] 6Rugtveit J，Bakka A，Brandtzaeg P.人类炎症性肠病（IBD）粘膜巨噬细胞亚群中B7.1（CD80）和B7.2（CD86）共刺激分子的差异分布临床实验免疫学。1997;110:104–13. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Rogler G，Andus T，Schoelmerich J.肠道巨噬细胞。编辑：Emmrich J、Liebe S、Stange EF。炎症性肠病的创新概念。柏林：斯普林格·弗拉格；1999年，第111-19页。[谷歌学者] 8Hausmann M、Spottl T、Andus T等。减法筛选显示克罗恩病肠道巨噬细胞中NADPH氧化酶表达上调。临床实验免疫学。2001;125:48–55. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9LeFevre ME，Hammer R，Joel DD。哺乳动物小肠巨噬细胞：综述。网织内皮细胞杂志。1979;26:553–73.[公共医学][谷歌学者] 10Rugtveit J、Haraldsen G、Hogasen AK、Bakka A、Brandtzaeg P、Scott H。炎症性肠病肠道巨噬细胞的呼吸爆发主要由CD14+L1+单核细胞衍生细胞引起。内脏。1995;37:367–73. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Rogler G、Brand K、Vogl D等。核因子-κB在炎症肠粘膜的巨噬细胞和上皮细胞中被激活。胃肠病学。1998年；115:357–69.[公共医学][谷歌学者] 12Hausmann M、Obermeier F、Schreiter K等。组织蛋白酶D在炎症性肠病巨噬细胞中上调。临床实验免疫学。2004;136:157–67. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Yamaguchi N，Chung SM，Shiroeda O，Koyama K，Imanishi J.人胰腺癌细胞系HPC-YP分泌组织蛋白酶1样酶的特性。癌症研究。1990;50:658–63.[公共医学][谷歌学者] 14Mason RW、Johnson DA、Barrett AJ、Chapman HA。人组织蛋白酶L的弹性水解活性。生物化学杂志。1986;233:925–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Liaudet-Coopman E、Beaujouin M、Derocq D等。组织蛋白酶D：一种长期存在的天冬氨酸蛋白酶在癌症和凋亡中的新发现功能。癌症快报。2005年，第1-13页。[公共医学] 16Ishibashi O、Mori Y、Kurokawa T、Kumegawa M。乳腺癌细胞表达组织蛋白酶B和L，但不表达组织酶K或H。癌症生物化学。1999;17:69–78.[公共医学][谷歌学者] 17Kakegawa H、Nikawa T、Tagami K等。组织蛋白酶L参与骨吸收。FEBS信函。1993;321:247–50.[公共医学][谷歌学者] 18达菲·MJ。蛋白酶作为癌症的预后标志物。临床癌症研究。1996;2:613–8.[公共医学][谷歌学者] 19Murnane MJ，Sheahan K，Ozdemirli M，Shuja S.人类结直肠癌组织蛋白酶B信使RNA含量的分期特异性增加。癌症研究。1991;51:1137–42.[公共医学][谷歌学者] 20Campo E、Munoz J、Miquel R、Palacin A、Cardesa A、Sloane BF、Emmert-Buck MR。大肠癌中组织蛋白酶B的表达与肿瘤进展和患者生存期缩短相关。美国病理学杂志。1994;1145：301–9。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21McGrath ME，溶酶体半胱氨酸蛋白酶。生物物理生物分子结构年鉴。1999;28:181–204.[公共医学][谷歌学者] 22Fiebiger E、Maehr R、Villadangos J等。恒定链控制细胞外组织蛋白酶L的活性。《实验医学杂志》。2002;196:1263–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Briozzo P、Badet J、Capony F等。MCF7乳腺癌细胞对bFGF反应并在其从细胞外基质释放后将其内化：组织蛋白酶D的许可作用。实验细胞研究。1991;194：252–9。[公共医学][谷歌学者] 24Koike M，Nakanishi H，Saftig P，等。组织蛋白酶D缺乏诱导小鼠中枢神经系统神经元中类蜡样脂褐素的溶酶体储存。神经科学杂志。2000;20:6898–906. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Rogler G、Hausmann M、Vogl D等。结肠巨噬细胞的分离和表型特征。临床实验免疫学。1998年；112:205–15. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Stedler L、Hans W、Schotte L、Neirynck S、Obermeier F、Falk W、Fiers W、Remaut E。小鼠结肠炎的治疗乳酸乳球菌分泌白细胞介素-10。科学。2000;289:1352–5.[公共医学][谷歌学者] 27Bryant PW、Lennon Dumenil AM、Fiebiger E、Lagaudriere-Gesbert C、Ploegh HL。MHC II类分子的蛋白质水解和抗原提呈。高级免疫学。2002;80:71–114. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Lennon Dumenil AM、Bakker AH、Wolf-Bryant P、Ploegh HL、Lagaudriere-Gesbert C。蛋白质水解和MHC-II类限制性抗原呈递的详细研究。Curr Opin免疫学。2002;14:15–21.[公共医学][谷歌学者] 29腺体A、Huet G、Zerimech F、Hecquet B、Balduyck M、Peyrat JP。大肠癌中组织蛋白酶B、L和D的活性：与临床病理参数的关系。癌症快报。1995;96:267–75.[公共医学][谷歌学者] 30Kirschke H、Barrett AJ、Rawlings ND、Cathepsin B酶代码EC3.4.22.1。蛋白质概况。1995. [公共医学] 31Beers C、Honey K、Fink S、Forbush K、Rudensky A。干扰素γ治疗巨噬细胞中组织蛋白酶S和组织蛋白酶L的差异调节。《实验医学杂志》。2003;197:169–79. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Kaneko M、Tomita T、Nakase T等。类风湿关节炎破坏性关节软骨下骨区域蛋白酶和炎性细胞因子的表达。风湿病学（Oxf）2001;40:247–55.[公共医学][谷歌学者] 33Shapiro SD、Campbell EJ、Welgus HG、Senior RM。单核吞噬细胞降解弹性蛋白。Ann NY科学院。1991;624:69–80.[公共医学][谷歌学者] 34Koslowski R，Knoch KP，Wenzel KW。大鼠肺纤维化发展过程中的蛋白酶和蛋白酶抑制剂。临床化学学报。1998年；271:45–56.[公共医学][谷歌学者] 35Lesser M，Chang JC，Orlowski M.组织蛋白酶B和D在受刺激的腹腔巨噬细胞中的活性。分子细胞生物化学。1985;69:67–73.[公共医学][谷歌学者] 36Felbor U、Kessler B、Mothes W等。缺乏组织蛋白酶B和L的小鼠的神经缺失和脑萎缩。美国国家科学院程序。2002;99:7883–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
