核因子TDP-43与CFTR内含子8的多态性TG重复序列结合并导致外显子9的跳过：与疾病外显率的功能联系

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一月²⁰⁰⁴在AJHG杂志上，Groman等人发表了一项关于五种胸腺嘧啶（T5）常见缩写道的疾病外显率的合作研究CFTR公司基因（MIM602421). 通过分析大量男性不育或非典型囊性纤维化（CF[MIM）患者219700])他们发现，T5的致病或良性作用与聚吡咯上游TG重复序列的变异有关。特别是，较长的TG重复序列（12或13）与疾病表型相关，91%的受影响个体重复12或13个TG，而非22%的未受影响个体。尽管在其他地方已经提出了TG重复序列对T5变体的修饰作用（Cuppens等人。¹⁹⁹⁸)Groman等人的研究的主要新颖之处在于，来自不同地区的患者人数众多。由于在～10%的普通人群中发现了T5等位基因，本研究的结果强烈表明TG重复序列的测定可能具有重要的诊断价值。

Groman等人研究的病理学与由前mRNA剪接改变引起的越来越多的人类疾病一致，特别是由基因突变引起的疾病顺式-Faustino和Cooper最近审查了干扰替代剪接位点使用的作用元件（TG和T重复）(²⁰⁰³). 在这种特殊情况下，这些重复序列的致病作用是由于它们对CFTR公司外显子9在前mRNA剪接水平上，较长的UG重复序列（和较短的U片段）增加了外显子九的跳跃，导致产生非功能蛋白（Delaney等人。¹⁹⁹³; Strong等人。¹⁹⁹³).

Groman等人在研究中没有考虑的一个明显问题是，什么因素或机制决定了TG重复数是T5等位基因外显率的可靠预测因子。事实上，已经提出了一些机制，并且，两年多前，我们报告说TDP-43与UG重复序列特异性结合，并以这种方式促进跳过CFTR公司外显子9（Buratti等人。²⁰⁰¹). 在同一研究中，TDP-43的过度表达增加CFTR公司小基因系统中第9外显子的跳跃，以及反义寡核苷酸对其表达的消融导致同一外显子内含物增加。此外，TDP-43与UG重复序列的结合已被证明与重复长度密切相关，这为为什么更长的UG束决定更高的外显子9跳跃率提供了明确的理由（Buratti和Baralle²⁰⁰¹). 在这方面，值得指出的是，最近的一项独立研究证实，人类TDP-43（mTDP-43）的小鼠同源物也抑制人类CFTR公司小基因系统中的外显子9剪接（Wang等人。²⁰⁰⁴).

为了证明UG–TDP-43相互作用在剪接中起着直接作用，我们建立了体外剪接分析，这是一个有用的系统，用于定义所涉及的分子机制细节以及单个剪接因子所起的作用。为此，我们在由两个由111-nt内含子序列分隔的原肌球蛋白外显子组成的异源上下文中，在3′剪接位点引入不同的TG重复序列，然后引入5T（参见图1A类). 体外分析这些质粒转录RNA的剪接模式表明，UG元件抑制剪接。事实上，增加UG重复次数（UG₆，英国₈和UG₁₂)导致渐进性剪接抑制(图1B类). UG重复序列在抑制剪接中的这种直接作用也可以在添加未标记（UG）后观察到₁₂剪接混合物的RNA竞争对手：如所示图1C类，此操作可以恢复UG12U5 RNA的剪接活性。作为对照，此图还显示添加冷（UG）₁₂RNA寡核苷酸对PY7（wt）结构（不包含任何UG重复序列）的剪接没有任何影响，并且等量的对照30 mer RNA寡核苷酸的添加对PY7wt和PY7UG12U5 RNA都没有影响。

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图1

UG重复序列与TDP-43的相互作用，导致剪接抑制。A类，体外剪接分析图。方框表示外显子，水平线表示内含子序列。在UG6U5构建体中，为了保持与分支点的距离，去除了A残留物。这对于UG8和UG12是不可能的，并且保持了原来的CFTR 3′拼接位点。根据标准方案，在0小时和2小时后使用SP6 RNA聚合酶转录所有结构，并使用HeLa细胞核提取物（C4，Biotech）进行分析。未处理和拼接RNA(左边)在6%变性凝胶上溶解。B类剪接RNA，存在于PY7（wt）和PY7的转录本（UG6U5）中，在PY7结构中减少，在PY结构中缺失（UG12U5）。C类，约束竞争分析。未标记（UG）₁₂RNA以10倍摩尔过量添加到剪接混合物中，成功地挽救了PY7（UG12U5）结构中的剪接，但对PY7的（wt）RNA没有影响。D类正常（NE）和TDP-43缺失（NE-TDP43）核提取物的Western blot。TDP-43在耗尽后完全缺失。E类，核提取物中TDP-43的耗尽导致UG12包含构件中出现拼接形式（NE-TDP43车道）。添加纯化的GST-TDP-43（300 ng）完全恢复剪接抑制（通道NE-TDP43+GST-TDP43）。

已确定（UG）₁₂序列可以促进体外剪接抑制，然后我们检查剪接混合物中TDP-43的缺失(图1D类)导致剪接激活。图1E类事实上，核提取物中TDP-43的缺失导致UG12U5 RNA中剪接的激活，这种激活可以通过添加重组TDP-43（GST-TDP43）在耗尽的提取物中消除。总之，所有这些结果都与TG在CFTR公司内含子8与TDP-43结合，该蛋白反过来抑制外显子9的剪接。

综上所述，我们的结果不仅为Groman等人的关联数据提供了一种机制性解释，也可能为解释TG重复序列的可变表型外显率提供了依据。事实上，这种抑制性剪接因子浓度的个体和组织特异性变异（Buratti等人。²⁰⁰¹)这可能解释了22%的T5变异体和高TG值的未受影响个体中TG束的非完整外显率（Groman等人。²⁰⁰⁴)甚至可能代表决定个体是否会发展为多系统（非经典CF）或单症状（CBAVD）疾病的可能因素之一。

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