Temporal phosphoproteomics reveals WEE1-dependent control of 53BP1 pathway

Valdemaras Petrosius; Jan Benada; Olaf Nielsen; Erwin M. Schoof; Claus Storgaard Sørensen

doi:10.1016/j.isci.2022.105806

iScience。2023年1月20日；26(1): 105806.

2022年12月13日在线发布。数字对象标识：2016年10月10日/j.isci.2022.105806

预防性维修识别码：项目经理C9827073

PMID：36632060

时间磷酸蛋白质组学揭示了53BP1通路的WEE1依赖性控制

瓦尔德马拉斯·彼得罗斯,¹ 扬·贝纳达,¹ 奥拉夫·尼尔森,² 欧文·M·斯科夫,^三和克劳斯·斯托加德·瑟伦森^1,^4,^∗

作者信息文章注释版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料: 文件S1。图S1–S7
毫米c1.pdf（220万）
GUID:620B0304-210B-4463-A988-9CF917E032CD
表S1：与图1相关的时间进程实验的磷蛋白组学数据
毫米c2.xlsx（290万）
GUID:9F9DDA41-18F0-4FBF-B4CE-58B6AB1DD839
表S2.与图1相关的单时间点实验的磷蛋白组学数据
毫米c3.xlsx（230万）
指南：C04B1AFA-A713-417C-8328-686E83B8CCB9
表S3.来自两个数据集的与图1和图6相关的组合磷蛋白组数据
毫米c4.xlsx（140万）
GUID:C73784EF-A126-421E-8A3C-A61E19E43167
表S4.与图2相关的相对激酶活性和相关矩阵推断表
毫米c5.xlsx（68K）
GUID:CB616C36-6AF4-4864-8A07-3B755E241443
表S5.与图4相关的经验预测CDK场址表
毫米c6.xlsx（69K）
指南：B2E4D5D3-E182-4426-AAEF-E6F8A09149D5
表S5.WEE1和CDK1抑制后预测的CDK位点折叠变化表，与图S4相关
毫米7.xlsx（4.5万）
GUID:693DD77E-E0F0-4D5F-BA20-887B8657D492

数据可用性声明

•
质谱数据已存入ProteomeXchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过具有数据集标识符的MassIVE合作伙伴存储库PXD036373型和PXD036374型.
•
用于分析蛋白质组学数据的所有代码都已保存(https://doi.org/10.5281/zenodo.6344325)并于发布之日公开。
•
重新分析本文中报告的数据所需的任何其他信息可从引线触点根据要求。

总结

类Wee1蛋白激酶（Wee1）抑制S期和G2期细胞周期素依赖性激酶（CDKs）的活性。对WEE1的抑制引起CDK活性的急剧增加，这扰乱了复制动力学并损害了细胞周期检查点。值得注意的是，在癌症治疗试验中测试了WEE1抑制剂，如阿达沃沙提布；然而，WEE1调节的磷酸蛋白质组及其动力学尚未得到系统研究。在这项研究中，我们确定了阿达沃沙提布抑制WEE1后细胞磷酸蛋白质组的急性时间分辨变化。这些处理显著提高了CDK活性，具有明显的磷酸化动力学，揭示了600多个潜在的未标记CDK位点。此外，我们确定了WEE1在控制关键DNA修复因子MDC1、53BP1和RIF1中多个聚集位点的CDK依赖性磷酸化中的主要作用。功能分析显示，WEE1精细调节CDK活性，允许53BP1向染色质募集。因此，我们的发现揭示了WEE1抑制剂临床应用中具有翻译潜力的WEE1控制靶点和途径。

主题领域：分子生物学、癌症、Omics

图形摘要

在单独的窗口中打开

集锦

•
我们破译了WEE1激酶抑制引起的急性磷蛋白组改变
•
这些变化主要反映了CDK1和CDK2的激活，而不是其他CDK
•
WEE1间接抑制DNA修复和DNA复制因子的磷酸化
•
WEE1微调CDK活动以指导53BP1到染色质的招募

分子生物学；癌症；组学

介绍

真核细胞周期由特定的细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）调控，CDKs介导关键因子的及时磷酸化。由于该过程是单向的，因此细胞使用细胞周期检查点来确保在继续之前满足细胞需求。过度的基因毒性应激，如双链断裂（DSB）的存在，会引发细胞周期DNA损伤检查点，通过CDK抑制延迟进展。因此，检查点激活为修复提供了时间，在DSB的情况下，它主要由两条修复路径执行：经典的非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。¹53BP1和BRCA1是两个主要的DNA修复因子，在调控DNA修复途径选择中起着关键作用。²^,^三^,⁴^,⁵53BP1通过其效应蛋白（如RIF1）促进NHEJ途径。^三^,⁶值得注意的是，CDK活性也必须在正常细胞周期中受到严格调控，以确保细胞周期的及时进展以及DNA复制的有序执行。⁷^,⁸^,⁹因此，异常CDK活性升高会引发非法增殖以及基因组不稳定。

Wee1样蛋白激酶（Wee1）通过抑制CDK1和CDK2上Y15的磷酸化来控制CDK活性。¹⁰^,¹¹WEE1在促进G2/M检查点和控制CDK1活动方面发挥着重要作用；然而，通过CDK2，WEE1在S阶段发挥了至关重要的作用。WEE1活性的丧失会导致大量起源放电、核苷酸耗竭、MUS81/SLX4介导的染色体粉碎以及复制叉保护的丧失。⁸^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵

癌细胞经常表现出WEE1的高表达，可能抵消癌基因激活或p53缺失的影响，否则会引发高水平的复制应激。¹⁶WEE1是癌症治疗的一个有吸引力的靶点，因为WEE1抑制利用了癌细胞对G2/M检查点的依赖性，并将复制应激加剧到无法忍受的程度。已经开发出一种用于WEE1的抑制剂阿达沃司替布（AZD-1775）¹⁷它已经成为60项临床研究的焦点(临床试验.gov, 2021-11). 尽管大多数研究旨在明确探讨WEE1在G2/M检查点中的作用，但已有证据表明，WEE1抑制的S期影响有助于癌症特异性致死。¹⁸^,¹⁹^,²⁰此外，通过阿达沃瑟提布和吉西他滨联合治疗胰腺癌和卵巢癌的II期临床试验，利用这些类型癌症的高复制应激水平，报告了积极的结果。²¹^,²²考虑到WEE1的生物学重要性以及阿达沃沙提布或其他WEE1抑制剂在临床上的广泛应用潜力，令人惊讶的是，还没有全面的以WEE1为中心的磷酸蛋白质组的报道。在这里，我们利用定量时间分辨磷酸蛋白质组学研究了WEE1调节的磷酸化动力学，以探索响应WEE1抑制的信号级联。通过量身定制的生物信息学分析，我们扩展了脯氨酸导向S/T激酶和WEE1的基因体效应的现有知识。此外，我们发现抑制WEE1会导致关键DNA修复蛋白的过度磷酸化和失活。我们确定了WEE1调节靶点和激酶途径，可以为设计与WEE1抑制剂的组合治疗策略提供有价值的信息。

结果

阿达沃沙提布处理样品的磷蛋白组学分析

WEE1抑制具有急性作用，导致CDK过度激活，并在治疗的第一个小时内影响表型。⁸^,¹⁷因此，为了通过磷酸蛋白质组分析研究WEE1的作用，细胞与阿达沃沙提布孵育20、40、60和90分钟，或仅在90分钟的单个时间点孵育，生成两个独立的数据集，这些数据集被整合以实现更高的磷酸蛋白质组覆盖率(图1A） ●●●●。选择肉瘤细胞系U2-OS进行蛋白质组研究，因为它具有良好的WEE1功能特征，尤其是阿达沃瑟提布和更长时间的WEE1-siRNA治疗产生了类似的结果。⁸为了激发CDK活性的强烈爆发，同时尽量减少对细胞周期位置的影响，我们处理了1μM的阿达沃沙提布细胞，研究表明，阿达沃沙提布可在60分钟内系统地增加CDK底物磷酸化，并几乎完全消除CDK1上抑制性T环磷酸化，⁸尽管如此高的浓度可能会影响其他激酶的活性。值得注意的是，1μM浓度与接受175 mg药物治疗的患者（临床试验中常用的剂量）的阿达沃沙提布血浆水平对应。²³我们没有将治疗延长到90分钟后，因为细胞积累了DNA损伤，这可能会由于继发性细胞事件而使我们的结果错综复杂(图S1A） ●●●●。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合串联质谱标签对蛋白质磷酸化的全球规模进行量化。Ti-IMAC用于磷酸化肽的富集。量化的蛋白质和磷酸肽丰度使用自定义算法进行标准化（参见STAR方法)并采用主成分分析对数据的技术质量进行了评估(图S1B和S1C）。在第一主成分中，用阿达伏色替布处理的样品与对照样品明显分离，表明具有良好的再现性。我们量化了>16000个磷酸化位点，其中>4000个磷酸蛋白没有缺失值(图1B） ●●●●。我们观察到携带双重抑制性T14:Y15磷酸化的磷酸肽丰度呈线性下降，而单个T14的磷酸肽则相应增加(图1C） ●●●●。CDK1和CDK2产生包含T14的相同胰蛋白酶肽；Y15修饰，所以我们无法识别这两种激酶的具体变化。然而，根据之前的工作，¹⁰^,¹¹我们假设这两种激酶的磷酸化都降低了。我们没有获得任何其他直接证据表明WEE1可以磷酸化除CDK1和CDK2以外的其他靶点。抑制性Y15磷酸化的降低伴随着CDK底物磷酸化的增加(图S1D），表示WEE1功能被抑制，随后CDK被激活。经过统计测试，我们发现在校正总蛋白丰度变化后，整个时间过程中磷酸肽的显著变化数量不断增加。治疗20分钟后，我们在最后一个时间点检测到718个差异磷酸肽和1704个(图1E） ●●●●。抑制WEE1对非同步细胞周期分布影响不大(图S1E）尽管我们确实观察到有丝分裂细胞的数量逐渐增加(图S1F和S1G）。总之，我们生成了数据来研究阿达沃司替布的即时影响，其中包括WEE1-CDK信号轴以及对磷酸化动力学的全局影响。

在单独的窗口中打开

图1

WEE1抑制导致磷酸蛋白质组快速大规模改变

（A）实验和计算工作流概述。生成了两个数据集，一个是时间分辨的（20、40、60、90分钟n=3），另一个是单个时间点（90分钟n=4）。WEE1i表示adavosertib治疗，n表示每个数据集中的重复次数。

（B）磷蛋白组数据集检测摘要条形图。显示了单个和组合数据集的磷酸蛋白、磷酸肽和磷酸化位点的数量。

（C）调整CDK抑制性t环T14和Y15磷酸化量化Z评分图，使第一个时间点等于零。黑色条表示调整后的Z轴分数。

（D） WEE1对CDK1和CDK2的T环抑制磷酸化的说明。

（E）通过统计测试确定不同时间点显著改变的磷酸肽。错误发现率（FDR）<0.05。

Adavosertib治疗导致CDK1和CDK2活性快速增加

激酶活性或其下游通路的改变是癌症对特定激酶抑制剂以及其他化疗药物敏感性的基础。²⁴为了更好地理解WEE1抑制的基因体效应，我们通过修改以前使用的方法推断出相对的激酶活性。²⁴检测到的磷酸化位点用Omnipath数据库中的相应激酶进行注释，²⁵和斯托弗的Z轴评分组合法用于将标准化磷酸化位点丰度合并为每个时间点的单个值（参见STAR方法). 为了避免错误的活性估计，我们只考虑了数据集中至少有5个定量位点的激酶的活性。为了确定通过WEE1的adavosertib是否可以调节除CDK1和CDK2以外的其他CDK，我们首先研究了所有可能的CDK的相对激酶活性（RKA）。抑制WEE1导致CDK1和CDK2的相对活性增加，但对其他CDK没有显著影响(图2A）这证实了对WEE1活动进行的原始研究。¹⁰^,¹¹在随后的时间点观察到CDK6和CDK5的显著激活；然而，与CDK1和CDK2相比，这是相当小的。20分钟后观察到CDK1和CDK2活性的最大增加，并且继续增加，尽管幅度较小(图2B） ●●●●。这表明只有CDK1和CDK2对WEE1功能的丧失作出了快速反应。

在单独的窗口中打开

图2

adavosertib对激酶活性的快速影响超出了CDK1和CDK2

（A）检测到磷酸化位点大于5个的可量化CDK的相对激酶活性（RKA）。红色条表示显著性（p=0.01）边界。黑色条表示活动得分的SE。

（B） CDK1和CDK2的相对激酶活性发生变化。黑色条表示活动移位的传播SE。

（C和D）RKA图显示与CDK活性相关的其他受影响激酶的活性。

（E） CK2亚单位CSNK2A1和CSNK2A2已知CDK依赖性磷酸化位点的图示。

WEE1影响多种激酶途径

我们推断阿达沃沙提布可能影响多种激酶；因此，我们利用数据集的时间分辨特性，基于相对激酶活性进行活性相关性分析(图S2). 从相关性图中，我们检测到其他已知的细胞周期驱动激酶如极光激酶B（AURKB）和polo-like激酶1（PLK1）之间的激酶活性正相关性，概括了有丝分裂激酶的预期激活。AURKB激酶活性在整个时间过程中呈线性增加，而PLK1仅在随后的时间点被激活(图2C） ●●●●。已经注意到阿达沃沙提布可以抑制PLK1的活性体外;²⁶^,²⁷然而，进一步的研究表明，阿达沃沙提布治疗刺激PLK1活性在赛璐珞中,²⁸与我们的发现一致。相反，我们观察到RKA与激酶负相关，如哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）、酪蛋白激酶2（CK2）双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶2（DYRK2）和AKT(图2D），这可能反映了阿达沃沙提布在应用浓度下的离靶效应。化合物可用的基于结合的基因体分析可用于排除这些影响；²⁶然而，研究表明，adavosertib结合不能很好地代表活性效应。²⁷一般来说，最好避免偏离目标的影响；然而，考虑到临床环境中使用的高浓度（175 mg剂量，血浆中约1μM），已确定的激酶活性变化也可能存在于患者中。尽管存在这些局限性，CK2激酶可能是进一步机制研究的重点。CK2控制重要的细胞途径，并可包含两个催化亚单位：CSNK2A1和CSNK2A2。²⁹虽然CSNK2A1活性呈线性下降，但CSNK2A2没有明显的趋势，这表明阿达沃沙坦驱动的高CDK活性只影响其中一个催化亚基(图2D） ●●●●。与此相一致，CSNK2A1上存在五个CDK站点，而CSNK2A2上没有这五个站点(图2E） ●●●●。先前的研究发现，阿达沃谢提布不影响CSNK2A1激酶活性体外与我们试验中使用的浓度相同，²⁷表明WEE1通过抑制CDK活性可能影响CK2功能。

磷酸化剖面分析

磷酸化事件是高度动态的，受多种激酶和磷酸酶活性改变或其他细胞过程的影响；因此，蛋白质磷酸化状态在一个时间过程中的不同时间点可能不同。因此，研究磷酸化动力学可以提供具有重要功能意义的宝贵信息。为了确定磷酸化动力学的模式，我们使用了模糊c-均值聚类，这在时间分辨的磷酸蛋白质组数据集中表现良好。³⁰我们使用计算出的最佳参数，根据磷酸化模式将磷酸化位点分为八个簇。簇1、簇4和簇6在20分钟后仅显示磷酸化水平的短暂变化，而簇3显示磷酸化程度的延迟增加(图S3A） ●●●●。此外，在WEE1抑制20分钟后，簇1和簇4中磷酸化水平的统计显著变化最高，这表明即使在这个早期时间点也可能发生重要的信号事件(图S3B） ●●●●。

四个簇（2、5、7和8）的磷酸化水平表现出稳定的变化，其趋势是线性或相对磷酸化水平在20分钟时迅速改变，随后保持升高(图3A） ●●●●。按簇2和簇5分层的站点显示相对丰度总体下降。值得注意的是，他们展示了CSNK2A1特有的图案(图3B）这与之前显示的CSNK2A1活性下降相一致(图2D） ●●●●。相比之下，集群7和集群8显示出不断增加的水平(图3A） ●●●●。这些簇产生的基序富集了与CDK靶位点一致序列（S/T-P-x-K/R）显著相似的残基(图3B）表明这些簇主要包含这些激酶的底物。为了数值量化与已知CDK底物的簇状磷灰石相似性，我们构建了位置特异性评分矩阵（PSSM）。³¹^,³²为了生成CDK1和CDK2特异性PSSM，我们通过Omnipath从PhosphositePlus和SIGNOR数据库中提取具有相邻氨基酸序列的磷酸化位点，并使用二项式概率模型计算氨基酸位置得分³¹背景频率失调(图S3C） ●●●●。然后，我们对检测到的磷酸化位点进行评分，并通过逻辑回归将任意分数转换为概率。根据生成的基序，我们观察到聚类7和聚类8的得分最高(图3C） ●●●●。根据收集的数据和分析，我们认为簇7和簇8在WEE1抑制下游含有CDK依赖性事件。

在单独的窗口中打开

图3

磷酸化动力学分析揭示了WEE1抑制引发的潜在CDK驱动事件

（A）模糊-c（c）-表示选定簇的（FCM）簇轮廓，时间绘制在x轴上，调整后的Z分数绘制在y轴上。每条线对应于单个磷酸肽的动力学。颜色强度表示对各个簇进行分类的概率。Z分数通过加减最小值进行调整。

（B）用二项式概率模型生成A中簇的磷酸化位点序列模体。x轴表示磷酸化位点的氨基酸位置。氨基酸颜色基于化学性质。

（C） CDK1底物概率得分中值基于位置特异性得分矩阵（PSSM）。可能捕获CDK依赖性事件的簇7和簇8用红色表示。该线表示CDK1底物概率中位数的绝对偏差中位数。

CDK基板的经验预测

我们着手确定簇7和簇8中的磷酸化位点之前是否被识别并分配给CDK。然而，根据磷脂酶Plus和SIGNOR数据库，只有一小部分检测到的磷酸化位点与CDK1和CDK2激酶相关(图S4A） ●●●●。缺少磷灰石注释可能表明对受WEE1影响的信号级联的看法不完整。为了纠正这一点，我们利用PSSM方法识别潜在的CDK1和CDK2靶点，同时反褶积依赖于其他激酶的过度磷酸化事件。为了评估我们的方法准确预测已注释的CDK引用的能力，我们进行了接收者操作特征（ROC）分析，这表明PSSM预测算法能够准确区分CDK基底(图S4B） AUC值为0.943（CDK1）和0.882（CDK2）。通过ROC分析，我们获得了CDK概率截止值，用于将磷酸化位点分类为CDK1和CDK2靶点。由于相似的共有基序和靶点之间的重叠，CDK特异性底物的分类具有挑战性。在没有CDK2的情况下，CDK1补充其在驱动细胞周期中的作用，³³进一步强调了高度的相似性。因此，我们将CDK1和CDK2的预测位点合并为潜在CDK位点的通用列表。通过基于预测概率对激酶进行排序，我们确定了798个潜在的CDK位点。我们对这些位点进行了基因集过度表达分析，发现它们主要存在于参与细胞周期相关过程的蛋白质上，即CDK底物的预期生物主题(图S4C） ●●●●。为了提高我们确定的CDK位点的准确性，我们将理论预测与我们的经验数据相结合。我们假设，由于CDK活性升高，在WEE1抑制后，CDK位点的磷酸化水平会增加(图2A） ●●●●。根据CDK概率和ROC分析得出的临界值，进一步筛选归类为簇7或簇8且磷酸化水平显著增加（FDR<0.05）的磷酸化位点(图4A） ●●●●。这种方法生成了628个新的CDK站点的暂定列表，与数据库中当前已知的站点数量相抗衡(图4B） ●●●●。所鉴定的位点也与已知的CDK磷酸化位点有很好的重叠。在簇8中，绝大多数预测站点与注释的CDK站点重叠，其中一半以上在簇7中重叠(图4C） ●●●●。然而，我们的经验方法没有对多个注释的CDK站点进行相应的分类。

在单独的窗口中打开

图4

结合先前的知识数据库，通过时间分辨磷蛋白组数据预测大量CDK位点

（A）预测理论和经验CDK位点的方案。计算每个定量磷酸化位点的CDK1或CDK2概率，用于将位点划分为非CDK位点和理论CDK位点。然后，通过进一步过滤潜在的CDK列表以进行FCM分层和显著上调，将实验数据考虑在内。

（B）条形图显示了PhosphoSitePlus（PSP）和SIGNOR数据库中注释的CDK位点以及本研究中预测的位点数量（Petrosius等人）。

（C）维恩图显示了注释（PSP和SIGNOR数据库）、理论（CDK1或CDK2的最高PSSM概率分数）和经验CDK站点之间的重叠。

（D）火山图，基于从Petrone等人获得的量化数据。，2016年。褶皱变化绘制在x轴上，p值的负对数10绘制在y轴上。预测和注释的CDK站点用不同的颜色标记。

（E）条形图显示CDK1抑制后未显著改变（NS）、上调或下调的非CDK、注释CDK和预测CDK位点的分数。

为了证实我们鉴定的有效性，我们将预测的位点与一项独立研究进行了比较，该研究使用CDK1与5μM RO-3306的化学抑制来鉴定潜在的CDK1位点。³⁴我们提取了数据集中检测到的位点的丰度量化，并根据折叠变化和p值将其分类为未改变、上调和下调(图4D和4E）。非CDK位点在所有三类中分布均匀，而已知的CDK位点具有较高比例的下调位点。值得注意的是，我们确定的位点在CDK1抑制后表现出更明显的下调位点富集，这支持了我们预测的可靠性(图4E） ●●●●。为了更直接地证实我们预测的CDK位点，我们用阿达沃沙提布和CDK1抑制剂RO-3306共同处理细胞，该抑制剂也用于Petrone等人。研究。³⁴从全球来看，预测的CDK位点在WEE1抑制后磷酸化增加，而在添加CDK1抑制剂后磷酸化减少(图S4D）进一步证实了我们的预测准确性声明。总的来说，我们确定的磷酸化位点可以显著支持数据库包含的CDK位点列表，并作为宝贵的资源。

CDK底物磷酸化具有明显的动力学

我们感到惊讶的是，簇7和簇8中的磷酸肽具有相似的基序和CDK概率分数，尽管它们似乎表现出不同的磷酸化动态模式(图3A和3B）。为了直接比较这两个集群，我们对这些集群进行了Michaelis-Menten建模，以统计评估它们之间的差异。根据该模型，与簇8相比，簇7的磷酸化半衰期（K）要慢得多。然而，分类为簇8的磷酸化位点可以得到更高程度的磷酸化，这表明CDK底物存在两种不同的磷酸化模式(图5A和5B）。基于此，集群被称为“慢”和“快”。

在单独的窗口中打开

图5

WEE1抑制后CDK底物显示双峰磷酸化动力学

（A和B）使用Michaelis-Menten模型从FCM聚类分析簇7和簇8。褪色线代表磷酸化位点。图中显示了模型参数Vm和K。

（C）为预测和注释的CDK位点生成的序列模体分层为慢或快簇。着色是基于氨基酸的化学性质。

（D）快簇和慢簇之间丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和赖氨酸（K）残基的频率差异。氨基酸位置绘制在x轴上，频率在y轴上不同。黑色条表示通过重采样估计的频率SD。

（E）在与磷酸化位点不同的装箱距离处的潜在Cy基序频率。条形图表示通过重新采样估计的频率SD。

（F）慢集群和快集群中CDK位点的细胞隔室比较。

（G）快慢簇中得分最高的磷酸化位点的磷酸化趋势。点代表标准化的丰度，用褪色的线连接起来代表不同的重复。图中显示了Michaelis-Menten曲线。在KIF20A的情况下，拟合没有收敛，因此使用直线代替。

为了表征这种“慢”和“快”的二分法，我们提取了在这些簇中发现的预测和已知的CDK位点，并分析了基于已知的CDK特异性决定因素选择的可能影响磷酸化率的不同特征。³⁵^,³⁶^,³⁷我们生成了簇特异性序列基序，以确定磷酸化基序中的潜在差异。这些基序显示了优先磷酸化残基和+3位置的显著差异，其中赖氨酸残基在快速簇中的得分高于慢速簇(图5C） ●●●●。为了直接比较任何显著的频率差异，我们对基序重新取样100次，以估计磷酸化位点丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基多达7个氨基酸的平均值和不确定性(图5D） ●●●●。分层到快速簇的磷酸化位点显示丝氨酸残基的频率增加，而苏氨酸的频率相应降低。与最佳CDK共识基序（S/T-P-x-K）相比，我们观察到赖氨酸残基在+3位置的频率增加。此外，赖氨酸残基在+2和+4位置更频繁(图5B） ●●●●。虽然这些残基不是典型基序的一部分，但它们被证明是CDK底物特异性的决定因素。³⁸总之，磷酸化基序中的这些差异有助于更快的磷酸化。³⁹

在细胞周期蛋白的帮助下，CDK被招募到其底物中，细胞周期蛋白识别靶蛋白上的细胞周期蛋白结合（Cy）基序。在酵母中，研究表明，功能性Cy基序需要在磷酸化位点的20-80个氨基酸范围内才能发挥作用，并且可以在调节底物磷酸化时间方面发挥重要作用。³⁹^,⁴⁰因此，我们使用正则表达式提取了已知CDK位点两侧的潜在Cy基序。然而，我们没有观察到围绕磷酸化位点的潜在Cy基序的可用性有任何重大差异(图5E）尽管由于使用正则表达式，可能会模糊对不同差异的检测，因为仅氨基酸匹配并不能保证功能。

最后，我们进行了基因集过度表达，以研究集群之间的细胞划分是否存在显著差异。快速磷酸化位点富集用于染色体关联，尽管缓慢位点没有表现出相同的富集，这表明在具有特定细胞定位的蛋白质上发现的位点更有可能表现出快速磷酸化动力学(图5F） ●●●●。作为示例，我们提取了RIF1和KIF20A的磷酸化位点，它们分别是快速和缓慢的(图5G） ●●●●。正如预期的那样，我们观察到这些位点的磷酸化特征存在显著差异。从这些观察结果中，我们得出结论，CDK磷酸化位点的磷酸化动力学受到底物细胞定位和固有基序特性的影响。

Adavosertib触发关键DNA复制和修复因子的过度磷酸化

磷酸蛋白质组数据集是基于假设的探索的自然起点。有趣的是，经过20分钟的阿达沃塞提布治疗后，RIF1（S2260:S2263）和MCM4（S120）蛋白上的磷酸化位点具有最高的反应。这两种蛋白质在DNA复制和DNA修复中起着至关重要的作用。^三^,⁶^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴由于这些过程与癌症治疗高度相关，我们研究了通路中的其他蛋白质是否显示出过度磷酸化位点。我们从数据集中提取了所有与DNA复制和修复基因本体相关的蛋白质，并将具有最多有效位点的蛋白质绘制成圆形树状图，其中每个节点对应一个显著改变的磷酸肽(图6A和6B）。WEE1抑制导致DNA复制因子中多个残基的过度磷酸化，如LIG1和ORC1(图6B） ●●●●。此外，我们观察到一些DNA修复蛋白如BRCA2、RAD51AP1和XRCC1的磷酸化增加。值得注意的是，我们在MDC1、53BP1和RIF1上观察到了特别多的磷酸化位点(图6A） ●●●●。为了研究这些位点是否位于已知的功能区，我们绘制了这些因子的磷酸化谱。我们注意到，所有三种DNA修复因子的位点主要定位于远C末端区域(图6C–6E）。MCM4和ORC1上的高磷酸化位点分别位于N-末端和中心部分(图6F和6G）。已经注意到53BP1和RIF1的C末端区域的磷酸化可以抑制其功能。⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸此外，根据我们的模型，对53BP1和RIF1影响最大的磷酸化位点被预测为假定的CDK位点，并显示出快速动力学，将其分层为“快速”FCM簇。

在单独的窗口中打开

图6

Adavosertib触发DNA复制和修复因子中多个聚集位点的磷酸化

树状图可视化检测到参与DNA修复（A）和复制的蛋白质的磷酸肽显著改变（FDR<0.01）。（B）点大小表示WEE1抑制90分钟后的logFC。显示（C）MDC1、（D）53BP1、（E）RIF1、（F）MCM4和（G）ORC1的磷酸化模式的图。磷灰石的logFC（90分钟）在y轴上表示，氨基酸序列在x轴上表示。显著改变的磷酸化位点标记有一个标签，指示蛋白质上磷酸化残基的位置。站点从数据集1和2合并。

WEE1通过限制CDK活性促进53BP1功能

基于观察到的磷酸化簇，我们假设阿达沃塞提布可以触发RIF1和53BP1的过早过度磷酸化，从而抑制其功能。为了确定这种情况是否属实，我们用基因毒性药物和阿达沃沙提布联合处理细胞，以便于检测53BP1的定位。此外，我们利用基于定量图像的细胞术量化复制应激（染色质结合RPA）、DNA损伤（γH2AX）和53BP1病灶形成的水平。由于RIF1与DNA损伤位点的关联依赖于53BP1，^三^,⁶我们专注于53BP1的招聘。用羟基脲（HU）处理细胞不同时间(图S5A），我们观察到染色质结合的RPA强度显著增加，表明复制应激，进而主要在复制细胞中的53BP1病灶数量增加(图7A和第5章B.由于特定的细胞周期群体受到影响，我们在进行汇总统计计算之前，根据细胞周期剖面对细胞进行分割，并排除动态范围较低的片段(图S5C和S5D）。仅WEE1抑制导致染色质结合RPA和γH2AX与HU水平相当(图S5E和S5F），但未检测到53BP1病灶增加(图7A） ●●●●。重要的是，添加阿达沃谢尔提布阻止了HU诱导的53BP1在染色质中的募集，该募集已经从30分钟的时间点开始(图7B） ●●●●。此外，53BP1的总病灶强度和病灶大小均降低，这表明观察到的影响并不是由于53BP1向更少数量的病灶去定位所致(图S5G） ●●●●。添加Adavosertib并没有限制HU诱导的RPA积累，这表明存在复制应激(图7C） ●●●●。为了测试观察到的对53BP1的影响是否对复制应激具有特异性，我们用电离辐射（IR）处理细胞，并在IR后1、2和3小时通过细胞周期阶段监测53BP1病灶水平(图S6A） ●●●●。IR增加了整个细胞周期中53BP1病灶的形成(图7D、，S6系列B、和S6C）。根据我们之前对HU的观察，在IR之前抑制WEE1导致抑制53BP1病灶的形成。值得注意的是，这在CDK1和CDK2最活跃的S期和G2期细胞中表现得很明显(图7E和第5章C） ●●●●。此外，已确定的作用并不是细胞系特异性的，因为阿达沃沙提布在转化细胞系和非转化细胞系中均导致53BP1病灶形成减少(图S7A–S7E）。

在单独的窗口中打开

图7

WEE1通过限制CDK活性促进遗传毒性应激诱导53BP1向染色质的募集

（A）散点图显示基于DAPI和平均染色质结合RPA强度的细胞周期分布。颜色强度表示53BP1焦距计数。黄色虚线段表示用于汇总统计计算的单元格填充。用4mM羟基脲（HU）处理细胞4小时，使用1μM浓度的WEE1i（阿达沃司替布）。N=2，N>900。

（B）点图显示通过HU、WEE1i或HU+WEE1i治疗时间解决的53BP1病灶平均值。N=2，N>900，通过Kolmogorov-Smirnov检验计算p值表示p-val<0.0001。比较了HU和HU+WEE1i条件。黑色条表示SE。

（C）显示平均染色质结合RPA强度与平均53BP1病灶计数之间相关性的图。N=2，N>900，黑色条表示SE。

（D和E）在A和B中为As，但用2Gy的IR处理细胞。IR后3h的时间点显示为D.N=2，N>2500。

（F和G）条形图显示添加CDK1-（RO-3306-10μM）和CDK2（CDK2抑制剂II-5μM）特异性抑制剂后的平均53BP1焦点值。黑色条表示SE.N=2，N>500，p值通过Kolmogorov-Smirnov检验计算表示p-val<0.0001。所有实验至少在生物复制品中进行，并显示了一个具有代表性的复制品。N表示实验重复的次数，N表示每个条件下量化的最小细胞数量。

我们的数据表明，WEE1促进了53BP1与染色质的遗传毒性应激诱导关联。为了确定这是否是由于CDK活性控制所致，我们用靶向CDK1或CDK2的抑制剂进行了救援实验。⁴⁹^,⁵⁰我们使用了抑制剂，因为CDK1是必不可少的，使耗尽或缺失不合适。值得注意的是，阿达沃司替布与CDK1或CDK2抑制剂联合处理可以挽救HU和IR处理的细胞中53BP1病灶的形成，这表明WEE1抑制后53BP1病灶的减少依赖于CDK活性(图7F和7G）。CDK抑制剂选择性差，通常影响多个CDK，因此不可能自信地分离CDK2和CDK1功能。⁴⁹^,⁵¹与CDK2相比，CDK1抑制剂在修复53BP1病灶方面更有效。这可能表明CDK1具有更显著的作用；然而，更强的作用可能是由于抑制剂的化学性质，因为CDK1抑制剂对CDK底物磷酸化的作用更强(图S7F） ●●●●。尽管我们不能自信地确定仅对CDK1或CDK2的影响，但观察到的间期53BP1病灶的抑制明显是由CDK驱动的。

讨论

调查结果摘要

我们的研究利用深度磷酸化蛋白质组分析结合生物信息学分析揭示了下游激酶介导的信号通路在阿达沃塞提布灭活WEE1时的作用。抑制WEE1可快速触发高CDK1和CDK2活性，进而影响其他激酶信号通路。我们确定了CDK底物的特定时间WEE1调节的磷酸化模式以及控制它们的特征。此外，我们还表明，与有丝分裂作用类似，WEE1可以间接控制参与DNA复制和修复的因子。具体而言，我们发现WEE1依赖性CDK活性的失调通过阻断其与染色质的关联影响53BP1。

WEE1和kinome

WEE1在控制CDK中起着至关重要的作用，CDK是与许多细胞功能交织在一起的关键激酶。WEE1活性的丧失迅速导致高水平的CDK驱动的DNA损伤；因此，需要快速灭活WEE1才能自信地阐明WEE1的作用，而不会产生混淆效应。⁸^,¹⁴这使得大多数遗传方法（如siRNA缺失或CRISPR敲除）不可行，因为细胞在WEE1失活4小时后开始积累γH2AX(图S1A） ●●●●。因此，我们使用阿达沃沙提布对WEE1进行化学抑制，这使我们能够快速灭活WEE1并将副作用降至最低，¹⁷尽管结果可能会受到潜在抑制剂离靶效应的影响。之前进行了两项研究体外阿达沃司替布的激酶组分析，并评估了其结合和对激酶活性的影响。²⁶^,²⁷根据我们的激酶活性推断，我们观察到WEE1的抑制导致CSNK2A1、MTOR、AKT和DYRK2激酶活性的抑制(图2D） ●●●●。尽管阿达沃谢提布可以与CSNK2A1结合，但它并不影响激酶的活性，这表明CSNK2A1活性的降低(图2D和2E）不是由于抑制剂的非靶向效应。总的来说，这些新发现的功能性激酶链接为进一步的探索奠定了基础，可以阐明WEE1如何影响非CDK激酶的功能。

潜在CDK磷酸化位点的预测

我们研究的一个重要方面是，CDK活性的受控失调有助于检测假定的新磷酸位点。我们基于先前鉴定的CDK1和CDK2磷酸化位点构建了PSSM，并将其与我们的实验数据相结合，以预测初步的CDK磷酸化位点(图4A） ●●●●。我们使用ROC分析为我们的预测算法确定了628个高精度的潜在CDK位点(图S4C） ●●●●。然而，训练数据可能会出现过拟合，因为用于生成PSSM的相同模体用于逻辑回归模型。原则上，可以使用使用神经网络或集成学习方法的更高级算法来进一步提高预测精度。⁵²^,⁵³然而，我们选择了PSSM，因为它们最近已成功用于预测激酶底物。³²^,⁵⁴^,⁵⁵此外，PSSM还显示出显著的简单性和高度的可解释性，这是上述算法所没有的。我们通过与一项独立研究交叉引用我们的初步CDK位点来证实这一预测。³⁴CDK1抑制后，我们的大多数新位点确实下调(图4D和4E）。确定的位点位于参与基本细胞途径的蛋白质上，这将有助于研究人员研究CDK活性和基本细胞过程。

具有不同磷酸化动力学的CDK底物群体的鉴定

CDK驱动的底物磷酸化的时间在细胞周期的排序中起着至关重要的作用。异位靶磷酸化已被证明扰乱细胞周期阶段的顺序，⁴⁰^,⁵⁶强调准确磷酸化时间的重要性。在酵母中，细胞周期特异性CDK底物磷酸化部分是通过利用早期（G1/S）细胞周期阶段靶点上的细胞周期蛋白结合基序实现的。⁴⁰因此，我们观察到两种不同的磷酸化动态特征(图5A和5B）；然而，在离磷酸化位点的功能相关距离处，我们没有观察到潜在Cy基序的可用性存在显著差异(图5E） ●●●●。由于Cy基序的功能验证有限，我们使用正则表达式来识别潜在的Cy基序列。这种方法可以识别与当前Cy基序模式[R-x-L]匹配的线性氨基酸序列中的所有实例，尽管许多匹配的序列可能没有功能，因为它们不考虑3D蛋白质结构。然而，我们注意到磷酸化位点两侧的氨基酸频率有显著差异(图5C和5D）。具体而言，我们观察到丝氨酸优先于苏氨酸残基，并增加了磷酸化位点+3位的赖氨酸频率。相对于CDK1，CDK2对赖氨酸残基有更高的偏好，³⁷提示快速磷酸化动力学可能在很大程度上由CDK2介导(图5C和5D）。

WEE1失活触发DNA复制和修复因子的快速磷酸化

维持基因组完整性的机制不仅在预防恶性转化方面发挥作用，而且在癌症治疗中也有针对性。¹众所周知，CDK活性通过促进和抑制DNA修复蛋白的功能，在DNA修复中发挥双重作用。⁵⁷^,⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰我们发现阿达沃塞提布触发了53BP1和RIF1的C末端残基的过度磷酸化(图6C和6D），与抑制作用有关。除了CDK1直接磷酸化外，PLK1和AURKB分别促进53BP1和RIF1的失活。然而，在这两种情况下，这都取决于CDK的活性。⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁶¹^,⁶²特别是，53BP1的C末端过度磷酸化发生在53BP1定位到受损染色质所必需的区域内（也称为焦点形成区域，1220-1711aa）。该区域依赖CDK的过度磷酸化已被证明可以阻止53BP1定位到DNA损伤部位，从而抑制DNA修复。在生理条件下，这只发生在有丝分裂期间，以防止有毒的姐妹端粒融合。⁴⁶值得注意的是，我们在这里描述了WEE1的抑制通过在间期的类似机制抑制DNA损伤后53BP1向染色质的募集(图7B和7E）。因此，WEE1抑制已被证明阻碍DNA修复；⁵⁸^,⁶⁰因此，增强的53BP1磷酸化可以潜在地使细胞对诱导DSBs或引起复制应激的基因毒性试剂敏感。⁴³^,⁶³^,⁶⁴最近，有报道称53BP1和RIF1都可以保护停滞的DNA复制叉免受DNA2核酸外切酶介导的过度降解。⁴³^,⁶³因此，我们之前已经证明，WEE1可以防止DNA2在停滞的复制分叉处对新生DNA的降解。¹⁵因此，WEE1可通过特异性限制CDK驱动的53BP1和RIF1磷酸化，促进停滞叉细胞免受DNA2驱动的降解。考虑到对53BP1招募的显著影响，阿达沃塞提布触发高CDK活性，这不仅导致DNA损伤，而且阻碍了应该减轻损伤的机制。

WEE1抑制与癌症治疗

虽然WEE1在调节G2/M检查点方面起着重要作用，但它在S期的作用也很重要。⁶⁵显然，阿达沃沙提布可以与其他诱发复制应激的癌症治疗药物（如吉西他滨、CHK1、ATR或PARP1抑制剂）协同作用，这可能是通过将复制应激加剧到无法忍受的水平。¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶⁶因此，WEE1抑制在卵巢癌和胰腺癌中显示出良好的效果，这些癌症具有较高的复制应激基础水平。²¹^,²²过去的研究已经解决了WEE1在S期中的作用，表明阿达沃司替布通过影响MCM4、RIF1和RRM2来触发起源激发和核苷酸耗竭的增加⁸^,¹³^,⁴⁸以及通过调节SLX4/MUS81进行染色体断裂。¹⁴然而，它在S阶段的作用还不完全清楚。在这里，我们提供了关键DNA复制和修复蛋白上依赖于WEE1的磷酸化位点的资源。此外，我们在细胞途径中发现了许多磷酸化位点，如有丝分裂和mRNA代谢，这在本研究中没有探索。总的来说，我们的研究结果表明，WEE1控制的CDK活性的作用尚不明确，可能对WEE1抑制剂的临床应用产生重大影响。

研究的局限性

在本研究中，我们利用大规模磷酸蛋白质组数据集的计算分析。通过使用不同的算法，我们在多个激酶和WEE1-CDK轴之间建立链接，并预测假定的CDK位点。必须强调我们选择的数据采集和分析方法的某些局限性。根据之前的研究，我们使用了相对较高浓度的阿达沃沙提布，这让人想起了临床研究中的血清浓度。⁸^,¹⁵^,²³^,²⁷^,²⁸^,³⁴尽管经常使用这种浓度，但它们增加了将数据卷积为离靶效应的风险。在这里，基于PSSM的过滤起着关键作用，因为它允许我们根据周围的氨基酸序列排除不太可能是CDK底物的位点。在我们的验证实验中，我们使用了CDK抑制剂，这种抑制剂已知会影响CDK家族的多个成员，在实践中类似于阿达沃沙提布在高浓度下使用。¹⁵^,³⁴^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵¹^,⁵¹^,⁶⁷^,⁶⁸尽管如此高的浓度似乎过高，但它们需要有效地抑制靶激酶活性；⁴⁹然而，在后续研究中分析和利用研究结果时，应考虑非目标影响。最后，在我们的生物信息分析中，我们没有考虑磷酸酶活性，磷酸酶活性也可能在观察到的变化中发挥作用。尽管如此，我们预计我们的发现将是一个有价值的资源，并作为未来研究中假设生成的基础。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源	来源	标识符
抗体

γH2AX	默克公司	类别号PC130；RRID：AB_2238184号
53制动踏板1	Novus生物制品	类别号NB100-304，RRID：邮编：10003037
巴西航空公司1	圣克鲁斯	目录号sc-6954，RRID：AB_626761号
注册退休人员	Millipore公司	类别号MABE285，RRID：AB_11205561
CDK基板	细胞信号技术	目录号9477，RRID：AB_2714143号
CDK第15页	细胞信号技术	类别号9111，RRID：AB_331460号
CDK1型	细胞信号技术	分类号77055，RRID：AB_2716331号
肌动蛋白	Millipore公司	类别号MAB1501，RRID：AB_2223041号
HRP抗小鼠	病媒实验室	目录号PI-2000，RRID：AB_2336177型
HRP抗兔	病媒实验室	目录号PI-1000，RRID：AB_2336198号

化学品、肽和重组蛋白质

RO-3306型	加州生物化学	分类号217699；中国科学院：872573-93-8
CDK2抑制剂II	圣克鲁斯	分类号sc-221409；中国科学院：222035-13-4
阿达沃瑟提布/MK-1775/AZD1775	SelleckChem公司	类别号S1525；中国科学院：955365-80-7
羟基菌属	默克公司	类别号H8627；化学文摘社：127-07-1
TMTpro™16plex标签试剂组	赛默飞世尔	猫#A44520型

关键商业分析

MagReSyn®钛IMAC高压	北欧LabLifeNordic	产品目录号MR-THP002

存放的数据

蛋白质组学数据	这篇论文	大量的：PXD036374型; 大量的：PXD036373型
用于蛋白质组学数据的自定义代码	这篇论文	泽诺多：https://doi.org/10.5281/zenodo.6344325
QIBC数据和分析代码	这篇论文	泽诺多：https://doi.org/10.5281/zenodo.7022473

实验模型：细胞系

U2OS系列	美国标准菌库	HTB-96型
MFC10A型	美国标准菌库	CRL-10317号
RPE公司	美国标准菌库	Krister Wennerberg实验室
OVCAR3公司	美国标准菌库	Krister Wennerberg实验室
OVCAR8公司	美国标准菌库	Krister Wennerberg实验室

软件和算法

Visual Studio代码	微软	https://visualstudio.microsoft.com
R项目	不适用	https://www.r-project.org
聚火11	蒂布科	注册登记号：SCR_008858
蛋白质组发现者	赛默飞世尔	RRID：SCR_014477
Tidyverse公司	（Wickham等人，2019年）⁷⁵	https://tidyverse.tidyverse.org/
gg棱镜	（夏洛特·道森2021）	https://doi.org/10.5281/zenodo.4556067
ggplot2	（Wickham等人，2016）	网址：https://ggplot2.tidyverse.org
群集探查器	（Wu等人，2021）⁷⁴	https://doi.org/10.1089/omi.2011.0118
维恩图	（Chen和Boutros，2011）⁷⁶	https://cran.r-project.org/web/packages/VennDiagram/index.html
全能运动员	（Türei等人，2016）²⁵	https://omnipathdb.org/
Mfuzz公司	（Kumar和Futschik，2007）⁷⁰	http://mfuzz.sysbiolab.eu/
ggseq标志	（瓦吉，2017）⁷¹	https://omarwagih.github.io/ggseqlogo网站/

在单独的窗口中打开

资源可用性

引线触点

有关资源和试剂的更多信息和请求，请直接联系首席联系人Claus Storgaard Sörensen，并由其完成(clausstorgaard@bric.ku.dk条款).

材料可用性

这项研究没有产生新的独特试剂。

实验模型和主题细节

细胞系

人骨肉瘤细胞系U2OS和视网膜色素上皮RPE细胞系在补充有10%胎牛血清（FBS；Cytiva）和1%青霉素链霉素（10000 U/mL；Gibco）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Gibco's）中培养。将人乳腺细胞系MCF10A培养在补充有5%马血清（Gibco）、1%青霉素链霉素、20 ng/mL EGF（PeproTech）、10 mg/mL胰岛素（Sigma-Aldrich）、0.5 mg/mL氢化可的松（Sigma Aldrich。在罗斯维尔公园纪念研究所1640培养基（RPMI1-1640，Gibco）中培养高级浆液性卵巢癌细胞系OVACAR3和OVCAR8，该培养基补充了10%牛粪血清和1%青霉素链霉素。所有细胞在37°C和5%CO2中培养，并定期检查支原体感染。

方法详细信息

MS样品制备

对U2OS细胞进行0、20、40、60和90分钟（n=3）的时程实验，并对含有1μM阿达沃沙提布的单时间点数据集进行0或90分钟（n=4）的处理。治疗后，根据Kulak等人，2014年），通过刮取和处理细胞。简单地说，使用100μL裂解缓冲液（6 M盐酸胍、10 mM TCEP、40 mM CAA、50 mM HEPES pH8.5）对收集的细胞进行裂解。样品在95°C下煮沸5 min，然后在4℃的Biorruptor超声波水浴（Diagenode）中进行5 x 30秒的高超声处理^o个C.使用Pierce™Rapid Gold BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher）测定蛋白质浓度后，取出200 ug进行消化。样品用10%乙腈按1:3稀释，50 mM HEPES pH 8.5，以1:50（酶蛋白比）的比例添加LysC（MS级，Wako），样品在37^o个C持续4小时。用10%乙腈将样品进一步稀释至1:10，50 mM HEPES pH 8.5，以1:100（酶蛋白比）的比例添加胰蛋白酶（MS级，Promega），并在37^o个C.通过添加2%的三氟乙酸（TFA）到最终浓度1%来抑制酶活性。在TMT标记之前，使用SOLAμ™SPE板（Thermo Fisher）对肽进行脱盐。吸附剂由40μl 100%甲醇（HPLC级，Sigma）、40μl 80%乙腈和0.1%甲酸活化。随后用40μL的1%TFA和3%乙腈使板平衡2x，然后加载样品。然后用200μL 0.1%甲酸清洗平板2次，用40%乙腈和0.1%甲酸将结合肽洗脱到干净的500μL Eppendorf管中。将洗脱的肽浓缩在Eppendorf-Speedvac中，并在50mM HEPES（pH8.5）中重新构成，用于TMT标记。根据制造商的说明使用TMTPro 16plex（赛默飞世尔）。标记以相同比例汇集的肽后，使用200μL Ti-IMAC HP（ReSyn Bioscience）富集磷酸肽。Ti-IMAC颗粒与200 L 70%乙醇平衡5分钟，然后与200μL 1%NaNH平衡_三溶液10分钟。然后用200μL 80%乙腈、1M乙醇酸和5%TFA洗涤颗粒三次。将用80%乙腈、1M乙醇酸和5%TFA以1:1稀释的混合肽加载到颗粒上，并轻轻搅拌培养30分钟。然后除去上清液并作为蛋白质组样品保存。用400μL的80%乙腈、1%的TFA洗涤两次粒子2分钟，再用两次400μL 10%的乙腈0.1%的TFA清洗两次粒子。然后通过添加100μL 1%NaNH分三轮洗脱磷酸肽_三溶液20分钟。然后用40μL TFA酸化洗脱的磷酸肽溶液，并稀释超抗原蛋白质组样品，以将乙腈浓度降至5%。然后使用SOLAμ™SPE板对肽溶液进行脱盐，然后将肽浓缩在Eppendorf Speedvac中。浓缩肽储存在-80^o个C、。

在质谱分析之前，使用离线的ThermoFisher Ultimate3000液相色谱系统，在5μl/min流速下，使用高pH分馏（5mM碳酸氢铵，pH 10）对肽进行分馏。在120 min梯度（5%至35%乙腈）上分离30μg肽，每120秒收集一次组分。将所得60个组分合并成30个最终组分，用1%TFA酸化至pH<2，并根据制造商的方案装载到EvoSep阶段。对于富集的磷酸肽，将组分的数量调整为可用磷酸肽的总量，以确保每个组分的收集量为～500ng。

MS数据采集

TMT标记的样品

在EvoSep One仪器上，使用预设的“每天30个样本”或“每天15个样本”方法对每个组分的肽进行分析。在44-min梯度上洗脱全球蛋白质组肽，并使用DD-MS2方法运行的Q-Exactive Exploris 480仪器（Thermo Fisher Scientific）进行分析。以120000的分辨率采集了完整的MS光谱，AGC靶为3×106或最大注入时间为50 MS，扫描范围为350–1500 m/z。MS2光谱以45000的分辨率获得，AGC目标值为1×105或最大注射时间为86 MS，归一化碰撞能量为32，强度阈值为1e5。第一个质量设置为110 m/z，以确保捕获TMT报告离子。动态排除设置为60秒，排除电荷状态<2、>6和未知的离子。对于磷酸化肽，梯度长度加倍至88分钟。通过运行复合细胞裂解物质量控制标准验证MS性能的一致性，并监测色谱以检查再现性。

TMT定量蛋白质组学分析

使用Proteome Discoverer 2.4分析原始文件。在处理和共识步骤中启用TMT报告离子定量，并将光谱与UniProt获得的9606人类数据库进行匹配。蛋白质N端的动态修饰设置为氧化（M）、脱酰胺（N，Q）和乙酰。半胱氨酸氨基甲酰（C残基）和TMTPro（肽N末端和K残基）被设置为静态修饰。将所有结果过滤至1%FDR，使用内置报告离子量化器进行蛋白质定量，并使用内置t检验进行统计显著性测试。

无标签量化

用于无标签定量的样品按上述方法处理。在EvoSep One仪器上使用“每天20个样本”的方法分析磷酸蛋白质组和蛋白质组肽，并在运行高分辨率MS1数据相关采集方法的Q-Exactive Exploris 480仪器（Thermo Fisher Scientific）上分析。在120 000下收集全质谱，AGC目标为3x10ˆ6或最大注入时间为50 MS。扫描范围为400-1000 m/z。MS2光谱是以60000分辨率获得的，AGC目标为10e5。使用75个8 m/z的窗口，每200 m/z进行一次MS1扫描。原始文件是使用Spectronaut 16软件进行的分析。

数据规范化和统计测试

蛋白质组丰度用于蛋白质组和磷酸蛋白质组的磷酸肽丰度。数据规范化分两步进行。首先，通过将丰度乘以样本特定比例因子来调整样本装载量：

{S公司 F类}_{我} = \frac{\bar{A类 S公司}}{{A类 S公司}_{我}}

（方程式1）

在哪里？ ${S公司 F类}_{我}$ 是样本的比例因子我， $\bar{A类 S公司}$ 是所有样本的平均丰度总和，以及 ${A类 S公司}_{我}$ 是样品的丰度i、。随后，为每个复制生成人工内部参考标准物的蛋白质/肽特定比例因子，并用于归一化，以减少由于生物复制处理引起的变化：

{A类 对 S公司}_{我, j个} = \frac{\sum^{n个} {A类}_{我}}{n个}

（方程式2）

\bar{{A类 对 S公司}_{j个}} = \frac{\sum^{米} {A类 对 S公司}_{j个}}{米}

（方程式3）

{A类 对 S公司 S公司 F类}_{我, j个} = \frac{\bar{{A类 对 S公司}_{j个}}}{{A类 对 S公司}_{我, j个}}

（方程式4）

{A类}_{我, j个}^{A类 对 S公司} = {A类}_{我, j个} \cdot {A类 对 S公司 S公司 F类}_{我, j个}

（方程式5）

在哪里？ ${A类对 S公司}_{我, j个}$ 是蛋白质/肽的人工参考标准j个在生物复制中我和n个是生物复制中独特条件（时间点）的数量。然后计算生物复制比例因子，类似于用方程式3和4.在哪里 $\bar{{A类对 S公司}_{j个}}$ 是整个数据集的人工参考标准，其中米是生物复制的数量 ${A类对 S公司 S公司 F类}_{我, j个}$ 是鳞片因子蛋白质/肽j个在生物复制中i、。最后，蛋白质/肽丰度得到校正 ${A类}_{我, j个}^{A类对 S公司}$ 乘以比例因子，根据方程式5使用limma统计软件包鉴定出显著改变的磷酸肽。⁶⁹

激酶活性推断

根据通过Omnipath下载的PhosphoSitePlus和SIGNOR数据库，首先用激酶注释检测到的磷酸化，计算相对激酶活性。²⁵磷灰石丰度是按肽顺序缩放的，以防止通过推断推断出整体位置丰度。通过将数值与Stouffer相结合来计算相对激酶活性Z轴每个样本的评分方法：

{对 K A类}_{k个} = \frac{\sum_{我 = 1}^{n个} {S公司}_{n个}}{\sqrt{n个}}

（方程式6）

哪里，RKA公司是相对激酶k个活动，S公司是特定激酶的磷酸肽的标度丰度k个和n个是与激酶对应的磷脂酶数量k个在数据集中。使用以下形式的线性模型计算每个样本的平均RKA得分 $年 = β \cdot S公司$ 对于每个时间点，假设RKA分数遵循正态分布。其中y是一个包含特定激酶RKA分数的向量，S是表示哪个分数属于哪个样本的设计矩阵，以及 $β$ 包含每个条件的拟合平均RKA得分的向量。

蛋白质磷酸化动态分析

为了识别磷酸化的模式，使用了动态模糊c-均值聚类。⁷⁰在聚类之前，丰度是按肽方向进行缩放的。使用软件包中的内置函数计算最佳参数。用参数n=8和c=2进行聚类。Michaelis-Menten方程用于对集群7和集群8进行建模。

年 = \frac{{V（V）}_{米} \cdot x个}{K + x个}

（方程式7）

y–是WEE1抑制后的标度磷酸肽强度和x-时间。使用非线性最小二乘法拟合V（V）_米和英国。

基序分析的二项式概率模型

二项式概率模型³¹用于生成特定位置的评分矩阵（PSSM），并使用“ggseqlogo”包可视化序列基序。⁷¹通过计算过重或欠重概率之比的对数优势来评估特定位置的残差分数：

{对 S公司}_{一} (K_{一}, N个, 对_{一}) = - {日志}_{10} \frac{{P（P）}_{一} (k个, \forall k个 \geq K_{一} | N个, 对_{一})}{{P（P）}_{一} (k个, \forall k个 \leq K_{一} | N个, 对_{一})}

（方程式8）

$对 S公司$ 是氨基酸一残留物在图案中的特定位置刻痕，N个–是该位置的所有残基的总数（或所用氨基酸序列的总数），K–是观察到的残留物计数一在特定位置，对–是残基的背景氨基酸频率一各概率计算如下：

{P（P）}_{一} (k个, \forall k个 \geq K_{一} | N个, 对_{一}) = \sum_{k个 = K_{一}}^{N个} B类 我 n个 (k个, N个, 对_{一})

（方程式9）

{P（P）}_{一} (k个, \forall k个 \leq K_{一} | N个, 对_{一}) = \sum_{k个 = 0}^{N个} B类 我 n个 (k个, N个, 对_{一}) = 1 - \sum_{k个 = K_{一}}^{N个} B类 我 n个 (k个, N个, 对_{一})

（方程式10）

背景氨基酸频率计算

蛋白质无序区中的磷酸化位点，为了避免用频率高度依赖于蛋白质无序的残基丰富我们的基序，我们计算了UniProt获得的人类蛋白质组中所有蛋白质氨基酸序列的无序分数，⁷²通过“idpr”R包使用IUPred2A算法（McFadden和Yanowitz，未审查）。仅使用紊乱分数高于0.4的残基计算背景氨基酸频率，如下所示：

{F类}_{我} = \frac{{A类}_{我}}{T型}

（方程式11）

A类_我是氨基酸的计数我，T是总氨基酸的计数。这两个值均经过无序倾向过滤。

位置特定的评分矩阵构造

我们通过为已知磷酸化位点两侧的氨基酸序列构建位置特异性评分矩阵（PSSM）来预测未知磷酸化位点的激酶。我们通过Omnipath从磷脂酶簇和SIGNOR数据库中提取磷酸化位点。只考虑了具有2个以上促凝作用的位点，而PSSM仅针对过滤后至少具有20个磷酸化位点的激酶生成。然后从UniProt数据库下载的全长蛋白质氨基酸序列中提取磷酸化位点（+/-10）周围的氨基酸序列。然后使用二项式概率模型计算生成21x20矩阵的所有可能位置的每个氨基酸的得分。然后使用以下等式对每个激酶的磷酸化位点进行评分：

S公司 = \sum 对 S公司 (一, b条)

（方程式12）

在哪里？S公司是给定激酶PSSM的磷酸化位点得分RS系列是氨基酸的二项式概率模型得分一在位置b。为了确保激酶之间的可比性，使用逻辑回归来校准激酶评分。然后将已知的磷酸化位点（无需筛选）分离为80%的训练数据集和20%的测试数据集。由于使用了一些测试数据集示例来生成PSSM，因此精度特性将有良好的偏差，但测试集对逻辑回归步骤进行了良好的健全性检查。由于逻辑回归对不平衡数据集很敏感，我们使用下采样，以匹配用于逻辑回归的正负实例数。使用广义线性建模将logistic回归函数与logit链接函数拟合：

P（P） (S公司) = \frac{{e（电子）}^{β_{0} + β_{1} S公司}}{1 + {e（电子）}^{β_{0} + β_{1} S公司}}

（方程式13）

我 o个 克 我 t吨 (S公司) = β_{0} + β_{1} S公司

（方程式14）

CDK1、CDK2和CDK5的预测精度是通过使用“pROC”软件包的受试者工作特性分析进行的分析。⁷³

CDK底物磷酸化动力学的比较

直接比较“慢”和“快”CDK底物之间磷酸化位点氨基酸频率两侧氨基酸残基的偏好。为了在比较中获得不确定性度量，我们使用了自举方法。将带有侧翼氨基酸序列的磷酸化位点从簇中进行100次采样，以生成不同成分的重采样数据集。然后计算每个数据集的氨基酸频率，并从“快”中减去“慢”簇频率。然后计算每个氨基酸在所有可能位置的频率差的平均值和标准偏差。在零假设下，频率差应该是0，为了验证这一点，我们计算了从由平均值0和氨基酸位置特异性标准差参数化的正态分布观察到计算的频率差的概率。

正则表达–[R/K]-x-[L/V/I]用于识别全长蛋白质氨基酸序列中的所有潜在Cy基序。在修饰的左侧和右侧提取与检测到的磷酸化位点紧密相连的Cy基序。通过将距离归入直方图或生成累积质量函数来可视化距离。使用Kolmogorov-Smirnov检验检验统计显著性。

基因集过度表达分析

使用ClusterProfiler R软件包进行基因集过度表达分析。⁷⁴检测到的磷酸蛋白用作表征分析的背景。生物途径（BP）和细胞分区（CC）基因集的富集测试。由于这些基因集不能解释PTM，所以使用了简单的蛋白质加入条目来代替修饰。

基于定量图像的细胞术

在96孔微孔板（Greiner BIO）上生长的细胞用不同的药物和基因毒性剂组合处理不同的时间间隔。经过适当的处理后，迅速去除培养基，将细胞培养在预提取缓冲液（25 mM HEPES、pH 7.5、50 mM NaCl、1 mM EDTA、3 mM MgCl2、300 mM蔗糖和0.5%Triton X-100）中，放在冰上培养2分钟，并在室温下立即固定在4%甲醛（VWR）中10分钟。为了分析有丝分裂细胞数量，省略了预提取步骤。初级抗体（γH2AX 1:300；细胞信号技术，RPA 1:200；Sigma-Aldrich和53BP1 1:1000，Novus Biotechnology）在含有10%FBS和5%牛血清白蛋白（BSA；Sigma）的过滤DMEM中稀释。在RT下用一级抗体孵育1小时。用0.05%PBS-Tween20清洗微板三次，并在含有次级荧光标记抗体（Alexa荧光染料（1:1000；Thermo Fisher Scientific）和DAPI（0.5 mg/mL；Sigma-Aldrich）的DMEM/FBS/BSA中培养1小时。图像由ScanR采集软件自动采集，该软件控制着一台电动奥林巴斯IX-83宽视野显微镜。奥林巴斯通用计划Super Apo 10x目标用于所有QIBC数据。然而，使用40倍物镜获得了53BP1病灶图像。使用ScanR图像分析软件对DAPI（任意单位：A.U.）的总核像素强度和γH2AX、染色质结合RPA和53BP1病灶的平均核强度（总像素强度除以核面积）进行图像处理和量化。然后使用R统计软件进行进一步分析。通过比较信号强度分布，采用Kolmogorov-Smirnov检验确定统计显著性。

免疫印迹法

细胞在含有EDTA游离蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和2mM DTT的RIPA（Sigma）缓冲液中进行裂解。用生物破坏者超声装置对裂解液进行10个周期的超声处理，每次30秒，每次30 s。将裂解液在20 000 RFC下4C离心15分钟。然后用Bradford分析法测量蛋白质浓度，并相应调整，以确保负载相等。将裂解液与4x LSB混合，并在95°C下煮沸10 min。根据制造商说明，在NuPAGE Bis-Tris 4-12%凝胶上运行样品。然后将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并用PBS+0.1%吐温+5%奶粉+0.01%NaN封闭_三并在4℃与初级抗体一起孵育过夜^o个C.然后在PBS+0.1%吐温中清洗膜3 x 6 min，并在室温下与二级HRP结合抗体孵育1 h。再次用PBS+0.1%吐温清洗膜3x6分钟，并用Classico/Crescendo Western HRP底物培养3分钟。在Amersham Hyperfilm/AGFA Curix Ortho薄膜上观察到蛋白质条带。

数据分析

使用tidyverse环境在统计R软件中进行数据分析⁷⁵除非另有说明。用于数据分析的所有自定义代码都已保存到存储库中。

量化和统计分析

所有统计分析都是在Visual Studio代码编辑器环境（1.73版）的R（4.2.2版）中进行的，所有使用的打包都可以在关键资源表统计“limma”包用于识别TMT和LFQ数据集的显著改变的磷酸肽。⁶⁹复制次数和条件信息可在图例中找到图1如果FDR（Benjamini Hochberg的校正值）低于5%，则认为磷酸肽发生了改变。按照方法部分所述计算相对激酶活性。假设RKA分数服从正态分布，计算出1%的统计显著性阈值。精确值是使用qnorm（）函数生成的。图R中的模糊c-均值聚类是使用“Mfuzz”包进行的，方法部分详细描述了磷灰石序列标志的生成（参见motif分析的二项式概率模型). 结果部分解释了CDK位点的预测，方法部分详细解释了下划线算法。用于比较CDK磷酸位点基序中氨基酸频率的重采样方法和所涉及的统计测试在方法部分进行了描述（见CDK底物磷酸化动力学的比较). 对于基因集过度表达分析（ORA），使用了“ClusterProfiler”软件包中内置的超几何测试。⁷⁴Benjamini-Hochberg（BH）用于调整多假设检验的p值。为了评估QIBC数据之间的统计显著性差异，在时间进程实验中使用了Kolmogorov–Smirnov检验和ks.test（）函数，在将多个细胞系与t.test（）函数进行比较的情况下使用了t.test。数字图例中给出了统计测试结果的符号，以及在某一条件下测得的最小单元数和进行实验的次数，分别用n和n表示。

致谢

我们感谢DTU蛋白质组学平台对样品进行质谱测量。这项工作得到了Lundbeckfonden（批准号R249-2017-1448）和丹麦癌症协会（批准号：R325-A18910）的支持。我们还要感谢克里斯特·温纳伯格(krister.wennerberg@bric.ku.dk)和Daria Bulanova(daria.bulanova@bric.ku.dk)用于提供OVCAR3和OVCAR8细胞系。

作者贡献

构思了C.S.S.、J.B.和V.P.项目。；进行研究并分析数据V.P.和J.B。；辅助质谱分析。；撰写了原始手稿V.P.、J.B.和C.S.S。；为手稿和实验设计E.M.S.和O.N.提供了意见。

利益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

笔记

发布日期：2023年1月20日

脚注

补充信息可在网上找到https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105806.

补充信息

文件S1。图S1-S7：

单击此处查看。^{（2.2M，pdf格式）}

表S1：与图1相关的时间进程实验的磷蛋白组学数据：

单击此处查看。^{（2.9M，xlsx）}

表S2.与图1相关的单个时间点实验的光蛋白质组学数据：

单击此处查看。^{（230万，xlsx）}

表S3.来自两个数据集的与图1和图6相关的组合磷蛋白组数据：

单击此处查看。^{（1.4M，xlsx）}

表S4.与图2相关的相对激酶活性和相关矩阵推断表：

单击此处查看。^{（68K，xlsx）}

表S5.与图4相关的经验预测CDK场址表：

单击此处查看。^{（69K，xlsx）}

表S5.WEE1和CDK1抑制后预测的CDK位点折叠变化表，与图S4相关：

单击此处查看。^{（45K，xlsx）}

数据和代码可用性

•
质谱数据已存入ProteomeXchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过具有数据集标识符的MassIVE合作伙伴存储库PXD036373型和PXD036374型.
•
用于分析蛋白质组学数据的所有代码都已保存(https://doi.org/10.5281/zenodo.6344325)并于发布之日公开。
•
重新分析本文中报告的数据所需的任何其他信息可从引线触点根据要求。

工具书类

1Scully R.、Panday A.、Elango R.、Willis N.A.，体细胞哺乳动物细胞中DNA双链断裂修复途径的选择。自然修订版分子细胞生物学。2019;20:698–714. doi:10.1038/s41580-019-0152-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

2Bunting S.F.、Callén E.、Wong n.、Chen H.-T.、Polato F.、Gunn A.、Bothmer A.、Feldhahn n.、Fernandez-Capetillo O.、Cao L.等。53BP1通过阻断DNA断裂的切除来抑制brca1-缺陷细胞中的同源重组。单元格。2010;141:243–254. doi:10.1016/j.cell.2010.03.012。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

三。Chapman J.R.、Barral P.、Vannier J.-B.、Borel V.、Steger M.、Tomas-Loba A.、Sartori A.A.、Adams I.R.、Batista F.D.、Boulton S.J.RIF1对于53BP1依赖的非同源末端连接和抑制DNA双链断裂切除至关重要。分子细胞。2013;49:858–871. doi:10.1016/j.molcel.2013.01.002。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

4Escribano-Díaz C.、Orthwein A.、Fradet-Turcotte A.、Xing M.、Young J.T.F.、TkáčJ.、Cook M.A.、Rosebrock A.P.、Munro M.、Canny M.D.等人。由53BP1-RIF1和BRCA1-CtIP组成的细胞周期依赖性调控电路控制DNA修复途径的选择。分子细胞。2013;49:872–883. doi:10.1016/j.molcel.2013.01.001。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

5Isono M.、Niimi A.、Oike T.、Hagiwara Y.、Sato H.、Sekine R.、Yoshida Y.、Isobe S.-Y.、Obuse C.、Nishi R.等。BRCA1通过促进53BP1去磷酸化，将修复途径导向同源重组。单元格代表。2017;18:520–532. doi:10.1016/j.celrep.2016.12.042。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

6Zimmermann M.、Lottersberger F.、Buonomo S.B.、Sfeir A.、de Lange T.53BP1使用Rif1调节DSB修复以控制5′末端切除。科学。2013;339:700–704. doi:10.1126/science.1231573。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

7Vassilopulos A.、Tominaga Y.、Kim H.-S.、Lahusen T.、Li B.、Yu H.、Gius D.、Deng C.-X。WEE1小鼠缺乏可诱导APC/C过度激活，并导致基因组不稳定和致癌。致癌物。2015;34:3023–3035. doi:10.1038/onc.2014.239。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

8Beck H.、Nähse-Kumpf V.、Larsen M.S.Y.、O’Hanlon K.A.、Patzke S.、Holmberg C.、Mejlvang J.、Groth A.、Nielsen O.、Syljuásen R.G.、Sörensen C.S.通过WEE1激酶抑制细胞周期蛋白依赖性激酶，通过控制复制起始和核苷酸消耗来保护基因组。摩尔细胞生物学。2012;32:4226–4236. doi:10.1128/MCB.00412-12。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

9Szmyd R.、Niska-Blakie J.、Diril M.K.、Renck Nunes P.、Tzelepis K.、Lacroix A.、van Hul N.、Deng L.-W.、Matos J.、Dreesen O.等人。Cdk1的过早激活导致S期有丝分裂事件和胚胎死亡。致癌物。2019;38:998–1018. doi:10.1038/s41388-018-0464-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

10McGowan C.H.，Russell P.人类Wee1激酶通过磷酸化Tyr15上的p34cdc2来抑制细胞分裂。EMBO J。1993;12:75–85. doi:10.1002/j.1460-2075.1993.tb05633.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

11Watanabe N.，Broome M.，Hunter T.细胞周期中人类WEE1Hu CDK酪氨酸15-激酶的调节。EMBO J。1995;14:1878–1891. doi:10.1002/j.1460-2075.1995.tb07180.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

12Domínguez-Kelly R.、Martín Y.、Koundrioukoff S.、Tanenbaum M.E.、Smits V.A.J.、Medema R.H.、Debatisse M.、Freire R.Wee1通过调节Mus81-Eme1内切酶控制复制期间的基因组稳定性。《细胞生物学杂志》。2011;194:567–579. doi:10.1083/jcb.201101047。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

13Pfister S.X.、Markkanen E.、Jiang Y.、Sarkar S.、Woodcock M.、Orlando G.、Mavrommati I.、Pai C.-C.、Zalmas L.-P.、Drobnitzky N.等。抑制WEE1通过dNTP饥饿选择性地杀死组蛋白H3K36me3缺乏的癌症。癌细胞。2015;28:557–568. doi:10.1016/j.cell.2015.09.015。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

14Duda H.、Arter M.、Gloggnitzer J.、Teloni F.、Wild P.、Blanco M.G.、Altmeyer M.、Matos J.有丝分裂期间控制低重复染色体断裂的机制。开发单元。2016;39:740–755. doi:10.1016/j.devcel.2016.11.017。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

15Elbk C.R.、Petrosius V.、Benada J.、Erichsen L.、Damgaard R.B.、Sörensen C.S.WEE1激酶通过限制CDK2活性来保护停滞的DNA复制叉的稳定性。单元格代表。2022;38doi:10.1016/j.celrep.2021.110261。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

16Ghelli Luserna di RoráA.、Cerchione C.、Martinelli G.、Simonetti G.WEE1家族企业：有丝分裂调控、癌症进展和治疗靶点。《血液学杂志》。昂科尔。2020;13：126.网址：10.1186/s13045-020-00959-2。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

17Hirai H.、Iwasawa Y.、Okada M.、Arai T.、Nishibata T.、Kobayashi M.、Kimura T.、Kaneko N.、Ohtani J.、Yamanaka K.等。MK-1775对Wee1激酶的小分子抑制选择性地使p53缺陷肿瘤细胞对DNA损伤剂敏感。摩尔癌症治疗。2009;8:2992–3000. doi:10.1158/1535-7163.MCT-09-0463。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

18Hauge S.、Naucke C.、Hasvold G.、Joel M.、Rödland G.E.、Juzenas P.、Stokke T.、Syljuásen R.G.由于CDK活性和CDC45负载的不同调节，Wee1和Chk1的联合抑制在S期产生协同DNA损伤。Oncotarget公司。2017;8:10966–10979. doi:10.18632/目标14089。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

19.Bukhari A.B.、Lewis C.W.、Pearce J.J.、Luong D.、Chan G.K.、Gamper A.M.抑制Wee1和ATR激酶产生肿瘤选择性合成致死性并抑制转移。临床杂志。投资。2019;129:1329–1344. doi:10.1172/JCI122622。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

20Fang Y.，McGrail D.J.，Sun C.，Labrie M.，Chen X.，Zhang D.，Ju Z.，Vellano C.P.，Lu Y.，Li Y.等。PARP和WEE1抑制剂的序贯治疗在保持疗效的同时最大限度地减少毒性。癌细胞。2019;35：851–867.e7。doi:10.1016/j.cell.2019.05.001。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

21Cuneo K.C.、Morgan M.A.、Sahai V.、Schipper M.J.、Parsels L.A.、Parsels-J.D.、Devasia T.、Al-Hawaray M.、Cho C.S.、Nathan H.等。Wee1抑制剂阿达沃瑟提布（AZD1775）与吉西他滨联合放疗治疗局部晚期胰腺癌患者的剂量递增试验。临床杂志。昂科尔。2019;37:2643–2650. doi:10.1200/JCO.19.00730。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

22.Lheureux S.、Cristea M.C.、Bruce J.P.、Garg S.、Cabanero M.、Mantia-Smaldone G.、Olawaiye A.B.、Ellard S.L.、Weberpals J.I.、Wahner Hendrickson A.E.等。阿达沃瑟提布联合吉西他滨治疗耐铂或难治性复发性卵巢癌：一项双盲、随机、安慰剂对照、2期试验。柳叶刀。2021;397:281–292. doi:10.1016/S0140-6736（20）32554-X。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

23.Kato H.、de Souza P.、Kim S.-W.、Lickliter J.D.、Naito Y.、Park K.、Kumar S.、Mugundu G.M.、Bang Y.-J.阿达沃沙提布联合化疗治疗亚洲晚期实体瘤患者的安全性、药代动力学和临床活性：ib期研究。目标Oncol。2020;15:75–84. doi:10.1007/s11523-020-00701-5。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

24Frejno M.、Meng C.、Ruprecht B.、Oellerich T.、Scheich S.、Kleigrewe K.、Drecoll E.、Samaras P.、Hogrebe A.、Helm D.等。肿瘤细胞系的蛋白质组活性景观决定药物反应。国家公社。2020;11：3639.网址：10.1038/s41467-020-17336-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

25Türei D.、Korcsmáros T.、Saez-Rodriguez J.OmniPath：文献控制信号通路资源的指南和网关。自然方法。2016;13:966–967. doi:10.1038/nmeth.4077。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

26Zhu J.-Y.，Cuellar R.A.，Berndt N.，Lee H.E.，Olesen S.H.，Martin M.P.，Jensen J.T.，Georg G.I.，Schönbrunn E.，各种小分子抑制剂对小激酶功能和失活的结构基础。医学杂志。化学。2017;60:7863–7875. doi:10.1021/acs.jmedchem.7b00996。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

27Wright G.、Golubeva V.、Remsing Rix L.L.、Berndt N.、Luo Y.、Ward G.A.、Gray J.E.、Schonbrunn E.、Lawrence H.R.、Monteiro A.N.A.、Rix U.AZD1775对WEE1和PLK1的双重靶向诱导单剂细胞抗癌活性。ACS化学。生物。2017;12:1883–1892. doi:10.1021/acschembio.7b00147。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

28Serpico A.F.、D'Alterio G.、Vetrei C.、Della Monica R.、Nardella L.、Visconti R.和Grieco D.Wee1而非Plk1在治疗相关浓度下被AZD1775抑制。癌症。2019;11：819.doi:10.3390/cancers11060819。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

29Borgo C.、D'Amore C.、Sarno S.、Salvi M.、Ruzzene M.蛋白激酶CK2：多种人类疾病的潜在治疗靶点。信号传输。目标疗法。2021;6：183.网址：10.1038/s41392-021-00567-7。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

30.Olsen J.V.、Blagoev B.、Gnad F.、Macek B.、Kumar C.、Mortensen P.、Mann M.Global、体内和信号网络中的特定位点磷酸化动力学。单元格。2006;127:635–648. doi:10.1016/j.cell.2006.09.026。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

31O'Shea J.P.、Chou M.F.、Quader S.A.、Ryan J.K.、Church G.M.、Schwartz D.pLogo：可视化序列基序的概率方法。自然方法。2013;10:1211–1212. doi:10.1038/nmeth.2646。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

32Invergo B.M.、Petursson B.、Akhtar N.、Bradley D.、Giudice G.、Hijazi M.、Cutillas P.、Petsalaki E.、Beltrao P.符号蛋白激酶调节回路预测。细胞系统。2020;10：384–396.e9。doi:10.1016/j.cels.2020.04.005。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

33Lau H.W.，Ma H.T.，Yeung T.K.，Tam M.Y.，Zheng D.，Chu S.K.，Poon R.Y.C.细胞周期素依赖性激酶之间的数量差异是CDK1在人类细胞中独特功能的基础。单元格代表。2021;37doi:10.1016/j.celrep.2021.109808。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

34Petrone A.、Adamo M.E.、Cheng C.、Kettenbach A.N.通过定量磷酸蛋白质组学鉴定有丝分裂中的候选细胞周期依赖性激酶1（Cdk1）底物。分子细胞。蛋白质组学。2016;15:2448–2461. doi:10.1074/mcp。M116.059394。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

35Songyang Z.，Blechner S.，Hoagland N.，Hoekstra M.F.，Piwnica-Worms H.，Cantley L.C.使用定向肽库确定蛋白激酶的最佳底物。货币。生物。1994;4:973–982. doi:10.1016/S0960-9822（00）00221-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

36Takeda D.Y.，Wohlschlegel J.A.，Dutta A.细胞周期蛋白依赖性激酶的二分底物识别基序。生物学杂志。化学。2001;276:1993–1997. doi:10.1074/jbc。M005719200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

37Brown N.R.、Korolchuk S.、Martin M.P.、Stanley W.A.、Moukhametzianov R.、Noble M.E.M.、Endicott J.A.CDK1结构揭示了基本细胞周期CDK的保守和独特特征。国家公社。2015;6：6769.doi:10.1038/ncomms7769。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

38Alexander J.、Lim D.、Joughin B.A.、Hegemann B.、Hutchins J.R.A.、Ehrenberger T.、Ivins F.、Sessa F.、Hudecz O.、Nigg E.A.等。磷酸化基序的正选择和负选择相结合的空间排他性是上下文相关有丝分裂信号传递的基础。科学。信号。2011;4：ra42.doi:10.1126/scisional.2001796。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

39Köivomägi M.、Ørd M.、Iofik A.、Valk E.、Venta R.、Faustota I.、Kivi R.、Balog E.R.M.、Rubin S.M.、Loog M.作为Cdk1信号处理器的多位点磷酸化网络。自然结构。分子生物学。2013;20:1415–1424. doi:10.1038/nsmb.2706。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

40Swaffer M.P.、Jones A.W.、Flynn H.R.、Snijders A.P.、Nurse P.CDK底物磷酸化和细胞周期排序。单元格。2016;167：1750–1761.e16。doi:10.1016/j.cell.2016.11.034。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

41Yamazaki S.、Ishii A.、Kanoh Y.、Oda M.、Nishito Y.、Masai H.Rif1调节人类基因组上的复制时序域：Rif1调节复制时序域。EMBO J。2012;31:3667–3677. doi:10.1038/emboj.2012.180。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

42Deegan T.D.、Diffley J.F.X.MCM：一枚戒指统治着所有人。货币。操作。结构。生物。2016;37:145–151. doi:10.1016/j.sbi.2016.01.014。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

43Mukherjee C.、Tripathi V.、Manolika E.M.、Heijink A.M.、Ricci G.、Merzouk S.、de Boer H.R.、Demmers J.、van Vugt M.A.T.M.、Ray Chaudhuri A.RIF1促进复制叉保护和有效重启，以维持基因组稳定性。国家公社。2019;10：3287.doi:10.1038/s41467-019-11246-1。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

44Sedlackova H.、Rask M.-B.、Gupta R.、Choudhary C.、Somyajit K.、Lukas J.新生和亲代MCM蛋白质之间的平衡保护复制基因组。自然。2020;587:297–302. doi:10.1038/s41586-020-2842-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

45Lee D.-H.、Acharya S.S.、Kwon M.、Drane P.、Guan Y.、Adelmant G.、Kalev P.、Shah J.、Pellman D.、Marto J.A.、Chowdhury D.去磷酸化能够招募53BP1来进行双链DNA断裂。分子细胞。2014;54:512–525. doi:10.1016/j.molcel.2014.03.020。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

46Orthwein A.、Fradet-Turcotte A.、Noordermeer S.M.、Canny M.D.、Brun C.M.、Strecker J.、Escribano-Diaz C.、Durocher D.有丝分裂抑制DNA双链断裂修复以防止端粒融合。科学。2014;344:189–193. doi:10.1126/science.1248024。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

47Benada J.、BurdováK.、Lidak T.、von Morgen P.、Macurek L.Polo-like kinase 1抑制有丝分裂期间的DNA损伤反应。细胞周期。2015;14:219–231. doi:10.4161/15384101.2014.977067。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

48Moiseeva T.N.，Yin Y.，Calderon M.J.，Qian C.，Schamus Haynes S.，Sugitani N.，Osmanbeyoglu H.U.，Rothenberg E.，Watkins S.C.，Bakkenist C.J.一种ATR和CHK1激酶信号机制，在未受干扰的DNA复制过程中限制起源激发。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2019;116:13374–13383. doi:10.1073/pnas.1903418116。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

49Vassilev L.T.、Tovar C.、Chen S.、Knezevic D.、Zhao X.、Sun H.、Heimbrook D.C.和Chen L.选择性小分子抑制剂揭示了人类CDK1的关键有丝分裂功能。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:10660–10665. doi:10.1073/pnas.0600447103。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

50Alexander L.T.、Möbitz H.、Drueckes P.、Savitsky P.、Fedorov O.、Elkins J.M.、Deane C.M.、Cowan-Jacob S.W.、Knapp S.靶向CDK2的II型抑制剂。ACS化学。生物。2015;10:2116–2125. doi:10.1021/acschembio.5b00398。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

51Wells C.I.、Vasta J.D.、Corona C.R.、Wilkinson J.、Zimprich C.A.、Ingold M.R.、Pickett J.E.、Drewry D.H.、Pugh K.M.、Schwinn M.K.等人。量化活细胞中CDK抑制剂的选择性。国家公社。2020;11：2743.doi:10.1038/s41467-020-1659-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

52Horn H.、Schoof E.M.、Kim J.、Robin X.、Miller M.L.、Diela F.、Palma A.、Cesareni G.、Jensen L.J.、Linding R.KinomeXplorer：基因体生物学研究的综合平台。自然方法。2014;11:603–604. doi:10.1038/nmeth.2968。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

53Wang D.、Zeng S.、Xu C.、Qiu W.、Liang Y.、Joshi T.和Xu D.MusiteDeep：一般和激酶特异性磷酸化位点预测的深度学习框架。生物信息学。2017;33:3909–3916. doi:10.1093/bioinformatics/btx496。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

54Bradley D.、Viéitez C.、Rajeeve V.、Selkrig J.、Cutillas P.R、Beltrao P.基于序列和结构的真核蛋白激酶特异性决定簇分析。单元格代表。2021;34doi:10.1016/j.celrep.2020.108602。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

55Creixell P.、Schoof E.M.、Simpson C.D.、Longden J.、Miller C.J.、Lou H.J.、Perryman L.、Cox T.R.、Zivanovic N.、Palmeri A.等，《癌症信号转导网络攻击突变的基纳全解码》。单元格。2015;163:202–217. doi:10.1016/j.cell.2015.08.056。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

56Coudreuse D.，Nurse P.用最小的CDK控制网络驱动细胞周期。自然。2010;468:1074–1079. doi:10.1038/nature09543。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

57.Esashi F.、Christ N.、Gannon J.、Liu Y.、Hunt T.、Jasin M.、West S.C.将BRCA2依赖CDK的磷酸化作为重组修复的调节机制。自然。2005;434:598–604. doi:10.1038/nature03404。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

58Krajewska M.、Heijink A.M.、Bisselink Y.J.W.M.、Seinstra R.I.、SilljéH.H.W.、de Vries E.G.E.、van Vugt M.A.T.M.通过wee1抑制强制激活Cdk1会损害同源重组。致癌物。2013;32:3001–3008. doi:10.1038/onc.2012.296。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

59Tomimatsu N.、Mukherjee B.、Catherine Hardebeck M.、Ilcheva M.、Vanessa Camacho C.、Louise Harris J.、Porteus M.、Llorente B.、Khanna K.K.、Burma S.。CDKs 1和2对EXO1的磷酸化调节DNA末端切除和修复路径选择。国家公社。2014;5：3561.doi:10.1038/ncomms4561。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

60Buisson R.、Niraj J.、Rodrigue A.、Ho C.K.、Kreuzer J.、Foo T.K.、Hardy E.J.-L.、Dellaire G.、Haas W.、Xia B.等，通过ATR耦合同源重组和检查点。分子细胞。2017;65:336–346. doi:10.1016/j.molcel.2016.12.007。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

61van Vugt M.A.T.M.、Gardino A.K.、Linding R.、Ostheimer G.J.、Reinhardt H.C.、Ong S.-E.、Tan C.S.、Miao H.、Keezer S.M.、Li J.等。有丝分裂磷酸化反馈网络连接Cdk1、Plk1、53BP1和Chk2，使G2/M DNA损伤检查点失活。《公共科学图书馆·生物》。2010;8doi:10.1371/journal.pbio.1000287。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

62Nasa I.、Rusin S.F.、Kettenbach A.N.、Moorhead G.B.Aurora B通过磷酸化PP1调节蛋白中保守的PP1-结合RVxF基序来对抗PP1在有丝分裂中的功能。科学。信号。2018;11doi:10.1126/scisignal.aai8669。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

63Liu W.，Krishnamoorthy A.，Zhao R.，Cortez D.两条复制叉重塑途径为不同的叉保护因子生成核酸酶底物。科学。副词。2020;6doi:10.1126/sciadv.abc3598。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

64Olivieri M.、Cho T.、Alvarez-Quilón A.、Li K.、Schellenberg M.J.、Zimmermann M.、Hustedt n.、Rossi S.E.、Adam S.、Melo H.等。人类细胞对DNA损伤反应的遗传图。单元格。2020;182：481-496.e21。doi:10.1016/j.cell.2020.05.040。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

65Elbk C.R.、Petrosius V.、Sörensen C.S.WEE1激酶限制CDK活性，以保护DNA复制和有丝分裂进入。穆塔特。物件。2020;819doi:10.1016/j.mrfmmm.2020.111694。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

66Rajeshkumar N.V.、De Oliveira E.、Ottenhof N.、Watters J.、Brooks D.、Demuth T.、Shumway S.D.、Mizuarai S.、Hirai H.、Maitra A.、Hidalgo M.MK-1775，一种有效的Wee1抑制剂，与吉西他滨协同，选择性地在p53缺乏的胰腺癌异种移植中实现肿瘤退行。临床。癌症研究。2011;17:2799–2806. doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-2580。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

67de Jong M.R.W.、Langendonk M.、Reitsma B.、Herbers P.、Nijland M.和Huls G.、van den Berg A.、Ammatuna E.、Visser L.和van Meerten T.由于有丝分裂提前进入和DNA损伤，WEE1抑制增强了抗凋亡依赖性。癌症。2019;11：1743.doi:10.3390/cancers1111743。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

68Videla-Richardson G.A.、Furmento V.A.、Garcia C.P.、Morris-Hanon O.、Sevlever G.E.、Romorini L.、Scassa M.E.人类胚胎干细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂Roscovitine表现出明显的敏感性。BMC分子细胞生物学。2019;20：40.doi:10.1186/s12860-019-0222-3。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

69Ritchie M.E.、Phipson B.、Wu D.、Hu Y.、Law C.W.、Shi W.、Smyth G.K.Limma为RNA测序和微阵列研究提供差异表达分析。核酸研究。2015;43：e47.doi:10.1093/nar/gkv007。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

70Kumar L.，Futschik M.E.Mfuzz：微阵列数据软聚类的软件包。生物信息。2007;2：5-7.数字对象标识代码：10.6026/9732063002005。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

71.Wagih O.ggseqlogo：用于绘制序列徽标的多功能R包。生物信息学。2017;33:3645–3647. doi:10.1093/bioinformatics/btx469。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

72UniProt财团。贝特曼A.、马丁M.-J.、果园S.、马格朗M.、阿吉维托娃R.、艾哈迈德S.、阿尔皮E.、鲍勒巴内特E.H.、布里托R.等。UniProt:2021年的通用蛋白质知识库。核酸研究。2021;49：D480–D489。doi:10.1093/nar/gkaa1100。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

73Robin X.、Turck N.、Hainard A.、Tiberti N.、Lisacek F.、Sanchez J.-C.、Müller M.pROC：用于分析和比较ROC曲线的R和S+开源软件包。BMC生物信息。2011;12：77.网址：10.1186/1471-2105-12-77。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

74Wu T.，Hu E.，Xu S.，Chen M.，Guo P.，Dai Z.，Feng T.，Zhou L.，Tang W.，Zhan L.，et al.clusterProfiler 4.0：解释组学数据的通用富集工具。创新。2021;2doi:10.1016/j.xinn.2021.100141。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

75Wickham H.、Averick M.、Bryan J.、Chang W.、McGowan L.、Francois R.、Grolemund G.、Hayes A.、Henry L.、Hester J.等人。欢迎来到tidyverse。J.开源软件。2019;4：1686.网址：10.21105/joss.01686。[交叉参考][谷歌学者]

76.Chen H.，Boutros P.C.VennDiagram：一个用于在R中生成高度可定制的Venn和Euler图的包。BMC生物信息。2011;12：35.doi:10.1186/1471-2105-12-35。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

文章来自iScience公司由以下人员提供爱思维尔