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美国国家科学院院刊。2003年7月22日；100(15): 8839–8843.
2003年7月7日在线发布。 数字对象标识：2017年10月10日/第133136100页
预防性维修识别码：项目经理166400
PMID：12847291

酵母Snf1和哺乳动物AMP活化蛋白激酶的活化上游激酶

Seung-Pyo Hong先生,* 菲奥娜·莱珀,† 安吉拉·伍兹,† 戴维·卡林,†和玛丽安·卡尔森*‡
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Snf1/AMP活化蛋白激酶（AMPK）家族发挥着重要作用真核生物对代谢应激的细胞反应。在人类中，AMPK调节脂质和葡萄糖代谢代谢紊乱，如糖尿病、肥胖和心脏异常。锡f1和AMPK是激酶级联的下游成分，但上游激酶仍然难以捉摸。我们已经鉴定出三种酵母激酶，激活Snf1激酶的Pak1p、Tos3p和Elm1p体内.三重同源基因缺失导致Snf——突变表型并取消Snf1催化活性。所有三种激酶磷酸化重组Snf1p对苏氨酸的激活作用。此外，Tos3p磷酸化哺乳动物AMPK的等效残基并激活酶，提示上游激酶在酵母和哺乳动物。我们进一步表明，密切相关的哺乳动物LKB1激酶，与Peutz–Jeghers癌症易感性相关综合征，磷酸化并激活AMPK在体外因此酵母上游激酶的鉴定应有助于鉴定相应的、生理上重要的哺乳动物上游激酶。

Snf1/AMP-activated protein kinase（AMPK）激酶家族非常重要真核生物代谢应激反应（参考文献综述）。1和2). 在哺乳动物中，AMPK是被多重压力激活，导致细胞数量增加AMP：ATP比率，也被瘦素激活(三)和二甲双胍，一种使用的药物治疗2型糖尿病(4).AMPK在协调能量平衡方面起着核心作用脂质代谢、葡萄糖转运调节器(5)和糖原储存(6). 在人类中，AMPK已经参与代谢紊乱的发展和治疗，包括肥胖与2型糖尿病(2)和AMPK突变导致心脏异常(7).

在酵母中酿酒酵母，Snf1激酶也是应激反应所必需的，尤其是细胞对碳的适应强调。Snf1调节许多基因对葡萄糖的转录限制，使用替代碳源需要Snf1(1). 与AMPK一样，Snf1也调节脂肪酸代谢酶的活性糖原代谢(8——10).控制Snf1活性以响应葡萄糖水平的信号不是可以理解，尽管AMP:ATP比率在某些情况下可能会起作用(11). Snf1也会影响减数分裂和孢子形成，丝状侵入生长(12——14),和老化(15).

Snf1激酶包含催化亚单位Snf1p（α亚单位AMPK）、Snf4p（AMPK的γ亚基）和三个β亚基之一。Snf4p通过Snf1p的反作用自抑制作用刺激激酶活性监管领域(16). 这个β亚单位调节激酶的亚细胞定位(17)并调解相互作用具有下游目标(18).Snf1通过活化苏氨酸残基的磷酸化被激活(8,11,19,20)，这也是安普克(21).

尽管付出了大量努力，上游激酶的身份磷酸化Snf1和AMPK被证明是难以捉摸的。在酵母中，遗传方法未能在同源基因中产生突变，这表明激酶激活Snf1。最近，酵母蛋白的质谱分析配合物表明，Tos3p（YGL179C）与Snf4p共渗(22)和Pak1p（与p21-活化激酶）与Snf1p和Snf4p共纯化(23). Tos3p和Pak1p是密切相关，但其功能未知，除了过度表达Pak1p抑制DNA聚合酶突变(24).

我们已经探索了Tos3p和Pak1p激活Snf1激酶的可能性。我们提供的证据表明，Tos3p和Pak1p以及第三个Snf1功能需要相关激酶Elm1p体内和表明这三种激酶磷酸化并激活Snf1在里面体外我们进一步证明Tos3p磷酸化并激活AMPK在体外，表明哺乳动物的上游激酶与这些酵母激酶有关。因此，我们寻找密切相关的哺乳动物激酶并发现LKB1抑癌激酶(25,26)激活AMPK在里面体外.

材料和方法

酵母菌株和遗传分析。 酿酒酵母菌株这里使用的是TAT7(垫子一 ade2 his3 leu2 trp1ura3型::lexAop-lacZ LYS2::lexAop-HIS3合金80)，MCY2649(垫子α他的3个leu2 ura3)和W303-1A的衍生物(垫子一 ura3他的3 leu2 trp1 ade2 can1). 所有突变体在W303遗传背景下构建。这个tos3型Δ::kanMX4码和包装1Δ::kanMX4码从基因组DNA中恢复等位基因通过PCR检测突变菌株（Research Genetics，Huntsville，AL）并引入通过转换转换为W303。这个elm1级Δ::URA3公司等位基因也是从突变株中获得的(27). 双突变体用于四分体分析为MCY5117(垫子α到3Δ::kanMX4包装1Δ::kanMX4 ura3 his3 leu2trp1 ade2 can1)和MCY5122(垫子一 到3Δ::kanMX4 elm1型Δ::URA3 URA3 his3leu2trp1 ade2 can1). 通过PCR分析确定分离物的基因型基因组DNA。富培养基为酵母提取物/蛋白胨/2%葡萄糖（YPD）使用缺乏适当补充物的合成完全培养基选择质粒(28).

免疫沉淀、激酶分析和免疫印迹分析。酵母细胞蛋白提取物的制备、免疫沉淀、激酶按照说明进行分析和免疫印迹分析(18). 提取缓冲区为50 mM Hepes（pH 7.5）/150 mM NaCl/0.1%Triton X-100/1 mM DTT/10%甘油，含有2 mM苯甲基磺酰氟和完整蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。免疫沉淀LexA-Snf1p的激酶活性为在50 mM Tris·HCl（pH 7.5）/10 mM MgCl中测定2/1mM DTT，含有20μCi（1 Ci=37 GBq）的[γ-32P] ATP（3000Ci/mmol；珀金-埃尔默）。Snf1催化结构域的磷酸化在50 mM Tris·HCl（pH 7.5）/2 mM中检测珠结合GST激酶氯化镁2/1 mM氯化锰2/1mMDTT/5μM ATP，含20[γ]的μCi-32P] ATP。抗体是抗LexA（Invitrogen）的或抗Snf1(29).

GST标记酵母激酶的表达和纯化Snf1催化域。GST融合到Tos3p(31)，包装1p(31)和Elm1p(32)在酵母中表达指定库中的单元格。此外，表达GST或来自铜诱导启动子的GST-Tos3p、-Pak1p或-Elm1p（pOV85、pRH95、，分别从其中一个文库中分离出pRH98和pRH94）(31)并用于转换MCY2649用于GST蛋白的表达。从酵母中制备提取物如上所述，用谷胱甘肽-脑葡萄糖（Amersham生物科学）。

His-tagged突变体Snf1p催化结构域Snf1KD-K84R和-T210A分别为以表示大肠杆菌来自pRH89和pRH90的衍生物分别为pRJ224和pRJ226(33)，在pET32c（诺瓦根）中。蛋白质在TALON树脂（BD）上通过钴亲和层析纯化生物科学），并用含有150 mM咪唑的缓冲液洗脱，根据制造商的说明。

通过SAMS肽的磷酸化测定Snf1激酶活性。检测结果如所述(8,30). 提取物制备于来自在YPD中生长并通过离心收获的酵母细胞的复制品。细胞在缓冲液A中破碎[50 mM Tris·HCl，pH 7.5/50 mM NaF/5 mM钠焦磷酸盐/1 mM EDTA/1 mM DTT/0.1 mM苯甲基磺酰氟/10%（体积/体积）甘油]。通过色谱法对Snf1激酶进行了部分纯化DEAE-Sepharose（Amersham Biosciences），Snf1活性从带有缓冲液A的色谱柱，缓冲液A中含有0.2 M NaCl（0.5 ml分数）。峰值分数使用Centricon-30将（2 ml）混合并浓缩至≈0.5 ml微型集中器（Amicon）。对混合组分进行三次分析SAMS肽（HMRSAMSGLHLVKRR）的磷酸化[γ-32P] ATP（比活性，≈300000 cpm/nmol）反应缓冲液[50 mM Hepes，pH 7.5/5 mM MgCl2/1 mM乙二胺四乙酸二乙酯/0.2 mM含有0.2 mM SAMS肽的ATP/10%（vol/vol）甘油。激酶活性为以每分钟并入肽中的磷酸盐的nmol表示。

哺乳动物激酶的表达和纯化。细菌性的表达的AMPK（α1β1γ1）通过色谱纯化Ni-NTA琼脂糖（加利福尼亚州巴伦西亚，恰根）(34). 质粒DNA编码标记有FLAG的老鼠LKB1（癌症研究所A.Ashworth的礼物，London）通过脂质体试剂转染COS7细胞。细胞转染48小时后收获，通过结合纯化LKB1蛋白EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶（Sigma）。

AMPK的磷酸化和测定。细菌表达的AMPK是用100μM ATP和5 mM MgCl培养2200μM AMP和1 mM50 mM Hepes（pH 7.4）中存在或不存在上游激酶的DTT30°C下30分钟。在短暂离心去除树脂AMPK后通过使用SAMS肽测定法测量上清液中的活性(30). T172的磷酸化通过免疫印迹法使用一种特异性抗体识别AMPKα亚基内的磷酸苏氨酸172（细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利）。32磷酸标记通过培养一种催化活性的AMPK（2μg），α亚基中含有D157A取代(35)，GST-Tos3p或GST与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠结合[γ-32P] ATP在30°C下持续30分钟。珠子被移除简单离心，通过以下方法分析上清液中的蛋白质SDS/PAGE和放射自显影。

结果

Tos3p和Pak1p在功能上与Snf1激酶相关。确认Tos3p与Snf1p相互作用，我们表达了GST-Tos3p和LexA-标记的Snf1p在酵母中，证明这两种蛋白质在谷胱甘肽-脑葡萄糖（数据未显示）。然后我们介绍了到3Δ和乘客1Δ突变(到3Δ::kanMX4码和乘客1Δ::kanMX4码)进入酵母细胞并进行测试a的表型特征snf1Δ突变。单身和双突变体在棉子糖或甘油/乙醇上生长无缺陷（数据未显示；图。1B类). 因此，我们寻求其他基因证据Tos3p和Pak1p在功能上与Snf1激酶相关。我们推断如果它们激活了Snf1，它们的过度表达可能会弥补这种缺失刺激亚单位Snf4p的表达。GST-Tos3p或-Pak1p过度表达部分抑制信噪比4Δ突变缺陷SUC2公司（转化酶）基因表达和GST-Tos3p恢复了棉子糖在信噪比4Δ突变，但未绕过Snf1的要求（数据未显示）。我们还使用了一种分析方法，其中lexAop-lacZ公司报告者依赖LexA-Snf1p的催化活性与发起人绑定(36).GST-Tos3p或-Pak1p刺激的β-半乳糖苷酶的过度表达响应葡萄糖限制的合成，意味着对LexA-Snf1p催化活性(图1A类).

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过度表达和突变表型。(A类)Tos3p过度表达，在报告分析中，Pak1p和Elm1p刺激Snf1功能。转化体酵母菌株（TAT7）携带lexAop-lacZ公司记者表示来自铜诱导启动子的GST或GST-Tos3p、-Pak1p或-Elm1p（pOV85，pRH95、pRH98和pRH94）和LexA-Snf1p（pOV8；参考。37). 合成β-半乳糖苷酶依赖于LexA-Snf1p的催化活性(36). 转化体(n个=3）在选择性SC和2%葡萄糖中生长到中对数期，转移到含有0.5 mM CuSO的介质4在2%的条件下葡萄糖（开放棒）或0.05%葡萄糖（填充棒）3小时，并对β-半乳糖苷酶活性(36). 控制变形金刚用每个GST-激酶表达LexA的值小于0.3个单位。(B类)三倍的到3Δ包装1Δelm1级Δ突变体表现出生长缺陷。这个到3Δ乘客1Δ和到3Δelm1级Δ::URA3公司双突变体（两者运送ura3型)进行杂交并进行四分体分析。将分离物从富培养基复制到SC-Ura加2%葡萄糖和SC加上2%甘油/3%乙醇。图中显示了五个四分体。相同的模式在SC加含2%棉籽糖的抗霉素A（1）上观察到生长μg/ml）。星号表示三个突变分离子。对照菌株：WT，snf1Δ突变体和双亲突变体。

三重tos3Δpak1Δelm1Δ突变导致Snf公司——突变表型。缺乏表型双突变体表明另一个激酶提供了冗余功能。这个与Pak1p和Tos3p关系最密切的激酶是Elm1p(38)，由确定导致细胞形态拉长并影响假菌丝的突变发展(27). Elm1p有已证明在控制芽生长和胞质分裂中起作用(39,40). 我们介绍了elm1级Δ::URA3公司(27)变成上面的突变体基因断裂菌株。这个到3Δelm1级Δ和包装1Δelm1级Δ菌株在棉子糖和甘油/乙醇，但三重到3Δ乘客1Δelm1级Δ突变体没有。

为了确认这个结果，我们交叉了到3Δ乘客1Δ和到3Δelm1级Δ应变和进行四分体分析。13个中的14个三重突变片段四分体在甘油/乙醇和棉子糖上生长有缺陷(图1B类; 数据不是如图所示）。转化酶活性检测表明SUC2公司表达式是废除（去压制WT细胞中95个单位snf1Δ和三重突变细胞）。三重突变体也表现出糖原积累缺陷snf1型Δ突变表型（数据未显示）。这些基因发现支持了这一观点需要Tos3p、Pak1p和Elm1p冗余提供的函数Snf1激酶功能体内.

三重tos3Δpak1Δelm1Δ突变消除Snf1激酶体外活性。为了确定这三种激酶激活Snf1，我们使用了在体外激酶分析。蛋白质提取物由表达LexA-Snf1p的WT和三突变细胞制备。LexA-Snf1p与抗LexA免疫沉淀并在存在的情况下培养[γ-32P] ATP。当从WT提取物中进行免疫沉淀时，LexA-Snf1p被磷酸化在体外和控件催化非活性LexA-Snf1K84R和LexA-Snanf1T210A（携带ATP结合位点赖氨酸的取代和活化苏氨酸）证实了Snf1激酶的活性。相反，当LexA-Snf1p从三突变体中沉淀出来时，没有检测到磷酸化(图。2A类)尽管蛋白质水平相当(图2B类).

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Snf1激酶活性的测定。(A类和B类)WT和三重表达LexA-Snf1p或其T210A和K84R突变衍生物的突变细胞【pRJ55、pRJ217和pRJ215(16)]被选择性地种植SC加2%葡萄糖。从提取物（200μg）中免疫沉淀蛋白质使用反LexA。(A类)免疫沉淀物在激酶中孵育含有[γ]的缓冲液-32P] ATP并通过SDS/PAGE和放射自显影术。(B类)免疫沉淀物的分析方法为抗LexA免疫印迹。(C类)测定Snf1激酶活性通过测定SAMS肽的磷酸化(8,30). A类snf1-K84R型突变体提取物也没有活性。(D类)分析的部分用抗Snf1抗体进行免疫印迹。

我们还分析了Snf1的催化活性在体外通过SAMS合成肽底物的磷酸化(8,30). Snf1部分在激活激酶的条件下，从细胞提取物中纯化(8,11)，并与存在[γ]的SAMS肽-32P] ATP。肽是在WT测定中磷酸化，但没有snf1Δ提取物。不在中检测到活动到3Δ乘客1Δelm1级Δ突变体(图。2C类); 免疫印迹分析证实了Snf1p的存在(图2D类). 这些结果表明，在缺乏Tos3p、Pak1p和Elm1p的情况下，Snf1激酶保持不活动状态。

激活回路上的Tos3p、Pak1p和Elm1p磷酸化Snf1p苏氨酸残留物。为了确定这三种激酶是否直接磷酸化Snf1p，我们将其作为底物Snf1催化域，命名为Snf1KD-K84R(图3). GST-Tos3p、-Pak1p、，和-Elm1p从酵母中纯化，并与细菌表达的孵育存在[γ]时的Snf1KD-K84R-32P] ATP。GST-Tos3p和-Elm1p均磷酸化Snf1KD-K84R。GST-Pak1p磷酸化底物弱，可能是因为只有极少量的全长蛋白质恢复；全长GST-Pak1p的自身磷酸化也很弱。用一种不相关的GST激酶YPL141C孵育证实Snf1KD-K84R没有自动磷酸化。确定Tos3p、Pak1p和Elm1p磷酸化苏氨酸活化，我们使用了一个突变底物缺少T210，Snf1KD-T210A。未检测到磷酸化(图3).

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T210上的Tos3p、Pak1p和Elm1p磷酸化Snf1p在体外.GST-Tos3p公司(31)，-包装1p(31)、和-Elm1p(32)从酵母中提纯细胞。固定在小球上的GST激酶与细菌孵育表达Snf1KD-K84R或-T210A（0.2μg），或无底物[γ-32P] ATP在25°C下持续20分钟。分析了蛋白质通过SDS/PAGE和放射自显影。显示自动射线图。一个武断的GST激酶YPL141C作为对照。箭头，突变体Snf1KD；星号，自动磷酸化全长GST激酶。分子质量标记（kDa）表示。

Tos3p磷酸化并在体外激活哺乳动物AMPK。我们接下来检测纯化酵母GST激酶磷酸化和激活哺乳动物AMPK。表达重组AMPK（α1β1γ1）在细菌中(34)被孵化使用每种激酶和MgATP，通过使用SAMS肽分析。GST-Tos3p孵化导致AMPK活性，而GST-Elm1p和-Pak1p几乎没有增加(图4A类). GST-Tos3p公司磷酸化一种催化活性的α（催化）亚基AMPK的形式，但不是β或γ亚单位(图4B类). 免疫印迹分析表明，GST-Tos3p磷酸化活化苏氨酸，T172(图。4C类)如预期的激活上游激酶(21). 这些发现表明酵母和哺乳动物之间上游激酶的功能保护。

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Tos3p和LKB1磷酸化并激活AMPK在里面体外.(A类)细菌表达的AMPK(34)与MgATP孵育和固定化GST激酶（由pRH95、pRH98和pRH94表达），以及AMPK使用SAMS肽分析测定活性(30). (B类)A类将具有催化活性的突变体AMPK（D157A取代）与GST-Tos3p或GST与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠结合[γ-32P] 通过SDS/PAGE和放射自显影术。显示了分子质量标记（kDa）。(C类)细菌表达的AMPK（0.15μg）与GST-Tos3p、GST或部分纯化大鼠肝脏AMPKK(21)并由分析用磷苏氨酸172特异性抗体进行免疫印迹。(D类和E类)纯化、固定化标记有FLAG的LKB1，WT或催化失活突变体（D194A）与细菌培养表达了AMPK。空载体是pCDNA3（Invitrogen），缺少LKB1插入。(D类)测定AMPK活性(30). (E类)T172的磷酸化通过免疫印迹法测定，如C类.

哺乳动物LKB1激酶在体外磷酸化和激活AMPK。Tos3p、Pak1p和Elm1p的催化域与哺乳动物钙2+/钙调素依赖性蛋白激酶激酶（CaMKK），尽管它们与CaMKs的酵母群不同(38). 以前的研究表明哺乳动物CaMKK弱磷酸化并激活AMPK在里面体外与上游激酶保守的观点一致酵母和哺乳动物之间；然而，主要的AMPK激酶（AMPKK）是不同的来自CaMKK且不是Ca2+/钙调素刺激(41). 这些发现表明AMPKK对应于另一个CaMK相关激酶。

Tos3p、Pak1p和Elm1p的催化域也与LKB1（STK11）抑癌激酶。这个LKB1号机组基因是Peutz–Jeghers综合征突变(25,26)，常染色体显性遗传与大幅度增加相关的肠息肉病综合征各种其他癌症的风险（参考文献综述。42). LKB1对于哺乳动物胚胎发育，如发现磅1-缺陷小鼠在妊娠中期死于血管异常和其他缺陷(43).

研究LKB1作为上游激酶的可能性AMPK，我们从哺乳动物细胞中纯化了FLAG标记的LKB1。LKB1被孵化用细菌表达的AMPK，测定AMPK活性。LKB1强烈活化重组AMPK(图。4D类)，免疫印迹分析显示活化苏氨酸T172被磷酸化(图4E类). 处于控制中实验中，催化失活突变体LKB1（D194A）没有激活或磷酸化AMPK。这些在体外研究结果表明，LKB1是一种AMPK上游激酶的有希望的候选者体内.

讨论

我们已经确定了三种激酶，Tos3p、Pak1p和Elm1p，其功能是Snf1激酶级联中的上游激酶。我们提出基因和这些激酶磷酸化并激活Snf1激酶的生化证据在体外和体内.缺乏这三种基因的突变酵母细胞激酶在利用葡萄糖以外的碳源方面存在缺陷，Snf1激酶途径的标志性功能。这份报告是第一份在Snf1/AMPK激酶级联反应中上游激酶的鉴定证明了生理作用。

这三种激酶明显表现出显著的功能冗余，因为这三种基因都必须突变才能获得Snf——这里检测了表型。然而，他们很可能会证明在调节Snf1方面具有一些独特的功能。Snf1激酶以三种不同的形式存在于细胞中，每种形式都包含不同的β亚单位亚型（Sip1p、Sip2p或Gal83p），以及大量证据表明不同亚型具有不同的功能作用(15,17,18). 这很诱人推测三种上游激酶中的每一种都表现出对Snf1激酶，含有一种特定的β亚基亚型。另一种可能性这三种激酶对不同种类的代谢应激或单一应激产生的不同信号，如作为葡萄糖限制。单、双表型的进一步研究到3Δ,乘客1Δ，以及elm1级Δ突变体将有助于解决其中一些问题。

还值得注意的是，至少其中一种激酶Elm1p具有调控功能包括细胞形态、丝状侵入性生长、，控制芽的生长和胞质分裂(12,27,39,40)可能没有与Snf1通路的连接。在单倍体侵入性生长的情况下，基因证据表明Elm1p具有明显分离的功能其作为Snf1上游激酶的作用(12). 此外，它不是很明显，通过过度表达包装1p(24)与Snf1途径。

Snf1激酶级联上游激酶的鉴定打开为理解Snf1途径的调控提供了新的可能性，更广泛地说，是为了了解酵母的代谢应激反应。然而，这些激酶的鉴定不仅在酵母中具有重要意义为AMPK级联中上游激酶的搜索提供线索。安一种密切相关的哺乳动物激酶LKB1肿瘤的初步检测抑制激酶，产生在体外LKB1有希望的证据AMPK上游激酶的候选基因；此外，LKB1的质量接近从大鼠肝脏中纯化的AMPKK催化亚单位估计为58kDa(21).这些发现进一步表明AMPK在生长和转化以及新陈代谢的调节。我们是目前正在研究LKB1在调节AMPK公司体内与酵母有关的其他哺乳动物激酶上游激酶也是AMPK真正激酶的候选级联。这些哺乳动物上游激酶是潜在的治疗靶点用于治疗人类代谢紊乱和癌症。

致谢

我们感谢S.Kuchin对四分体的分析；E.Phizicky和M.Snyder图书馆；AMPK的D.Neumann、U.Schlattner和T.Wallimann；和A。Ashworth用于编码LKB1的质粒。这项工作得到了National的支持卫生研究院拨款GM34095（给M.C.）和医学研究理事会（哥伦比亚特区）。

笔记

缩写：AMPK，AMP-activated protein kinase；SC，合成完整。

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院