线粒体巯基氧化酶Erv1p/ALR在细胞溶质Fe/S蛋白成熟中的基本功能

摘要

简介

线粒体在细胞铁硫（Fe/S）蛋白质的生物生成中起着核心作用（由克雷格等., 1999;里尔等., 1999;里尔和基斯帕，2000年). 它们有一个复杂的装置，称为ISC（铁硫簇）组装机，由大约十种蛋白质组成。这些蛋白质中的许多类似于由国际标准委员会操纵子(郑等., 1998)表明这一关键线粒体过程的细菌起源。ISC组装机械是线粒体内Fe/S蛋白质生物生成所必需的，包括顺乌头酸酶和呼吸链复合物I、II和III的亚单位。此外，线粒体ISC组装成分参与细胞溶质Fe/S蛋白的成熟，如苹果酸异丙酯异构酶Leu1p(基斯帕语等., 1999;考特等., 2000;兰格等., 2000;锂等., 2001). 细胞核中存在微量的ISC组件成分Nfs1p(Nakai公司等., 2001). 然而，只有线粒体，而非Nfs1p的胞外形式，支持细胞溶质中的Fe/S蛋白组装(基斯帕语等., 1999). 迄今为止，只有一种成分在细胞溶质Fe/S蛋白成熟中具有特定功能，即酿酒酵母线粒体内膜的ABC转运体Atm1p。该蛋白存在于包括人在内的所有真核生物中（ABC7；贝克里等., 2000)和植物（Sta1；库什尼尔等., 2001)，并已被提议从线粒体基质中导出在胞浆中组装Fe/S蛋白所需的成分。

在这里，我们报道了Erv1p作为线粒体膜间空间的一种新成分的鉴定，它是线粒体外Fe/S蛋白成熟所特有的；哈吉亚等., 1994;焦尔达等., 1996)也称为肝细胞生成素(锂等., 2000)，被证明是酵母Erv1p的功能同源物。

结果

为了研究Erv1p的功能，我们利用了对温度敏感的服务器1突变株（称为Erv1^ts秒;利索斯基，1992年). 首先，我们分析了体内细胞溶质Fe/S蛋白Leu1p的成熟(科尔霍，1988年)和Rli1p（包含N末端铁氧还蛋白结构域；松原和塞基，1992年;基斯帕语等., 1999). 错误1^ts秒细胞在24°C下培养过夜，并将一部分转移到非允许温度（37°C）下5小时。细胞被标记为放射性⁵⁵铁在抗坏血酸存在下放置1小时，用玻璃珠打破细胞制备裂解物。成立⁵⁵铁进入Leu1p和HA-epitope标记的Rli1p后，用特异性抗体进行免疫沉淀。与免疫载体相关的放射性标记物的数量通过闪烁计数进行量化，并用作Fe/S簇合物的测量。在非允许温度下灭活Erv1p后⁵⁵与野生型细胞或Erv1相比，观察到Fe进入Leu1p和Rli1p^ts秒细胞在24°C下生长（图​（图1A1A和B）。Leu1p和Rli1p中Fe/S簇的缺陷形成不是多肽链合成减少的结果，因为在Erv1p（插入物）失活前后通过免疫染色检测到类似数量的这些蛋白质。同样，细胞铁吸收缺陷不能解释Leu1p成熟缺陷，因为⁵⁵Erv1p失活后，细胞裂解液中的铁含量甚至更高（图​（图1C）。1C） ●●●●。总之，这些发现表明Erv1p失活后细胞溶质Fe/S蛋白的成熟存在严重缺陷。

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图1。Erv1p失活会导致细胞溶质Fe/S蛋白成熟过程中的特定缺陷。野生型（WT）和Erv1^ts秒将含有或不含有编码HA-epitope-tagged Rli1p质粒的细胞在24°C的无铁最小培养基中培养过夜，其中一半转移到37°C培养5小时。用放射标记法对细胞进行标记(⁵⁵1 mM抗坏血酸存在下的Fe）氯化铁(基斯帕语等., 1999)在24或37°C下1小时，制备细胞裂解物，并摄取⁵⁵通过液体闪烁计数定量进入细胞的铁(C类). 使用针对细胞溶质Leu1p的抗血清进行免疫沉淀(A类)、HA-epitope(B类)或线粒体Bio2p(D类)和共沉淀⁵⁵用液体闪烁计数法测定铁含量。用免疫前血清（<2×10）进行免疫沉淀所获得的背景信号^三减去c.p.m/g细胞）。实验至少进行了四次。条形图表示标准误差。

Erv1p和ISC组装成分一样，在线粒体Fe/S蛋白的生物生成中也起作用吗？从Erv1中分离出线粒体^ts秒细胞在24或37℃下生长，并测定了几种Fe/S簇合酶的活性。乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶或细胞色素活性无明显变化c（c）Erv1p失活后检测到还原酶（图​（图2）。2). 此外从头开始通过使用上述放射标记和免疫沉淀分析，测量了Fe/S簇并入线粒体Fe/S蛋白Bio2p（生物素合成酶）的情况。功能性Erv1p的缺失并未导致Bio2p成熟度的任何降低（图​（图1D）。1D） ●●●●。综上所述，这些结果表明Erv1p对细胞溶质而非线粒体Fe/S蛋白生物生成的重要性。

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图2。线粒体Fe/S蛋白的正常活性不需要Erv1p功能。从野生型（WT）和Erv1中分离出线粒体^ts秒细胞在含有0.1%葡萄糖的乳酸培养基中24或37°C下培养5小时。测定了指示的含铁/硫簇蛋白和苹果酸脱氢酶的酶活性。脱氢酶；琥珀酸细胞c（c）红色，琥珀酸-细胞色素c（c）还原酶。

此前研究表明，在细胞Fe/S蛋白的生物生成过程中受损的酵母和人类细胞在线粒体内积累了高水平的铁（参见里尔和基斯帕，2000年). 因此，我们测量了从Erv1p缺陷细胞（在非允许温度下5小时）分离的线粒体中“游离”（即非血红素、非铁/硫）铁的数量。这些线粒体中的铁浓度为40-50 ng/mg线粒体蛋白，即比野生型细胞器中的铁浓度（2-2.5 ng/mg线粒体蛋白）高20倍。这种急剧增加与缺乏线粒体半胱氨酸脱硫酶Nfs1p的细胞产生的线粒体的发现相当(基斯帕语等., 1999)，肾上腺素能odoxin Yah1p的酵母同源物(兰格等., 2000)和肾上腺髓质素还原酶Arh1p(锂等., 2001)或ABC输送机Atm1p/ABC7(基斯帕尔等., 1999;贝克里等., 2000; 50–60 ng/mg线粒体蛋白）。因此，Erv1p是一种对铁稳态至关重要的新因子。有趣的是，Erv1p和Atm1p都只支持细胞溶质Fe/S蛋白的组装(基斯帕语等., 1999)增加了线粒体铁水平对胞浆中Fe/S蛋白功能作出反应的可能性。

为了解决人类ALR和酵母Erv1p是否代表功能性同源物的问题，使用上述Leu1p放射标记分析法分析了ALR支持细胞溶质Fe/S蛋白成熟的能力。ALR和伺服1基因在Erv1中表达^ts秒突变细胞。在非许可温度下，ALR在Leu1p的成熟过程中不能替代Erv1p（图​（图3A）。三A） ●●●●。这一结果与早期的发现一致，即ALR无法恢复缺乏Erv1p的酵母细胞的生长(霍夫豪斯等., 1999). 我们推断，功能互补的失败可能是因为在酵母细胞中，ALR被报道定位在胞浆中，而Erv1p与线粒体有关(霍夫豪斯等., 1999). 为了确定Erv1p和ALR的准确亚细胞定位，分离了酵母和人线粒体以及线粒体后上清液，对细胞器进行了亚分离，并对样品进行了免疫染色分析。Erv1p与酵母线粒体相关，并在膜间隙中发现（图​（图4A）。4A） ●●●●。使用从新鲜人类肝脏分离的细胞组分检测ALR的线粒体定位（图​（图4B）。4B） ●●●●。与Erv1p一样，ALR位于膜间空间（图​（图4C）。4C） ●●●●。人类蛋白质，类似于酵母Erv1p(李等., 2000)在非还原条件下，形成二聚体并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以～45 kDa迁移（图​（图4D）。4D） ●●●●。ALR的线粒体定位与ALR-GFP（绿色荧光蛋白）融合蛋白的胞浆外观形成对比(霍夫豪斯等., 1999). ALR-GFP未能正确定位于膜间间隙可能是由于GFP部分与线粒体靶向干扰和/或该蛋白在人类细胞培养中的过度表达所致。总之，Erv1p和ALR都是线粒体膜间隙的组成部分。

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图3。人ALR可以替代酵母Erv1p在细胞溶质Fe/S蛋白的生物生成中的功能。(A类)野生型（WT）和Erv1^ts秒使用表达Erv1p、ALR和各种ALR融合蛋白的突变细胞来分析⁵⁵通过图中描述的分析，铁进入细胞溶质Leu1p​图1。1每个实验至少进行三次。标准误差以条形表示。(B类)ALR融合蛋白的示意图。将各种蛋白质的指示部分融合到全长或截短的人ALR的N末端(霍夫豪斯等., 1999). 通过细胞分馏确定融合蛋白的定位（参见图​图4）。4). 酵母Erv1生长缺陷的补充^ts秒通过在37°C含甘油的富培养基上培养3天，对不同融合蛋白的细胞进行检测，并与野生型细胞的生长进行比较。

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图4。Erv1p和ALR位于线粒体膜间隙。(A类)从表达HA-epitope-tagged Erv1p的酵母细胞中分离出线粒体和线粒体后上清液（PMS）。通过细胞器的低渗肿胀（Sw）导致外膜破裂，以及细胞器在含有0.1%Triton X-100（Det）的缓冲液中溶解，然后用50µg/ml蛋白酶K（PK；迪克特等., 2001). 样品通过免疫染色进行分析，使用针对HA-上皮细胞的抗血清和线粒体膜间隙（CC）的蛋白质₁HL）和矩阵（Tim44p，Mge1p）。(B类)新鲜人肝脏用于制备分离线粒体（M）和线粒体后上清液。免疫染色检测ALR、细胞溶质Hsp70（ctHsp70）和线粒体frataxin。(C类)如（A）所示，对人肝线粒体进行肿胀、去污和蛋白酶处理(D类)他们接受非还原性4–12%梯度SDS–PAGE(李等., 2000)在存在或不存在10 mM二硫崔醇（DTT）的情况下，然后对ALR进行免疫染色。

显然，确保ALR靶向人类线粒体的序列在酵母中不起作用。因此，我们将ALR与细胞色素的膜间空间靶向信号融合b条₂（以产生pCytb₂-或者我们用Erv1p（Erv1-81-ALR；霍夫豪斯等., 1999; 图​图3B）。三B） ●●●●。融合蛋白位于酵母细胞的线粒体膜间空间，能够完全恢复Erv1的野生型生长^ts秒非允许温度下的电池（图​（图3B）。三B） ●●●●。因此，Erv1p的N末端为ALR定位到膜间空间提供了靶向信息。重要的是，膜间空间放大的ALR支持细胞溶质Fe/S蛋白Leu1p的组装，其程度与Erv1p几乎相同（图​（图3A）。三A） ●●●●。相反，通过向ALR的N末端添加一个前序列（pCoxIV-ALR；图​图3）。三). 总之，当ALR被引导至线粒体膜间隙时，它可能会在细胞溶质Fe/S蛋白成熟过程中接管酵母Erv1p的基本功能。我们得出结论，线粒体ALR和Erv1p是功能性同源物。

Erv1p/ALR蛋白家族成员在其C末端包含一个保守的巯基氧化酶结构域(李等., 2000;先克维奇等., 2000). 该域携带点突变呈现Erv1^ts秒对温度敏感的电池(利索斯基，1992年)因此，Erv1p在胞浆Fe/S蛋白成熟中的功能至关重要。然而，催化结构域不足以介导这一过程，因为N末端截短的ALR蛋白（被称为pCytb₂-81-ALR）不能在功能上补充Erv1^ts秒应变。含有该融合蛋白的细胞在支持细胞溶质Leu1p中Fe/S簇的组装方面仅表现出微弱的活性（图​（图3）。三). 总之，非服务的N末端和巯基氧化酶结构域对Erv1p/ALR在细胞溶质Fe/S蛋白成熟过程中的功能至关重要。

讨论

我们的研究确定Erv1p/ALR是一种新的线粒体成分，专门参与细胞溶质Fe/S蛋白的组装(里尔和基斯帕，2000年). Erv1p与酵母ISC组装机械的核心成分一样，是生命中不可或缺的(利索斯基，1992年). 这表明线粒体在线粒体外Fe/S蛋白的生物合成中起着重要作用。Erv1p/ALR同源物与它们在膜间空间的特殊功能一致，几乎存在于从真菌到人类的所有真核生物中(Hagiya公司等., 1994;利索夫斯基等., 1995;波利梅诺等., 1999)Erv1p/ALR蛋白家族成员共享一个保守的C末端结构域，该结构域具有巯基氧化酶活性，即靶蛋白中二硫键的氧依赖性形成(胡伯等., 1999;李等., 2000,利索夫斯基等., 2001). 迄今为止，只确定了病毒巯基氧化酶E10R的靶点，即一种病毒编码的谷胱甘肽，它反过来将二硫键引入其他病毒蛋白中，作为病毒在胞浆中组装的先决条件(先克维奇等., 2000). 虽然Erv1p的巯基氧化酶结构域是细胞溶质Fe/S蛋白成熟所必需的，但Erv1p的特异性酶活性相对较低(胡伯等., 1999;李等., 2000). 因此，二硫键的形成是否是Erv1p功能的基础尚待确定。即使在厌氧条件下，我们也没有发现Erv1p与Fe/S簇稳定关联的证据（未显示）。未来对Erv1p分子功能的解释需要识别相互作用的蛋白质和体外细胞溶质Fe/S蛋白成熟的重建。

整个Erv1p/ALR蛋白，包括保存较差的N末端，是Fe/S蛋白组装中发挥功能所必需的。相反，哺乳动物ALR的C末端巯基氧化酶结构域足以支持肝脏再生(焦尔达等., 1996;锂等., 2000). 绝大多数ALR位于细胞内，ALR的表达并不局限于肝组织(霍夫豪斯等., 1999). 因此，参与细胞溶质Fe/S蛋白的组装似乎是ALR的主要任务。当然，这一功能对所有真核细胞类型都至关重要，而ALR作为一种肝营养生长因子的拟议作用仅限于肝细胞，可能只有在细胞受损后才有效。

根据当前工作模式(里尔和基斯帕，2000年)，线粒体基质的ISC组分预组装并包装Fe/S簇，然后可以将其输出到胞质溶胶中，这一过程可能涉及ABC转运蛋白Atm1p/ABC7。由于Erv1p/ALR位于膜间空间，这些蛋白质可能随后作用于Atm1p/ABC7。我们的研究结果为阐明线粒体Erv1p/ALR参与胞浆Fe/S蛋白生物生成和细胞铁稳态的分子机制提供了基础。

方法

酵母菌株和细胞生长。以下菌株酿酒酵母使用过：JRY 675(材料一,乌拉3-52，他的4-519, Δ吕2)为野生型；宠物492-6A[材料一,乌拉3-52, Δ吕2;宠物492ts(利索斯基，1992年)]。为了产生含有C末端血凝素（HA）标记的Erv1p的酵母菌株ERV1型用AAAGAGTCTACAATCTCAGAATTCTG和AAACCCGGGCTGATACGGCTAATTTCAAG作为正向和反向引物，通过PCR扩增该基因。将得到的DNA片段克隆到YIplac211/HA整合质粒中，经生态RI转化为酵母菌株W303(材料一,乌拉3-1，ade2-1，trp1-1，his3-11,15，leu2-3112). PCR证实DNA整合到正确的位点。

使用了以下质粒：YEp351-ADH-cERV1(利索斯基，1992年); YEp352-ADH-Rev1-81-ALR和YEp352-ADH-pCoxIV-ALR(霍夫豪斯等., 1999); pRS426-GPD-ERV1来自质粒pRS426-GPD(芒伯格等., 1994)并携带ERV1型基因在Sma公司我限制网站。质粒YEp352-ADH-pCytb₂-ALR和YEp352-ADH-pCytb₂-81-ALR编码细胞色素前序列融合蛋白b条₂（残基1–85）和全长和N末端截断的ALR（参见图​图4）4)通过PCR从人类cDNA克隆中扩增ALR编码区生成。正向引物分别为CCCAAAGATATCGATGGGCCCGGCGAGCG和CCCAAAGA TATGCGGCGCAGCAGCG；反向引物为CCCGGTACCCTAGTCACAGAGCCATCCTT。DNA片段被插入生态RV和千磅载体pBSC-preCytb的I位点₂.阅读框被删除为巴姆你好——千磅I片段并插入到载体YEp352-ADH的相应位点。这个RLI1型使用正向（AAAGAGCTCGACTACATGCTGCTTCAGTCA）和反向（AAAGTCGACTACCGGTTACCAAAAA）引物通过PCR扩增出该基因和另外300个上游核苷酸。PCR产物被克隆到囊I–萨尔质粒Yep351/3HA的I位点引入C末端HA标记的编码区。该嵌合体再次用正向（AAAGAGCTCGACTACATGCTGCTTCAGTCA）和反向（AAACTCGAGCGCGCACTGCAGCAGCAG）引物扩增，并克隆到囊I–Xho公司pRS426质粒的I位点(芒伯格等., 1994). 通过DNA测序验证所需序列。酵母细胞的生长在别处有详细说明(基斯帕语等., 1999).

其他方法。使用了以下公布的方法（除非另有说明，请参见基斯帕语等., 1999)：DNA和PCR操作；酵母细胞转化；酵母和人肝线粒体的分离(罗宾逊等., 1987); 用玻璃珠打破细胞，使整个细胞裂解；用batophenanthroline法测定“游离”铁（即非血红素、非Fe/S）；放射性测量⁵⁵铁掺入细胞溶质和线粒体Fe/S蛋白；苹果酸脱氢酶、顺乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶和琥珀酸细胞色素的酶活性c（c）还原酶。酶活性测定的标准误差在5%至15%之间。为了提高兔抗人ALR的抗体，纯化的His₆-使用ALR标记片段（残基81–205）。

致谢

参考文献