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EMBO J。2003年8月15日；22(16): 4212–4222.
数字对象标识：10.1093/emboj/cdg417
预防性维修识别码：项目经理175806
PMID：12912919

逆转人类细胞衰老：p53和p16通路的作用

Christian M.Beauséjour先生,1 安娜·克托利卡,1 弗朗西斯科·加利米,2,3 成田正史,4 斯科特·劳伊,4 保罗·亚斯温,1和朱迪斯·坎皮西1,5,6
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

端粒侵蚀和随后的功能障碍通过一个称为复制性衰老的过程限制正常人类细胞的增殖。复制性衰老被认为通过建立一种基本上不可逆的生长停滞来抑制肿瘤的发生，这种生长停滞需要p53和pRB抑癌蛋白的活性。我们表明，依赖于pRB调节器p16的表达，复制性衰老不一定是不可逆的。我们使用慢病毒在衰老的人成纤维细胞和乳腺上皮细胞中表达特定的病毒和细胞蛋白。端粒酶的表达并没有逆转衰老停滞。然而，衰老时p16水平低的细胞在p53失活后恢复强劲生长，在致癌RAS表达后限制生长。相反，衰老时高水平p16的细胞在p53失活或RAS表达时未能增殖，尽管它们在pRB失活后重新进入细胞周期而没有生长。我们的结果表明，端粒功能障碍引起的衰老反应是可逆的，主要由p53维持。然而，p16为人类细胞的无限生长提供了一个主要的第二屏障。

关键词：细胞周期素依赖性激酶/pRB/RAS/衰老/端粒酶

介绍

正常细胞不会由于一个称为复制衰老的过程而无限期分裂。人类细胞复制衰老的一个重要机制是端粒的侵蚀和最终功能障碍(Harley等人，1990年;德兰格，2001). 端粒是DNA序列和相关蛋白质，它覆盖并稳定线性染色体末端，防止DNA修复系统降解或融合。由于DNA复制的生物化学作用，每个细胞周期都会丢失几十个端粒DNA碱基对。因此，增殖细胞会经历渐进性的端粒缩短，除非它们表达端粒酶，而端粒酶可以将端粒序列添加到染色体末端从头开始大多数人类细胞不表达这种酶，因此可以获得极短且功能失调的端粒。端粒功能异常提示正常细胞停止增殖，表现出典型的衰老表型(布莱克本，2001年;Shay和Wright，2001年;Kim等人，2002年)。

复制性衰老是一个更普遍的过程的例子，本文称之为细胞衰老，它在许多刺激下阻止细胞生长。这些刺激包括端粒功能失调、DNA损伤、染色质组织破坏和某些癌基因，如激活的RAS(坎皮西等2001年;Serrano和Blasco，2001年). 它们具有启动或促进肿瘤转化的潜力。细胞衰老和复制性衰老需要p53和pRB抑癌蛋白的活性，它们调节大多数（若不是全部）哺乳动物癌症发生突变的途径。失去p53和pRB功能的人类细胞通常对多种衰老诱导刺激不起作用(塞拉诺等1997年;迪姆里等., 2000). 这些和其他证据表明，衰老反应抑制了哺乳动物癌症的发展(Reddel，2000年;坎皮西等., 2001;Wright和Shay，2001年)。

尽管p53和pRB对建立衰老生长停滞期显然至关重要，但它们在这一过程中的确切作用尚不完全清楚。p53被认为是将功能失调的端粒感知为受损的DNA，因此它至少部分通过增加p21细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）的表达来诱导衰老反应；p21反过来阻止pRB的磷酸化和失活(谢尔和罗伯茨，1999年). 然而，p53或pRB的失活（例如通过病毒癌蛋白或反义寡核苷酸）独立地延长了许多人类细胞的复制寿命，尽管端粒较短，但仍允许它们增殖(哈拉等., 1991;谢伊等., 1991). 因此，尽管p53和pRB途径相互作用，但它们也可能单独起作用以阻止衰老。事实上，据报道，衰老细胞上调另一种CDKI，p16，它也控制pRB活性(阿尔科尔塔等., 1996;哈拉等.，1996年a;斯坦因等., 1999). p16可能通过一种与p53不同的机制限制细胞增殖，因为一些人类上皮细胞（例如乳腺组织外植体的初始生长）衰老，端粒相对较长，p16表达较高(Kiyono公司等., 1998;拉米雷斯等., 2001). 此外，端粒酶的异位表达并不能保护这些细胞免于复制性衰老，这表明p16的表达和功能与端粒状态无关(Kiyono公司等., 1998;莱茵瓦尔德等., 2002)。

p53和pRB对维持衰老生长停滞也很重要，在人类细胞中，衰老生长停滞被认为是不可逆的。衰老的人类细胞因G1DNA含量，不能被生理有丝分裂原刺激分裂。此外，尽管有效的病毒癌蛋白SV-40 T抗原刺激衰老的人成纤维细胞中的DNA复制，但它并不刺激细胞增殖(艾德等., 1983;戈尔曼和克里斯托法罗，1985年). T抗原结合并灭活p53和pRB，p53或pRB结合缺陷的突变体不能刺激衰老细胞中的DNA合成(坂本等., 1993;哈拉等1996年b). 对这些发现的一种解释是，p53和pRB协同阻止衰老细胞启动S期，但另一种活性阻止细胞周期的完成。另一方面，当微量注射到衰老细胞中时，p53抗体可以刺激DNA合成并限制增殖(Gire和Wynford-Thomas，1998年). 因此，保持延缓衰老的要求不如建立延缓衰老的规定明确。

我们最近发现，人类成纤维细胞对BMI-1的敏感性不同，BMI-1是一种癌基因，通过抑制p16延长成纤维细胞的复制寿命，这显然是因为它们在衰老时表达的p16水平不同(伊塔哈纳等., 2003). 这一发现提出了一种可能性，即人类细胞株在维持衰老状态的机制上也有所不同。为了探索这种可能性，并了解维持衰老停滞的机制，我们使用慢病毒在复制性衰老的人类成纤维细胞中表达病毒和细胞蛋白。我们的结果表明，端粒功能障碍引起的衰老停滞是可逆的，主要由p53维持，并由p53失活逆转。然而，在一些人类细胞中，p16为细胞增殖提供了一个显性的、明显不可逆的第二道屏障，这无法通过随后的pRB失活来完全克服。

结果

端粒酶不能逆转衰老生长停滞

我们测试的第一个逆转衰老生长停滞的候选基因是端粒酶的催化亚单位和速率限制成分hTERT(Bodnar等人，1998年;Vaziri和Benchimol，1998年). 在这些实验和随后的实验中，我们使用了两种人类成纤维细胞株：来自胎肺的WI-38（WI）和来自新生儿包皮的BJ（BJ）。两种菌株均不表达内源性TERT（地形）端粒重复序列扩增协议（TRAP）检测结果显示，这两种基因均缺乏可检测的端粒酶活性。

我们传代了前基因（早期传代）培养物（P-WI，P-BJ），直到复制性衰老。除非另有说明，衰老培养物（S-WI，S-BJ）中含有>99.9%的非分裂细胞，这是由超过4周的细胞数量没有增加和<1%确定的[3H] 胸腺嘧啶标记的细胞核经过3天的标记间隔（%LN）。为了表达hTERT和其他蛋白质，我们使用慢病毒，慢病毒能有效感染非分裂细胞并稳定表达基因(布克林斯基等., 1993). 我们通过感染具有同等滴度的表达绿色荧光蛋白（GFP）的病毒的平行培养物（见材料和方法）来验证感染效率，并在可能的情况下，对病毒表达的蛋白进行免疫染色。在所用的滴度下，慢病毒在前基因和衰老培养物中均能转导>95%的细胞。

表达hTERT的慢病毒（lent-hTERT）在S-WI细胞上赋予了强大的端粒酶活性，而感染lent-GFP的S-WI电池则没有端粒酶活动（图1A） ●●●●。相比之下，需要细胞增殖才能整合和表达的pBabe-hTERT未能赋予S-WI细胞端粒酶活性，尽管它赋予P-WI细胞强大的活性（图1A） ●●●●。

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图1。hTERT不能逆转衰老表型。(A类)Lenti-hTERT赋予端粒酶活性。衰老（S）或前基因（P）WI-38（WI）细胞感染了lent-hTERT、lent-GFP或pBABE-hTERT，并按照材料和方法中的描述，使用TRAP试验测量端粒酶活性为阳性TRAP对照，‘–’和‘热失活’为阴性对照。(B)Lenti hTERT改变衰老前期细胞的端粒长度，但不改变衰老细胞的端粒长度。如材料和方法中所述，测定用慢-GFP（GFP）或慢hTERT（hTERT）感染的P-或S-WI细胞中的末端限制性片段（TRF）长度。(C类)Lenti-hTERT不会改变衰老形态。S-WI细胞被lent-GFP（+GFP）或lent-hTERT（+hTERT）感染，7天后观察并拍照。

感染了lent-hTERT的S-WI细胞没有增殖（图2A） 尽管表达了高水平的端粒酶。此外，它们没有失去衰老的形态（图1C） 或衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-Bgal）表达(迪姆里等., 1995)（未显示）。当S-BJ细胞被慢hTERT感染时，获得了相同的结果（图2B、 和结果未显示）。Lenti-hTERT并没有改变S-WI细胞的平均端粒长度，即使在感染后6周内进行检测；然而，同样的病毒拉长了P-WI细胞中的端粒（图1B） 表明该病毒表达了功能性hTERT蛋白。

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图2。p53失活可逆转BJ的衰老，但不能逆转WI-38成纤维细胞的衰老。(A类)S-WI细胞合成DNA，但不增殖。S-WI细胞被表达GFP、hTERT、GSE、LgT、LgTK1和CDK4m的慢病毒感染；72小时后，用%LN测定DNA合成，并监测生长百分比，如文中所述。(B)S-BJ细胞合成DNA并增殖。如（A）所述，感染并监测S-BJ细胞。(C类)对照和挽救S-BJ细胞的形态学。6天后拍摄感染GFP或表达GSE慢病毒的S-BJ细胞。(D类)寿命分析。S-BJ细胞被表达指示蛋白的慢病毒感染，连续传代，并在每次传代时测定细胞数，如材料和方法中所述。

这些结果得出了两个重要结论。首先，在缺乏细胞增殖的情况下，端粒酶不能修饰人类端粒。其次，端粒酶不能逆转复制性衰老细胞的生长停滞或衰老表型。

p53失活逆转BJ细胞的衰老，但不逆转WI-38细胞的衰老

众所周知，p53或pRB通路的失活可以延缓但不能阻止人类成纤维细胞的复制性衰老(赖特和谢，2001年). 这两种途径的失活，例如SV-40 T抗原（LgT），会导致危机，一种以基因组不稳定、细胞死亡和最终出现罕见的复制不朽变体为特征的状态(谢伊等., 1993;Wei和Sedivy，1999年)。

为了探索p53和pRB在维持衰老停滞中的作用，我们使用慢病毒在人类细胞中表达以下蛋白质：（i）LgT，它结合并失活p53和pRB(范宁，1992年); （ii）LgT-K1，一种结合p53但不结合pRB或pRB家族成员的LgT突变体(迪卡普里奥等., 1988); （iii）GSE-22，一种以显性负向方式使p53功能失活的肽(古德科夫等., 1993); 和（iv）CDK4m，一种不能结合p16的细胞周期素依赖性激酶4突变体，因此组成性地使pRB失活(沃尔维尔等., 1995)虽然它也可能有其他的动作模式。

与SV-40感染和质粒微量注射实验结果一致(戈尔曼和克里斯托法洛，1985年;坂本等., 1993;哈拉等1996年b)（图2A） ，LgT刺激大量S-WI细胞（60-70%）合成DNA。CDK4m也刺激S-WI中的DNA合成，尽管程度较小（35-40%）。相比之下，GSE-22和LgT-K1基本上处于非活性状态（<5%）。这些数据表明，S-WI细胞在pRB通路失活（通过LgT或CDK4m）后可以重新进入细胞周期，但仅通过LgT-K1或GSE失活p53通路对这些细胞没有影响。然而，无论刺激DNA合成的能力如何，没有一种慢病毒单独或联合有效地刺激S-WI细胞增殖（图2A） ●●●●。我们的结论是，尽管S-WI细胞在pRB途径失活后进入S期，但它们不能完成细胞周期和增殖。

相反，相当一部分S-BJ细胞对四种慢表达蛋白（LgT、LgT-K1、GSE-22和CDK4m）中的每一种都会启动DNA合成（图2B） ●●●●。此外，GSE和LgT-K1与LgT一样有效，每一种都刺激70-90%的细胞（图2B） ●●●●。CDK4m的疗效较差（25-30%）（图2B） ●●●●。最引人注目的是，所有四种慢病毒均刺激S-BJ细胞完成细胞周期并增殖。增殖的程度大致等于DNA合成的程度。通过菌落形成（>50个细胞）评估增殖（图2B） 和衰老形态的丧失（图2C） ●●●●。因此，与S-WI细胞相比，复制性衰老的BJ成纤维细胞的生长停滞是完全可逆的，p53失活足以诱导DNA合成和增殖。

就疗效而言，GSE-22在逆转S-BJ细胞衰老停滞方面比LgT或LgT-K1更有效（图2B） 与LgT和LgT-K1不能完全灭活p53的报道一致(Deppert等人，1987年). 此外，GSE-22刺激S-WI细胞的失败并不是因为不能使这些细胞中的p53失活。GSE-22提高了S-BJ和S-WI细胞中的p53水平，正如其增强p53稳定性的能力所预期的那样(Gudkov等人，1993年); 此外，GSE-22显著降低了两种细胞株中p21的水平，正如p53功能丧失所预期的那样（补充图1，可在欧洲分子生物学组织在线）。有趣的是，CDK4m刺激了S-WI和S-BJ细胞的DNA合成（25-35%），尽管它们对衰老后细胞周期重新进入的要求不同。CDK4m也可能通过螯合p21间接作用于p53阻断(谢尔和罗伯茨，1999年). 与解释CDK4m刺激S-BJ细胞的能力的p21隔离相一致，S-BJ中的大多数p21在感染lent-CDK4后与CDK4共同免疫沉淀（补充图2）。

为了确定GSE、LgT、LgT-K1和CDK4m刺激S-BJ细胞增殖的程度，我们测定了感染后大量培养物的生长情况。GSE刺激>20个额外的种群加倍（PD）（图2D） 。在这种延长生长的末期，合成DNA的细胞比例（%LN）逐渐下降（未显示）。然而，即使细胞数量没有净增加，LN百分比也没有下降到20–25%以下。这种表型（高标记指数，无净增殖）是危机文化的特征(Wei和Sedivy，1999年). LgT和LgT-K1分别刺激10-11个额外的PD（图2D） 也在危机中达到顶峰。由GSE-22驱动的危象培养物显示，凋亡细胞少于由LgT或LgT-K1驱动的培养物（未显示），这可能解释了为什么表达GSE-22的培养物比表达LgT和LgT-K1的培养物完成更多的PD。与其他蛋白质相比，CDK4m刺激的S-BJ细胞增殖非常有限（2-3个PDs）（图2D） 。这一发现表明，尽管CDK4m结合p21可以部分缓解p53阻断（图2B和补充图2），它并不等同于p53失活。

总之，结果表明，p53维持了S-BJ细胞的衰老生长停滞，仅失活p53就足以重置其复制寿命。第三株人成纤维细胞株（82-6，来自皮肤）对p53失活表现出中间反应：20-25%的衰老82-6细胞对GSE-22（未显示）启动DNA合成。所以，一些人成纤维细胞株的表型介于WI-38和BJ之间，这与p53失活导致衰老生长停滞的可逆性有关。

p16通过p53失活防止衰老逆转

为什么S-BJ细胞在p53失活后恢复生长，而pRB未失活，而S-WI细胞即使在pRB和p53均失活的情况下也无法增殖（尽管正在进行DNA合成）？一种可能是衰老时诱导p16的能力存在内在差异。WI-38和一些人类上皮细胞一样，在端粒关键缩短之前，由于p16被尚未确定的因素诱导，似乎经历了复制性衰老(赖特和谢，2001年;伊塔哈纳等., 2003). 因此，p16可能会施加无法通过p53失活来克服的增殖阻滞。与这个想法一致，WI-38细胞表达的p16水平始终高于BJ细胞，无论是前基因还是衰老（图3A和B）。此外，GSE-22从衰老中拯救出来的S-BJ细胞停止了增殖（在超过20个额外的PD后；图2D） p16表达低但显著（图3C） LgT未能将其从第二次生长停滞中解救出来（未显示）。最后，衰老的82-6成纤维细胞在S-WI和S-BJ细胞中间水平表达p16；在被GSE-22拯救后，这些细胞的p16显著低于起始群体（未显示），这表明GSE只拯救了那些表达很少或没有p16的细胞。因此，p16可以通过p53失活阻止衰老阻滞的逆转。

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图3。衰老逆转与p16的表达呈负相关。(A类)p16表达。通过western blotting（WB）检测前基因（P）、衰老（S）BJ和WI-38（WI）细胞中p16和肌动蛋白（对照）的水平。培养物的标记指数如印迹（%LN）所示。(B)p16免疫染色。如材料和方法中所述，对早衰（P）和衰老（S）BJ和WI-38细胞进行p16免疫染色，对细胞核进行DAPI染色。HeLa细胞作为阳性对照。(C类)GSE-22延缓衰老后p16和p21水平的变化。S-BJ细胞感染对照（GFP）或表达GSE-22（挽救的GSE）慢病毒。在增殖时（16个PDs）或增殖停止后（23个PDs）收获挽救的细胞，并通过蛋白质印迹分析p21、p16和肌动蛋白（对照）。(D类)HMEC的衰老逆转。如材料和方法所述，选择后的HMEC被表达所示蛋白质的慢病毒感染，并监测其生长情况。显示感染72小时后的细胞。

对人类乳腺上皮细胞（HMEC）的研究结果支持了这一观点，HMEC是一种p16表达特征良好的培养系统。从组织外植体增殖的HMEC在经历相对较长的端粒和高p16表达的衰老停滞之前，通常只增殖10–25个PDs。然而，可以出现通过甲基化自发沉默p16的变体（自我选择）(哈蒙德等., 1984). 在端粒短且基因组不稳定的衰老之前，HMEC会额外增殖50–75个PDs，这是一种称为痛苦的crislike状态(罗曼诺夫等., 2001). 当LgT或GSE表达时，抗原HMEC恢复增殖，但hTERT不表达（图3D） 与S-BJ成纤维细胞相似。然而，高p16水平停止生长的预选HMEC并没有被LgT从生长停滞中拯救出来（未显示），这表明衰老停滞仅在p16阴性细胞中是可逆的。

抑制p16可通过p53失活逆转衰老

为了更严格地评估p16在延缓衰老中的作用，我们操纵了人成纤维细胞中p16的表达。首先，我们使用RNA干扰(帕迪森等., 2002)稳定抑制WI38细胞中p16的表达。一种能够抑制p16表达的短发夹RNA（shRNA）(成田等., 2003)使用逆转录病毒载体导入增殖（P-WI）细胞。p16 shRNA适度延长了P-WI细胞的复制寿命（3-4个PDs）（补充图3），并且细胞随着p16水平的显著降低而衰老（图4A） ●●●●。p16受抑制的S-WI细胞随着p21水平的升高而衰老（图4A） 这表明它们现在衰老主要是由于p53通路的激活，类似于BJ成纤维细胞的表型。事实上，随后感染lent-GSE-22完全逆转了p16抑制的S-WI细胞的衰老停滞（图4B） ，刺激DNA合成和细胞增殖（>70%）。因此，与GSE-22在表达高p16的S-WI细胞中的作用相反，GSE-22在S-BJ和p16抑制的S-WI细胞中的作用相似（比较图2图A和图B4B） ●●●●。接下来，我们使用慢病毒（lent-p16）在P-WI细胞中体外表达p16。蛋白质印迹（图4C） 免疫荧光（补充图4）显示，lent-p16显著提高了P-WI细胞中p16的表达。如预期(麦康奈尔等., 1998)，lent-p16感染的P-WI细胞生长停滞，形态衰老，SA-Bgal表达（未显示）。随后感染lent-GSE-22未能刺激DNA合成或细胞增殖（补充图5），类似于其在S-WI细胞中的作用。

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图4。p16抑制可逆转WI-38细胞的衰老。(A类)shRNA-p16抑制WI-38细胞中p16的表达。P-WI细胞被模拟感染（-）或感染表达shRNA-p16的pMSCV逆转录病毒，并传代至复制性衰老（S-WI；%LN<1%）。用western blotting（WB）检测p16、p21和肌动蛋白（对照）水平。(B)LN百分比。P-WI被模拟感染（-）或感染表达逆转录病毒（+）的shRNA-p16，并培养至衰老（S-WI）。然后监测细胞在随后感染lent-GSE-22（GSE）使p53失活后合成DNA（%LN）的能力。如材料和方法所述，监测平行培养物的增殖（%增长）。(C类)异位p16表达。P-WI细胞被模拟感染（–）或感染（+）lent-p16；用western blotting（WB）检测p16和肌动蛋白（对照组）。在显示的暴露中，模拟感染的P-WI细胞中的内源性p16无法检测到。

综上所述，这些结果支持这样的观点，即p16对细胞增殖施加了衰老相关的阻滞，而这种阻滞不能通过p53失活来逆转。

p16的顺序动作

众所周知，p16通过pRB发挥作用，特别是通过抑制CDK，从而通过磷酸化阻止pRB失活。然而，通过直接结合使pRB失活的LgT刺激了DNA合成，但不刺激p16表达细胞（S-WI或预选HMEC）的增殖。这一发现增加了p16对细胞增殖的阻滞可能与pRB的持续活性无关的可能性。为了探索p16阻断的性质，我们用lent-p16感染P-WI细胞，并用lent-LgT进行超感染。LgT刺激约40%表达p16的P-WI细胞中的DNA合成（图5A） ，但没有发生细胞增殖（图5A） ●●●●。相比之下，首先感染lent-LgT，然后再次感染lent-p16的P-WI细胞继续合成DNA并增殖（图5B） 尽管p16高表达。LgT的存在或缺失并不影响lent-p16表达的p16水平（未显示）。使用HMEC也获得了类似的结果。LgT在p16上调之前引入时可防止预先选择的HMEC衰老(Huschtsha公司等., 2001). 然而，在HMEC经历了p16诱导的衰老阻滞后引入LgT并没有刺激细胞增殖（未显示）。最后，尽管70–75%的P-WI细胞表达shRNA p16，并培养至衰老，但在GSE-22灭活p53后恢复生长（图4B） 而当p16在已经经历了高表达的衰老的细胞中被下调时，情况并非如此。我们构建了一种慢病毒来表达shRNA-p16，并用它下调S-WI细胞中的p16。然后我们用lent-GSE-22超感染细胞。虽然GSE-22刺激了DNA合成，但很少有细胞（～1–2%）恢复增殖（图5C） ●●●●。因此，一旦p16/pRB通路被激活，其下调不足以进行DNA合成，除非p53也被靶向。此外，一旦p16/pRB通路参与，p53和pRB失活都不足以使细胞增殖。

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图5。p16/Rb的相继失活决定了衰老的可逆性。(A类)第16页，然后是LgT。P-WI细胞感染lent-p16，然后模拟感染（-）或感染lent-LgT（+）。如材料和方法所述，监测细胞合成DNA（%LN）和增殖（%生长）的能力。(B)LgT后接p16。P-WI细胞感染了lent-LgT，随后是模拟感染（–）或lent-p16感染（+）。监测感染细胞的DNA合成（%LN）和增殖（%生长）。(C类)衰老后沉默p16。S-WI细胞感染lent-shRNA-p16，然后模拟感染（-）或感染lent-GSE-22（+）。监测感染细胞的DNA合成（%LN）和增殖（%生长）。

p16抑制对致癌RAS的反应

致癌RAS（Ha-RAS第12版) (Shih和Weinberg，1982年)传递强大的有丝分裂信号，转化不朽细胞(土地等., 1983). 然而，正常人成纤维细胞对致癌RAS的反应是衰老生长停滞伴随p16上调(塞拉诺等1997年). 由于细胞在复制性衰老时上调p16的能力不同，我们询问上调p16是否也会影响对有丝分裂信号（如Ha-RAS传递的信号）的衰老反应第12版.

我们用表达Ha-RAS的慢病毒感染S-WI和S-BJ细胞第12版（透镜RAS）。Lenti RAS没有刺激S-WI细胞启动DNA合成（图6A） ，与使用不同成纤维细胞菌株和质粒显微注射的报道一致(隆普金等., 1986). 相反，lent-RAS诱导了>20%的S-BJ细胞合成DNA（图6B） ●●●●。因此，致癌RAS不会刺激高p16表达的衰老细胞中的DNA合成，但会适度刺激低p16表达水平的衰老细胞。

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图6。致癌Ras部分逆转p16非依赖性衰老。(A类)S-WI细胞不合成对致癌Ras有反应的DNA。S-WI细胞被指示的慢病毒感染，72小时后评估合成DNA（%LN）和增殖（%生长）的能力，如材料和方法中所述。(B)S-BJ细胞合成DNA并对致癌Ras进行有限增殖。S-BJ细胞被指示的慢病毒感染，并评估%LN和%生长。星号表示细胞增殖有限，达到3PD或更少。(C类)Ras的有丝分裂效应依赖于浓度和p16。S-BJ细胞感染1×（低Ras）或3×（高Ras）lent-Ras病毒浓度（根据p24水平测定，如材料和方法所述），并测量LN百分比。如有指示，S-BJ细胞在随后感染高lent-Ras前5天感染lent-p16。(D类)Ras免疫染色。S-BJ细胞模拟感染或感染1倍或3倍病毒浓度的lent-Ras，并对Ras进行免疫染色。DAPI染色鉴定细胞核。

无论p16水平如何，致癌RAS与CDK4m协同刺激衰老细胞合成DNA（图6A和B）。仅CDK4m可诱导20-35%的S-WI和S-BJ细胞合成DNA。然而，CDK4m加RAS在85-90%的细胞中诱导DNA合成（图6A和B）。然而，无论是单独还是联合致癌RAS或CDK4m均未刺激明显的细胞增殖（图6A） ●●●●。在S-BJ中，RAS或CDK4m分别诱导了～20%的细胞分裂，并且联合诱导了>90%的细胞进行几次分裂。然而，增殖仅限于2–3个PDs（见图2D） 。有趣的是，这些细胞以低p16水平阻止生长，但它们显著高于对照p16水平（图6E） 表明RAS甚至可以在BJ等细胞中诱导p16，而BJ在复制性衰老时不表达p16。总之，这些结果表明，即使p16最初表达较低，致癌RAS也无法维持衰老细胞的生长。

RAS刺激DNA合成的能力取决于其表达水平，并被p16所废除。我们用lent-RAS感染S-BJ细胞，其滴度是常规使用的3倍（高RAS）。高RAS并没有增加感染细胞的比例（高RAS和低RAS的感染率均大于90%；图6D） 但S-BJ细胞的LN百分比从20%增加到55%（图6C） ●●●●。这种DNA合成被lent-16的重复感染显著抑制（图6C） ●●●●。综上所述，这些数据表明，p16通过p53失活以及致癌RAS传递的强大有丝分裂信号，为逆转衰老生长停滞提供了强大的屏障。

讨论

众所周知，p53和pRB通路对于建立人类细胞的复制性衰老至关重要。人们对维持衰老生长停滞的要求知之甚少。我们的结果支持了一种模型，在该模型中，人类成纤维细胞通过两种机制之一建立并维持衰老生长停滞，这取决于p16是否表达。这两种机制都会导致生长停滞，而已知的生理信号无法逆转。然而，在缺乏p16表达的情况下，通过失活p53可以逆转衰老停滞。因此，一旦建立，人类细胞的复制性衰老不一定是不可逆转的，p16在防止p53失活逆转其衰老中起着关键作用（图7)。

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图7。导致人类细胞中可逆且基本上不可逆的衰老生长停滞的途径。增殖细胞（Presenescent）因端粒侵蚀（依赖于p53）或端粒侵蚀与诱导p16的未知刺激的组合而阻止具有衰老表型的生长。p53依赖性阻滞增加p21表达，并被p53失活或致癌Ras逆转。p53失活导致广泛增殖（生长），最终导致危机，而Ras导致有限增殖。当p53和pRb失活或pRb灭活加上致癌Ras时，高p16衰老的细胞可被刺激合成DNA（S期），但不会增殖（无生长）。

与先前提出的模型一致，我们的结果支持端粒依赖性复制衰老主要依赖于p53通路的观点(阿塔贾等., 1995;Gire和Wynford-Thomas，1998年). 在一些人类细胞株中，如BJ，p53依赖性生长停滞是限制复制寿命的主要机制，并且在p53失活后是可逆的。因此，我们发现GSE-22完全逆转了S-BJ细胞的复制衰老，GSE-22使p53失活(古德科夫等., 1993). LgT和LgT-K1也可逆转这些细胞的阻滞，除其他活性外，还可使p53失活。这种逆转导致了广泛的（>20个PDs）细胞增殖，最终，逆转的S-BJ培养物停止了具有危机特征的增殖。

BJ成纤维细胞在其复制寿命中表达极低水平的p16。相反，WI-38细胞即使在前基因状态下也表达p16，并且在其整个生命周期中表达逐渐增加。我们认为BJ和WI-38细胞代表了人类细胞中p16表达谱的极端，因为第三个成纤维细胞株82-6显示了中间p16表达。然而，在众多可供研究的细胞株中，我们在这里研究的细胞菌株是否具有代表性尚待观察。尽管如此，我们的数据支持这样的观点，即诱导p16的能力为建立和维持人类成纤维细胞的复制性衰老提供了第二种机制。与p53建立的阻滞相反，我们无法逆转p16建立的阻滞。pRB的直接失活（通过LgT）或shRNA的p16表达抑制使高p16细胞（S-WI细胞，P-WI+lent-p16）在p53失活后进入细胞周期的S期。然而，这些细胞未能增殖，这表明p16/pRB通路（已知调节进入S期）也必须在S期开始后发挥作用，以防止细胞分裂。

特别有趣的是，p16阻止LgT刺激的细胞增殖的能力取决于表达顺序。因此，LgT不能刺激p16表达细胞的生长，但异位p16表达不能抑制LgT表达细胞的增殖。同样，p16和p53的失活（通过ShRNA和GSE-22）不能刺激S-WI的生长，但如果ShRNA-p16在WI38细胞达到复制性衰老之前表达，则相同的组合在逆转生长停滞方面非常有效。这些发现表明，不可逆的，可能是表观遗传的变化可以决定细胞对p53失活引起的生长刺激的敏感程度。我们假设，一旦p16被表达，未磷酸化的pRB就会建立一种基本上不可逆的抑制染色质状态。即使pRB随后被灭活（例如通过LgT结合）或即使p16本身随后被抑制（例如通过shRNA），这种抑制性染色质也可能持续存在(Brehm和Kouzarides，1999年;成田等2003年). 最近发现一些衰老细胞获得依赖pRB活性的异色结构域，这一模型得到了支持(成田等., 2003)。

与p53失活相反，无论p16表达如何，hTERT表达对复制性衰老细胞的增殖均无影响。这一结果表明，端粒酶需要细胞增殖来延长复制寿命或使人类细胞永生。与这个想法一致，hTERT只有在被LgT或GSE-22刺激增殖后才能使S-BJ细胞永生化（数据未显示）。此外，hTERT并没有改变衰老细胞中的端粒长度，这表明端粒酶需要DNA合成来延长人类细胞的端粒。对酵母的研究同样表明端粒酶作用于端粒需要S期(韦林格等., 1993)。

有趣的是，Ras第12版刺激S-BJ细胞有限增殖，但在S-WI或体外表达p16的S-BJ肿瘤细胞中完全不活跃。早期的微注射研究表明，致癌RAS不能刺激衰老的人成纤维细胞合成DNA(隆普金等., 1986). 据推测，本研究中使用的细胞表达高水平的p16。我们的结果表明，致癌RAS可以克服p53和p21的生长抑制效应，但不能克服p16的生长抑制作用。然而，即使在表达低p16的细胞中，致癌RAS也不能诱导强劲的增殖，可能是因为RAS本身最终诱导衰老样的阻滞(塞拉诺等1997年)至少在BJ细胞中，p16的表达最终增加。RAS还与CDK4m协同诱导细胞周期进展，尽管其在这方面的机制尚不清楚，因为CDK4ms可能同时作用于p16/pRB和p53通路。然而，我们的结果表明，致癌RAS的转化可能需要INK4a位点的完全或部分失活。

我们的结果提出了几个重要的问题，即细胞如何对衰老诱导的刺激作出反应，以及p16在这种反应中的作用。对于决定细胞是否表达p16以及在多大程度上表达p16的因素，我们知之甚少。成纤维细胞株上调p16的倾向明显不同。然而，尚不清楚这种差异是否反映了个体对个体的变异，或某些细胞株中p16自发沉默的选择，就像HMEC的情况一样。此外，对增加p16表达的信号知之甚少。p16诱导被认为是对标准培养条件的应激反应(Sherr和DePinho，2000年;Wright和Shay，2000年)尽管文化压力的性质尚不清楚。一种可能性是DNA复制使细胞面临着抑制性染色质不准确重建的风险，这可能导致p16表达，细胞维持染色质组织的效率可能不同。

细胞衰老被认为是防止哺乳动物细胞不受调节的生长和恶性转化的重要因素(Reddel，2000年;坎皮西等., 2001). 此外，衰老反应的能力可能决定癌症治疗的疗效(施密特等2002年;te坡乐等., 2002). 我们的数据表明，p16对于确保衰老停止的不可逆性至关重要，这与其在肿瘤抑制中的重要作用一致。

材料和方法

细胞和细胞培养

如前所述，获得并生长了人WI-38肺、BJ包皮和82-6皮肤成纤维细胞(迪姆里等., 2000;伊塔哈纳等., 2001). 如前所述，次级流入细胞在20%氧气中传代直至衰老，由%LN测定(迪姆里等., 2000). LN>75%的培养物被视为前基因，而LN<1%的培养物则被视为衰老。为了达到<1%的LN，保持培养物的亚流密度至关重要。对停止增殖（<1%LN）1–3个月的培养物进行衰老可逆性分析。如有指示，同时添加固定滴度的慢病毒（见下文）[3H] 胸腺嘧啶。根据每一代的累积细胞数计算PDs。当衰老细胞增殖>5-6个PDs时，通过克隆形成试验测定生长百分比。当生长包含<5–6个PDs时，通过计算每个培养物的细胞总数来确定生长百分比，如果衰老形态发生逆转，则通过计算每个场中具有衰老形态的细胞与先发形态的细胞的比例来确定。通过接种0.5–1×10进行克隆形成分析3每35mm培养皿培养细胞数，14-18天后计数>50个细胞的菌落数。HMEC（M.Stampfer，Lawrence Berkeley国家实验室）如前所述生长(斯坦普弗和巴特利，1985年). 在我们手中，本研究中使用的细胞株从未自发产生可复制的不朽变体。

载体和病毒感染

pBABE-hTERT公司(基姆等., 1999)使用PT67包装细胞（Clontech）生产感染性逆转录病毒。通过限制性消化或PCR获得以下DNA片段：GSE-22（来自pBabe-GSE，编码干扰的p53片段）(古德科夫等., 1993)、LgT和LgTK1[来自pCMV（T）和pCMV(哈拉等1996年b)，p16（来自曼彻斯特大学E.Hara的cDNA），CDK4R24C型（CDK4m；cDNA来自W.Hahn，Dana-Farber癌症研究所），EGFP cDNA（Clontech），hTERT cDNA(计数器等., 1998)、Ha-RAS第12版cDNA（来自pBABE-RAS）(塞拉诺等1997年)和从MSCV-shp16中的U6启动子表达的p16短发夹RNA（shRNA），如成田等. (2003)将DNA片段亚克隆到pRRL.SIN-18慢载体中，该慢载体将插入的DNA置于CMV启动子的控制下(迟钝的等., 1998). 如前所述，通过将慢病毒载体和包装载体瞬时转染到293T细胞中产生感染性病毒(纳尔迪尼等., 1996). 通过超速离心浓缩病毒上清液，并使用商业试剂盒（Perkin-Elmer）通过ELISA测定p24（病毒衣壳蛋白）的滴度。在存在6µg/ml聚brene的情况下，用至少40（最多100）ng/ml p24当量（1–2 ng/1000个细胞）感染细胞。使用lent–GFP进行的感染试验表明，使用30 ng/ml p24当量时，感染效率>95%。通过免疫荧光证实了感染效率，但hTERT除外，因为没有适用于免疫荧光的抗体。

端粒酶活性和端粒长度测定

如前所述，使用商业试剂盒（Intergen，Purchase，NY）通过TRAP测定端粒酶活性，并通过Southern blot分析评估端粒长度(基姆等., 1999)。

蛋白质印迹和免疫荧光

如前所述进行西方分析(迪姆里等., 2000). 主要抗体为p21（BD Biosciences 556430）、Ras（BD Biosciences 610001）、LgT（Santa Cruz 147）、p53（Santa Cruz 6243）、actin（Chemicon MAB1501）、p16（JC8，佛蒙特大学J.Koh的礼物）和CDK4（NeoMarker MS-864-P1）。对于免疫荧光，我们将细胞接种在四孔室载玻片中，用3.7%甲醛固定，用0.1%Triton X-100在磷酸盐缓冲盐水中渗透（5分钟），用冰镇甲醇处理（20分钟），并用5%山羊血清封闭（1小时）。在封闭溶液中用一级抗体（2-16 h）和二级抗体加DAPI（1 h）培养细胞。

补充数据

补充数据可在欧洲分子生物学组织在线。

致谢

我们感谢J.Garbe提供的衰老HMEC，以及E.Hara、W.Hahn、G.Dimri和J.Koh提供的宝贵试剂。这项工作得到了美国国立卫生研究院（向J.C.和S.W.L.授予编号AG09909和AG16379）、美国国防部（向P.Y.和M.N.授予编号DAMD17-00-0308和DAMD17-01-1-0209）、加州乳腺癌研究计划（向A.K.授予编号8KB-0100）、加拿大卫生研究院向C.M.B.、。，Jose Carreras国际白血病基金会对F.G.和Uehara纪念基金会对M.N。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团