在未折叠的蛋白质反应过程中，自噬平衡内质网扩张

摘要

介绍

分泌蛋白和大多数完整的膜蛋白进入内质网（ER）的分泌途径[1]在那里折叠，如果合适的话，进行共价修饰并组装成更高阶的配合物。ER受体伴侣和其他修饰酶有助于蛋白质实现活性的三维构象。只有正确折叠和组装的蛋白质才能离开内质网，从而提供精细的质量控制，以确保细胞与其环境通信所需的质膜和分泌蛋白质的保真度[2]. 该过程在多个层面上进行调节，以确保内质网折叠容量足够，并根据需要进行适当调整，即内质网内环境保持稳定。例如，细胞调节转运到内质网的蛋白质量、伴侣和其他内质网酶的浓度、内质网膜系统的丰度以及未折叠蛋白质的降解[三–5].

这种调节的中心是一种系统发育保守的ER-细胞核信号通路，称为未折叠蛋白反应（UPR），它根据未折叠蛋白的积累来调节ER的丰度[6]. 当蛋白质折叠需求超过内质网的蛋白质折叠能力时，就会产生未折叠蛋白质。内质网跨膜激酶/内核糖核酸酶Ire1是内质网中未折叠蛋白质的主要传感器[7–9]. 它通过激活其核糖核酸内切酶结构域将这些信息传递到胞质溶胶，从而启动非常规的信使核糖核酸剪接反应[10–13]. 剪接从单个mRNA物种中删除一个短内含子，HAC1、，允许产生活性转录激活物Hac1^我[13,14]（或其后生动物直系生物XBP1[15–17]). 危险源1^我（或XBP1）然后转录激活大量UPR靶基因，这些基因在酵母中占基因组的5%以上[18]. UPR靶基因的诱导增加了折叠蛋白质所需的伴侣和修饰酶的生物合成，以及通过分泌途径运输、ER相关蛋白降解（ERAD）和磷脂生物合成所涉及的因素。因此，UPR驱动一个全面的程序来调整细胞折叠、处理和分泌蛋白质的能力。

在后生动物细胞中，UPR的调节更为复杂；至少有三条机制不同的通路（Ire1、ATF6和Perk）与内质网中的感觉未折叠蛋白平行运作。每一条通路都激活不同的转录因子，这些转录因子以组织特异的方式协作触发转录程序的连续性[6]. 在其他基因中，ATF6途径增加了XBP1型信使核糖核酸[19–23]因此，在Ire1剪接其mRNA时产生更多的转录因子XBP1。在酵母中观察到一个类似的信息网络，为UPR提供“增益控制”：HAC1型当酵母细胞受到特别严重的内质网应激条件时，mRNA增加3到4倍[24]. 这种新状态称为超UPR（S-UPR），允许细胞合成更多的Hac1蛋白，从而产生质的不同转录产物。上调HAC1类S-UPR条件下的mRNA对细胞生存是必要的。感知S-UPR信号并将其通过ER膜传输的分子机制尚不清楚，但很明显它不需要Ire1[24].

UPR目标集包括ERAD中的关键参与者[25,26]. ERAD介导未折叠蛋白从内质网腔逆转录到胞浆中，以被蛋白酶体降解。通过这种方式，ERAD补充了其他UPR靶点，如伴侣蛋白和蛋白质修饰酶，它们的上调通过从ER中去除错误折叠的蛋白质来积极促进蛋白质折叠。然而，进入ERAD途径的蛋白质，必须反向穿过膜，并且可能是作为一条未折叠的链穿过膜中的蛋白质转运通道。严重错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集体可能很难通过这种机制分解和降解。

以蛋白质为降解目标的另一种途径是自噬。自噬描述了一系列途径，通过这些途径，细胞质的部分，包括其细胞器，可以被隔离到膜结合的隔室中，然后与液泡（或溶酶体）融合，在液泡中，其内容物被酸性水解酶降解[27]. 通过这种方式，整个细胞器都可以被降解，无论其大小或其组成蛋白质的折叠状态如何。许多介导自噬的成分已经被鉴定[28–31]并具有广泛的特征。

自噬途径的选择性不同。例如，大细胞自噬是由饥饿诱导的，用于包裹和降解大量非选择性的胞浆[32]以及悬浮在其中的细胞器，包括线粒体[33]和ER段[34]. 这以代谢产物的形式为细胞提供了急需的营养，代谢产物来源于消化的蛋白质和大分子结构（自相吞噬）[35]. 细胞质的特定区域是如何被选择包围在自噬体中的，以及将其隔离的双层膜结构的起源尚不清楚。然而，已有研究表明，早期分泌途径有助于自噬体的组装[36–38]. 与宏观自噬相反，细胞自噬和线粒体自噬是一种高度选择性的过程，在改变对这些细胞器需求的生长条件下，它们分别降解过量的过氧化物酶体和线粒体[39,40]. 有人提出，标记蛋白选择性地显示在不再需要或受损的细胞器上，并指示其隔离。生物合成细胞质-空泡靶向（Cvt）途径也共享大多数介导降解自噬的成分[41–43]在其生物合成过程中，其组成性地将一部分内容蛋白传递到液泡[44]. 降解自噬和生物合成Cvt途径在形态和拓扑上相似，并且共享许多成分。

在这里，我们描述了UPR和自噬之间意外的联系。我们表明，在UPR诱导条件下，内质网膜选择性地隔离在自噬体样结构中，利用与其他自噬过程共享的成分。我们讨论了在UPR诱导的内质网增殖过程中，内质网选择性自噬分支（简称内质网噬）与UPR的生理联系。

结果

在UPR诱导期间ER膨胀

为了询问UPR的激活是否改变ER结构或丰度，我们用电子显微镜（EM）检查了细胞薄片。为此，我们收集了经二硫苏糖醇（DTT）处理的呈指数增长的野生型细胞，以诱导UPR，并将其与未经处理的细胞进行比较。如所示图1，大多数ER位于细胞的外围(图1A、 ER，用洋红描记）或形成核膜(图1A、 NE，用蓝色标记）。

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图1

UPR-诱导条件下的内质网增殖

（A） 对照细胞和UPR诱导细胞内质网丰度的测定。显示了具有代表性的单元格。通过添加DTT在野生型细胞中诱导UPR。使用ImageJ分析对照细胞和UPR诱导细胞的超微结构。下面的图像显示了皮层ER（以洋红色表示）和核膜（NE，以蓝色表示）的痕迹。液泡、细胞核和线粒体分别表示为V、N和M。

（B） UPR期间内质网增殖的量化。诱导UPR，并在指定的时间点收集细胞进行EM。ER的长度（如[A]中所示）被测量并除以截面面积。数据是相对于时间0绘制的。每个时间点的测量值对应于25个独立细胞图像的平均值。

（C） 的表达式HAC1类^我通过添加100μM DOC诱导3小时。ER按上文（B）所述进行量化。

即使粗略地看一下这些图像，也可以发现在UPR诱导后ER发生了大规模扩张。为了量化这种随时间变化的影响，我们测量了单个EM切片中ER的累积长度，并将结果归一化为细胞的面积。如所示图1B（洋红条），根据这个指标，在添加DTT后的3小时内，ER的量增加了3倍以上。相比之下，NE的量保持不变(图1B、 蓝色条），表示核容量保持不变，从而作为一种方便的内部控制。ER的增殖很快，在加入DTT后40分钟翻了一番。

为了确定观察到的形态变化是否是UPR诱导的直接结果，我们激活了Ire1下游的UPR转录程序，而没有错误折叠ER中的蛋白HAC1类信使核糖核酸(HAC1型^我mRNA，用于诱导）。我们诱导HAC1类^我mRNA输入hac1Δ细胞通过添加脱氧皮质酮（DOC），DOC与这些细胞中表达的糖皮质激素受体结合并激活[18]. 期间ER膨胀量HAC1类^我mRNA表达与DTT治疗期间观察到的增加相似，表明Hac1激活UPR足以诱导观察到的ER增殖(图1C） ●●●●。

在UPR期间，除了内质网增殖外，我们还观察到内质网膜系统的连续性在一段时间内显著增加(图2A） ●●●●。在连续70 nm厚的连续切片中，对照细胞中出现并消失了短暂的内质网，而在UPR诱导的细胞中，我们可以在许多切片上追踪到连续的内质网膜(图2B） ●●●●。这一观察结果表明，在UPR诱导的细胞中，从控制细胞的主要小管或非常小的片状变为膨胀的片状。ER的膨胀测量单位为图1B、 因此，这可能低估了膜面积和细胞器体积。此外，我们观察到，在扩张的UPR诱导的内质网中，内质网膜之间的间距显著增加(图2C类；对照细胞的内质网膜距离=31±5 nm，而UPR诱导的细胞为48±6 nm）。我们在固定的高锰酸盐染色切片中定性地观察到了这种影响，但在闪速冷冻/冷冻替代切片中，我们对ER膜之间的距离进行了更准确的测量，以将样品变形的可能性降至最低[45]. 因此，即使不考虑可能发生的肾小管到肾小管转变的几何形状改变，在UPR诱导下，内质网体积也会膨胀约5倍（长度膨胀3.3倍×宽度膨胀1.5倍）。

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图2

UPR期间内质网的形态变化

（A） 对照细胞和UPR诱导的细胞用于分析单个细胞内的内质网，并使用EM跟踪内质网。方框表示（B）中放大的区域。此处显示的单元格对应于（B）中标记为“+140 nm”的图像的整个部分。

（B） 对照细胞和UPR诱导细胞的连续切片。各部分在z（z）-轴。ER用洋红表示，NE用蓝色表示。

（C） 对照细胞和UPR诱导细胞的电镜照片显示，在UPR期间内质网膜之间的距离增加。为了更好地保存超微结构，使用高压冷冻/冷冻替代技术（参见材料和方法).

UPR诱导的细胞亚群中自噬体样结构的形成

出乎意料的是，我们观察到一小部分UPR诱导的细胞积聚了大量双膜结合的自噬体样结构，其中充满了紧密堆积的膜池(图3A和​和3B）。三B） ●●●●。我们在下文中表明，内容物膜源自内质网，此后将这些结构称为含内质网的自噬体或ERA。UPR诱导3小时后，20%以上的细胞出现ERA。值得注意的是，在含有ERAs的人群中，没有一个细胞增殖ER。ERAs显示出自噬体的特征：它们被双层膜包围(图3C） 尺寸相似（300至700 nm）[46,47]. 通常，分隔外膜连接到管状或单板延伸件(图3A和​和3D，三D、 箭头）。为了确定ERA是否来源于ER，我们检查了锇染色的闪速冷冻/冷冻替代切片。在这些样本中，我们发现ERA的外膜和延伸部分密集地布满核糖体，这表明这些膜确实来源于ER(图3E） ●●●●。

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图3

UPR期间含ER的自噬体（ERA）的特征

（A） 含有ERA的典型DTT处理野生型细胞的图像。细胞核和细胞质分别表示为N和C。

（B） 放大来自不同单元格的ERA代表图像。右下角的图像可能显示了一个通过杯状ERA的部分。请注意，堆叠水池和封套之间没有连接。

（C） ERA双层膜的高倍放大。

（D） 发现一些ERA附着在ER管/板上或靠近ER管/板材（箭头所示）。请注意，（A）中的部分包括两个此类交叉点。

（E） 与内质网小管/片材相连的ERA的高压冷冻/冷冻替代图像。该技术中使用的锇/铅染色显示了核糖体，并表明ERA外包膜（而非堆积的内池）紧密镶嵌着核糖体。这表明核糖体起源于ER膜。

（F） 使用改进的协议可视化膜的ER-ERA接头的高压冷冻/冷冻替代图像。

（G） 使用与（F）中相同的技术，我们可视化了ERA的内膜含量。请注意，内膜和隔离双膜包膜的两部分都含有结合核糖体，因此可能来自内质网。

用于图3E不允许充分可视化膜。在尝试优化程序的同时，我们发现在锇固定/置换步骤中加入3%的水大大改善了图像中的膜可视性，如之前报道的那样[48]. 显示了使用此改进技术获得的代表性图像图3F和​和3G，三G、 这有力地证明了ERAs的界膜与核糖体介导的ER膜是连续的。在所示的图像中，双层的连续性可以通过膜延伸与ERA相遇的接合处清晰地描绘出来。图3G显示了通过ERA的横截面，膜堆的内容物清晰可见。注意，隔离膜在紧密堆积的地方是无核糖体的，但在紧贴的地方含有膜结合核糖体。

用荧光显微镜检查表达Sec61-cherry融合蛋白的细胞在UPR诱导后3小时的ER[49]80%的细胞出现增殖ER(图4A、 +DTT，底行），与EM图像一致，如图1相比之下，20%的细胞显示出多个不同的强荧光胞质体(图4B、 箭头）。每个细胞的丰度，它们在UPR诱导后的晚（3小时）但不是早（90分钟）时间点出现，它们在人群中20%的细胞中出现的外显率，并且它们在缺乏扩张内质网的细胞中的出现都与这些结构对应于电子显微镜观察到的内质网这一概念相一致。

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图4

UPR诱导后ER标记的荧光可视化

（A） 使用转座子组分Sec61和红色荧光蛋白“cherry”之间的融合蛋白对使用UPR诱导药物DTT（+DTT）或不使用药物处理的细胞进行可视化。顶部面板显示未处理的细胞，底部面板显示代表性的UPR诱导细胞。

（B） 显示含有ERA的UPR诱导的细胞的代表性图像（由箭头指示）。

为了进一步证明EM图像中ERA中观察到的膜堆确实来自ER，我们使用针对ER驻留蛋白Sec63表位标签的抗体制备了EM图像以进行免疫金染色(图5). 我们获得了可清晰识别的内质网结构的选择性标记(图5A和​和5B），5B） 以及选择性标记ERA(图5C） ●●●●。当我们比较ERA和核质时，每一区域金粒子的定量显示出大约7:1的信噪比(图5D类；在细胞切片中，核质背景染色密度最高）。此外，我们发现ERA区域的金颗粒密度与ER膜包裹量的预测值非常吻合(图5C） ●●●●。为了得出这一结论，我们通过EM切片测定了ERA中ER膜的密度，如图3B（每个区域的ER长度）和免疫金染色切片中沿着胞质ER延伸的金颗粒密度，如图5B。

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图5

用针对ER膜标记物的抗体对ERA进行免疫金标记

（A） 针对myc标记的Sec63（一种完整的内质网膜蛋白）进行免疫标记的细胞的代表性部分。作为一级抗体，我们使用了兔多克隆抗myc抗体，作为二级抗体，使用了15纳米金颗粒-结合抗兔抗体。细胞核、核膜、ER和ERA分别表示为N、NE、ER和ER。

（B） 高倍电子显微镜下的内质网部分。定量分析表明，每线性微米内质网中有5±2个金颗粒。

（C） ERA的高放大率。为了预测在特定的ERA中预期有多少金颗粒，我们首先计算并平均了ERA中存在的ER量（以线性微米表示的长度）（类似于图3B） ，并规范化其面积的值。这些计算确定每μm有20.8±3.3μm的ER²在ERA内部。这些值使我们能够预测如果ERA中填充了ER膜，那么在ERA的一段中预计会有多少金粒子。显示了两个具有代表性的ERA。中间图片中显示的ERA内部应含有2.4μm的ER，因此应含有12个金颗粒。我们数了12个金粒子。右侧的ERA可能包含2.7μm的ER，并且应该包含14个金颗粒；我们数了16个金粒子。右图显示了核质区的代表性视图。

（D） 量化每个区域的金色标签密度。为了评估我们的免疫金标记程序的信噪比，我们通过计算核质（N）区域和ERA区域上的金粒子数来评估背景标记，并将计数归一化到各个区域。

综上所述，迄今为止的数据表明，在UPR诱导后，ER显著增殖。在诱导后的稍后时间点，群体中的一些细胞将ER降低到未诱导水平图3表明这是通过将ER膜隔离到ERA中来实现的。有趣的是，Hac1^我归纳法，如中所述图1C、 DOC诱导的报告子结构导致ER增殖，但其本身不足以诱导ERA形成。自Hac1以来^我是酵母中唯一已知的传递Ire1信号的成分[50,51]，Hac1-和Ire1独立的第二信号必须源自ER管腔，并且是ERA形成所必需的。

由于ERA在结构上类似于自噬体，我们接下来试图确定UPR诱导的ER增殖和自噬之间是否存在功能联系。为此，我们使用自噬体形成的早期介质之一Atg8作为标记物[52,53].自动液位计8当自噬被诱导时，例如通过氮饥饿而被转录上调。Atg8是一种细胞溶质蛋白，会被脂化[54,55]并在离空泡很近的自噬前结构（PAS）中积累，在表达绿色荧光蛋白（GFP）-Atg8融合蛋白的细胞中，荧光显微镜下可以显示为点[56–58]. PAS被认为是形成自噬体的核化位点，自噬小体随后与液泡融合，液泡的膜和内部内容物在液泡中降解。由于Atg8（以及GFP-Atg8）被并入自噬体，然后在融合发生时沉积在液泡中，因此GFP-Atg 8被用作液泡处理的标记物：当自噬体传给液泡时，蛋白水解导致GFP部分的释放，它的寿命相对较长，因此可以被检测为离散碎片[59,60]. 中的数据图6一项研究表明，氮饥饿诱导的大量自噬导致了GFP-Atg8的大量诱导（比较通道1和通道4），其中大约一半在分析的时间点被蛋白水解为GFP(图1，车道4）。蛋白质水解在vps4Δpep4Δ缺乏液泡蛋白酶的细胞(图6D、 车道8）。在缺氮条件下，不会产生Hac1(图6A、 下部面板），与之前的观察一致，即这些条件不会导致普遍定期审议[61].

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图6

自噬标记GFP-Atg8的UPR诱导

（A） 用含有GFP-Atg8的质粒转化的野生型细胞在不含药物的合成培养基中、在UPR诱导条件下（+DTT和+TM）或在氮饥饿条件下（N饥饿）生长4小时，然后收获用于蛋白质制备。蛋白质提取物采用抗GFP抗体（顶面板）或抗Hac1抗体（底面板）进行蛋白质印迹分析。用BCA蛋白测定法测定总蛋白浓度。在每条通道中装载相同浓度的蛋白质，并通过Ponceau染色检查转移效率。指出了不同波段的特性。

（B） 通过荧光显微镜观察在上述条件下生长的表达GFP-Atg8的野生型细胞。

（C） 未经处理的提取物中检测到GFP-Atg8hac1Δ细胞或表达HAC1类^我（+DOC）使用抗GFP抗体进行Western blotting。

（D） 使用抗GFP抗体的提取物的Western blothac1Δ，ire1Δ，或vps4Δpep4Δ表达GFP-Atg8的细胞。突变细胞在常规条件、UPR诱导条件（+DTT）或氮饥饿条件（N饥饿）下生长。

同样，当细胞被UPR诱导剂DTT或衣霉素处理时，GFP-Atg8被强烈诱导(图6A） ●●●●。然而，与氮饥饿诱导的Atg8相比，我们没有观察到GFP结构域的断裂(图6A） 即使在药物存在下长时间孵育指数增长的细胞后（未公布的数据）。这些令人惊讶的结果表明，在UPR诱导的细胞和缺氮细胞中，GFP-Atg8的命运和Atg8的命运是不同的。当我们通过荧光显微镜比较UPR诱导细胞和氮保护细胞中的GFP-Atg8时，我们在UPR诱导的细胞中检测到大量PAS(图6B） ●●●●。

的表达式HAC1类^我来自糖皮质激素诱导的启动子的mRNA足以上调GFP-Atg8(图6C） 表明DTT和衣霉素可以通过Ire1和Hac1介导的经典UPR信号对Atg8转录发挥作用。这一结果令人惊讶，因为之前对普遍定期审议总转录范围的分析没有发现自动液位计8作为UPR靶基因[18]. 该悖论通过以下数据得以解决：图6D、 这表明，尽管Hac1^我足以诱导Atg8，但没有必要：即使在hac1Δ和ire1Δ细胞。我们之前的研究[18]应用了严格的筛选条件，要求被归类为UPR靶基因的任何基因的转录激活都依赖于Hac1和Ire1。ATG8，以及其他DTT和衣霉素诱导的自噬基因，ATG5、ATG7、，和第19页[18]因此，不包括在定义中作为UPR靶基因。

GFP-Atg8定位于ERA附近并促进ER应激下的细胞存活

为了确定ERA是否与GFP-Atg8染色结构（PAS）共定位，我们通过共表达GFP-Attg8和Sec61-cherry对细胞进行双重标记。与以前的报告一致[62]，我们在未诱导的细胞中仅发现少量PAS（大约每3-4个细胞中有一个斑点），可能反映了正常生长细胞中自噬的低构成率或PAS在Cvt途径中的作用。这张图片在UPR诱导后的早期时间点没有变化。相比之下，在UPR诱导3小时后，我们观察到PAS的大量增殖（每个细胞6±2个点）。PAS似乎随机定位于大多数细胞中，但用亲脂染料FM4-64染色细胞内膜时，总是与液泡或其他FM4-64着色结构（未公布的数据）以及具有这些结构的细胞群中的ERA紧密并列(图7). 这一并置表明，PAS可能参与了成核ERA，尽管它们并不与它们共存。重要的是，为了有力支持Atg8在ERA形成中起作用的观点，我们通过EM或荧光显微镜在atg8Δ细胞。

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图7

未折叠蛋白反应诱导过程中GFP-Atg8的定位

图中所示的一些经DTT处理的细胞图4使用荧光显微镜观察B表达GFP-Atg8和Sec61-cherry（作为ER标记）。GFP-Atg8定位于ER标记检测到的ERA附近。

鉴于自噬和UPR之间可能存在联系，我们接下来询问诱导自噬的能力是否会在内质网应激条件下给细胞带来生长优势。我们发现了自动液位计8以及其他五个测试过的自噬基因(ATG1、ATG9、ATG16、ATG20(图8)、和ATG19型[未公布的数据][63–66])在强烈的UPR诱导条件下，每种都是细胞生长所必需的：类似于hac1Δ细胞，atg8Δ在含有1mg/ml衣霉素的培养基上培养时，细胞没有生长(图8，右侧面板）。与…对比hac1Δ细胞自噬突变体在较宽松的条件下（0.2-mg/ml衣霉素；图8，中间面板）。这些结果证明了UPR和自噬之间的重要生理关系：自噬增强UPR，帮助细胞应对内质网应激的致命后果。

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图8

Atg8和其他自动液位计UPR诱导过程中需要基因

野生型系列稀释液，hac1Δ、atg1Δ和atg8Δ、at g9Δ和at g16Δ，和atg20Δ删除单元格和vps4Δpep4Δ双缺失细胞在不含药物（YPD）或不同浓度的膜霉素（TM；0.2或1.0μg/ml）的富培养基平板上生长。atg19Δ给出了与此处显示的其他自噬基因相同的结果（未发表的数据）。

有趣的是，严格UPR条件下的细胞存活并不依赖于液泡蛋白酶：vps4Δpep4Δ即使在1mg/ml衣霉素平板上，菌株也能显著生长(图8，右侧面板，底部行）。这一结果尤其显著，因为即使在正常生长条件下，该菌株也已出现生长障碍(图8，左侧面板，底部行）。

讨论

先前，UPR靶基因转录谱的广泛范围表明，UPR导致分泌途径的全面重塑，使细胞能够根据需要调整其ER蛋白折叠和分泌活动。转录因子XBP1是Hac1的后生动物同源物，在哺乳动物细胞中显示可诱导内质网扩张[67,68]. 在这里，我们发现在酵母中，发生了类似的细胞器扩张，内质网的体积在UPR诱导后至少增加了5倍。细胞扩大蛋白质折叠的机械和空间以满足新的生理状态的需要似乎是合乎逻辑的，在这种状态下，蛋白质在内质网中停留的时间更长，直到它们被正确折叠或降解。增加内质网可降低未折叠蛋白的浓度，从而防止聚集，并为正确折叠蛋白或降解折叠失败提供更多时间。令我们惊讶的是，我们发现一种内质网选择性UPR诱导的自噬形式，即内质网吞噬被激活，是细胞在严重内质网应激条件下生存所必需的，从而确立了UPR和自噬之间存在重要的生理联系。

由于UPR转录程序的执行导致内质网扩张，因此可以假设内质网吞噬提供了相反的作用，即减少内质网的体积，并伴随着内质网中积累的未折叠内质网蛋白。例如，最近有研究表明，人类α-1蛋白酶抑制剂（A1PiZ）的Z变异体根据其表达和聚集水平遇到不同的降解途径[69]. 正常情况下，A1PiZ是ERAD的底物。然而，当A1PiZ过度表达时，它通过分泌途径被送到液泡，内质网内聚集的过量A1PiZ通过自噬途径靶向液泡，这表明在这些条件下可能会诱导ER-吞噬。在肝细胞中，当药物被移除时，先前观察到巴比妥诱导的平滑内质网扩张因自噬而减少[70]; 类似地，在UT-1细胞中，HMG-CoA还原酶（一种内质网膜蛋白）过度表达诱导的内质网扩张在酶的表达下调时通过自噬减少[71,72]. 因此，作为向上和向下调节内质网丰度的稳态控制网络的一部分，UPR可能与内质网吞噬一起发挥作用，以平衡内质网合成和内质网降解。类似地，当细胞将碳源从使用脂肪酸转换为其他食物时，pexophagy会降解过量的过氧化物酶体[39,73]线粒体吞噬减少线粒体的丰度，例如在饥饿条件下或在呼吸条件下，线粒体很容易受到氧自由基的破坏[40,74]. 对于pexophagy，Pex14被认为在过氧化物酶体的选择性靶向降解中起作用[75]，但自噬如何靶向其他细胞器进行选择性螯合仍然是一个悬而未决的问题。

ERAD途径被认为持续从内质网中去除未折叠的蛋白质，并引导它们被蛋白酶体降解。我们之前已经表明，ERAD与普遍定期审议密切相关；如果另一条通路受损，则其中一条通路对细胞生存是必要的[18,76]. 许多ERAD基因是UPR靶标，正是它们在UPR诱导条件下的上调，才发现了这种联系。与ERAD基因相比，自噬基因在本研究中没有被定义为UPR靶点，并且UPR和自噬之间的联系没有引起注意。自噬基因被排除在UPR靶基因集合之外，因为它们受到双重控制：作为对ER中蛋白质错误折叠的反应，它们是由Hac1诱导的^我在Ire1依赖性UPR途径中，也可以通过在没有Ire1和Hac1的情况下可以运行的平行途径。很可能，起源于内质网腔的这种平行信号通路对应于先前描述的S-UPR，以控制HAC1类信使核糖核酸[24]. 因此，研究自噬基因的调控为破译酵母中Ire1依赖性ER-核信号的分子机制提供了一个强有力的新的实验角度。因为Hac1^我糖皮质激素受体激活的启动子的表达不足以诱导ERA的形成，除了激活Ire1外，还需要ER管腔的另一个信号。该信号可以（直接或间接）在内质网表面建立一个标记，标记细胞器为“受损”，以隔离到ERAs中，并且它可能利用与Ire1依赖性调节的相同途径自动液位计8转录，可能还有其他编码自噬机制成分的基因。

本研究中观察到的ERA显示出几个显著特征。首先，它们具有惊人的均质外观，大部分充满紧密堆积的膜池。其次，Sec61-cherry染色和Sec63-myc免疫金染色显示，池来自内质网。观察到含有ERAs的细胞缺乏扩张内质网，而扩张内质网络似乎在ERA形成过程中被消耗掉，这一观点得到了支持。第三，ERAs分隔双膜的外膜密布着核糖体，因此也至少部分衍生自ER。传统饥饿诱导自噬体的分隔膜来自何处，这是一个长期以来尚未解决的问题[77]. 因此，我们的发现通过显示内质网可以作为产生自噬体双层膜的膜源，首次确定了自噬结构的分隔膜的起源。最后，大部分缺乏结合核糖体的内囊膜和堆积池膜(图3E） ●●●●。池的紧密堆积与核糖体的缺失相一致，核糖体无法容纳在它们之间约16nm的空间内（核糖体直径约30nm）。综上所述，这些观察结果表明，必须存在一种复杂的机制，从细胞皮层剥离内质网，剥离大多数结合核糖体，使膜紧密堆积，并通过将其封装在一个也至少部分从内质网膜衍生出来的包膜中，选择性地将堆叠物封装在ERA中，并将周围的大部分胞浆排除在外。因此，ERA的形成涉及ER的受控“自足”。

在缺乏Atg8的细胞中没有形成ERAs，Atg8是自噬体生物发生的早期步骤所必需的。我们发现，在UPR期间，Atg8首先扩散分布在整个细胞液中。在稍后的时间点，Atg8合并为离散焦点（PAS）。这种现象发生在绝大多数细胞中（UPR诱导后3小时，每细胞6±2 PAS）。同时，20%的细胞形成ERAs，与PAS明显并列。值得注意的是，染色没有重叠。此外，与氮饥饿诱导的大自噬相反，没有Atg8传递到液泡（GFP-Atg8缺乏蛋白水解裂解表明）。原则上，两种不同但并非相互排斥的解释可以解释这一观察结果。首先，ERA生物发生选择性地排除了Atg8的联合包装。虽然含有Atg8-的PAS可能使ERA形成核，但荧光显微镜图像显示，它们的定位仍然不同。如果在氮饥饿诱导的经典自噬体形成过程中发生了类似的过程，那么周围细胞液的选择性较小的隔离可能会非选择性地将Atg8包合在一起。其次，当UPR诱导条件维持时，ERA不会与液泡融合。因此，ERA在面临持续折叠压力时的作用主要是隔离而非退化。与这个想法一致，vps4Δpep4Δ缺乏液泡蛋白酶的细胞可以在UPR诱导条件下生存，尽管它们在正常生长条件下已经生病。然而，无法形成自噬体的细胞在折叠压力下会死亡。这与氮饥饿期间的大自噬形成对比，后者的主要目的是蚕食部分细胞质，为饥饿的细胞提供循环代谢物。vps4Δpep4Δ细胞不能降解自噬细胞物质，因此在这些条件下会死亡[78]. 这两种可能性中的任何一种都进一步支持了ERA具有不同性质和/或与经典饥饿诱导的自噬体具有不同命运的概念。

如果内质网吞噬的主要功能是抵消UPR诱导的内质网扩张，为什么有些细胞在持续的折叠压力下已经形成了内质网？我们可以推测，扩大的内质网可以使细胞将潜在毒性的未折叠蛋白或聚集物分离到内质网的不同区域；它们优先包装到ERA中可能有助于完成这种分离，允许它们最终大量降解，或防止它们传递给子细胞。因此，内质网吞噬可能不仅是一种控制内质网大小的稳态机制，而且在某些条件下也可能起到解毒作用。ERA的这种额外作用的存在得到了以下观察结果的支持：ERA不是在表达Hac1的细胞中生成的^我他认为，在UPR诱导条件下ERA的形成不是由扩张的ER触发的，而是需要未折叠蛋白的实际存在。这个想法也可以解释为什么ERA只在暴露于折叠应力下的一小部分细胞中发现。在UPR诱导条件下，ERA的形成可能只有在大量未折叠蛋白积累时才会开始，并且这种情况可能仅在某些细胞中发生。根据广泛产生的额外PAS判断，UPR激活可能会导致几乎所有细胞最终通过ER-吞噬来缩小内质网。然而，只有一些细胞可能受到未折叠蛋白的挑战，以至于在内质网持续应激的情况下触发ER-吞噬。未折叠蛋白反应的Ire1依赖臂的激活导致S-UPR诱导，可能会增加在折叠应力期间形成ERA的细胞比例。一旦折叠应力停止，含ERAs的细胞比例是否会增加，这将是一个有趣的问题，因为ER-吞噬的稳态功能可能会支配其解毒功能。为了支持这种转换，我们在初步实验中看到，在UPR诱导剂被清除，细胞从压力中恢复后，ERA可以与液泡融合（S.Bernales和P.Walter，未发表的数据）。因此，ERAs向液泡的传递可能是一个可开启或关闭的受控过程。总之，关于ERAs形成的分子机制和细胞功能的许多问题仍然存在，但似乎很明显，ERAs-吞噬是ER扩张的一种对策，有助于使细胞器丰度恢复平衡。

在审查这项工作时，Yorimitsu等人[79]独立报道内质网应激触发自噬。他们的结果证实了转录上调自动液位计8和GFP-ATG8病灶形成。此外，作者表明，内质网应激诱导的Atg8通过脂质修饰被激活，GFP-Atg8病灶的形成取决于ATG12，表明这些结构对应于饥饿诱导的大自噬过程中的PAS。一个显著的区别是Yorimitsu等人报告GFP-Atg8降解，而我们没有看到降解(图6). 这种差异可能是由于生长条件造成的，因为它们使细胞进入稳定阶段，在此阶段饥饿诱导的大自噬被启动。

在我们的作品被接受出版后，Ogata等人[80]据报道，哺乳动物细胞内质网应激后，自噬被激活并促进细胞存活。

材料和方法

致谢

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脚注

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