Notch受体家族成员是跨膜糖蛋白，与分化、转化、痴呆和中风的机制有关（参考文献综述1,6,9,18、和19). 在哺乳动物中，该家族有四个已确定的成员，其结构高度相似。细胞外区域编码串联细胞外表皮生长因子（EGF）重复序列和一个富含半胱氨酸的区域，称为Notch/lin-12重复序列。每个家族成员的细胞质域包含六个锚蛋白重复序列和一个C末端PEST基序。Notch蛋白及其许多已鉴定的信号伴侣在果蝇属对人类而言。基因研究槽口在中激活果蝇属(25,34)，秀丽隐杆线虫(38)、和爪蟾(11)共同表明，去除Notch胞外结构域会导致主要的功能丧失槽口等位基因。在散发的人类中也发现了类似的截断NOTCH1等位基因(2,14)，和逆转录病毒诱导的小鼠(16,17)T细胞白血病。此外，利用各种工程化的细胞质Notch1实现了T细胞和成纤维细胞的体外转化(2,三,10,31). 总之，这些数据引发了这样一种观点，即构成活性的胞质内Notch1蛋白N（IC）可以作为癌蛋白发挥作用，这在T细胞中最常见。
重要的是要充分了解Notch1受体的结构，以便预测其突变形式的功能果蝇属Notch受体最初认为，成熟的Notch多肽是一种300-kDa糖蛋白，因为其抗血清可以作用于细胞外和细胞内的结构域果蝇属Notch识别出一种对几种凝集素具有亲和力的～300-kDa蛋白(20,21). 然而，通过Western blot分析，识别哺乳动物Notch1细胞质结构域的抗血清一致检测到两种Notch1蛋白：一种～330-kDa蛋白和110至89kDa的较小多肽，这取决于蛋白质的来源(2,7,16,21,31,37,43). 对Notch1和Notch2翻译后处理的脉冲相分析表明，330-kDa前体迅速裂解，产生较小的细胞质蛋白(2,16,43). 最近，果蝇属槽口(30)，人类缺口2(7)，和鼠Notch1(26)已证明是通过蛋白质水解从330-kDa前体加工成110-kDa-膜锚定细胞质链。几条证据表明，Notch1前体被转化酶furin以一致序列切割，该序列仅出现在膜旁胞外结构域中两个保守半胱氨酸（C1675和C1682）的N端(22,26). 由此产生的裂解产物被认为形成包含胞外域N（EC）的异二聚体，该胞外域通过其与保存在细胞质亚单位N（IC）中的69氨基酸胞外柄的结合与细胞相连。虽然细胞质亚单位胞外柄中保守的半胱氨酸残基被认为起着重要作用，但异二聚体关联的物理性质尚不清楚（参考文献综述18). 此外，最近的研究表明，配体诱导的Notch1活化可以在靠近质膜的细胞质表面上诱导Notch1的额外蛋白水解，从而释放出较短的Notchl细胞质亚单位以与下游信号分子相互作用(36). 然而，来自Notch1前体的细胞外裂解产物的命运尚待严格分析。
我们之前对MMTV中T细胞肿瘤的分析D类/感染小鼠白血病病毒（MuLV）的myc转基因（Tg）小鼠显示存在前病毒插入槽口1110例特征性肿瘤中65例的突变(16,17). 这些肿瘤以及衍生的T细胞系有可能表达一系列独特的自发选择的、可能失去功能的突变型Notch1蛋白。大多数整合发生在编码第34个EGF重复序列和跨膜（TM）结构域之间序列的基因组区域，导致产生我们这里所称的“I型”突变槽口1等位基因(16,17). 特征插入位点似乎遵循整合窗口，这意味着Notch1的致癌转化必须满足特定的序列要求。几乎所有I型前叶植入的肿瘤都产生了两种不同类型的截短转录物的升高水平(16,17). 3-4-kb RNA起始于整合位点，终止于基因的3′端，因此编码TM和细胞质域[N（IC）]。另一类转录本的大小为6至9 kb，似乎起源于槽口1启动子和终止于整合位点，因此只能编码截断的Notch1外结构域[N（EC）静音] (16,17). 实际上每个肿瘤都有这种重排槽口1等位基因表达了丰富的280-kDa蛋白，以及330-kDaNotch1前体(16,17). 这种280kDa的蛋白在西方分析中被细胞外但非细胞内定向的抗Notch1抗血清识别，表明p280可能代表Notch1胞外域(16).
使用数组槽口1-特异性RNA探针和区域特异性Notch1抗血清，我们现在已经测试了一些I型肿瘤中表达的280-kDa蛋白可能是由截短的槽口1RNA模板。在这项分析中，我们还报告了第二类前病毒整合事件槽口1我们称之为II型突变。这种新描述的整合簇发生在800-核苷酸范围内，位于槽口1所产生的突变等位基因编码除C末端外的所有Notch1受体序列，C末端含有PEST结构域。这些数据首次表明槽口1可能致癌。一个槽口1突变等位基因编码一个被分解的Notch1受体，该受体被认为是配体独立的（I型），而另一个等位基因保留一个能够与配体相互作用的受体结构（II型）。我们的数据表明，这两个不同的槽口1突变等位基因仍然可以与c结合-myc公司加速MMTV中胸腺瘤的出现D类/myc-Tg小鼠。
材料和方法
细胞转染和细胞培养。
之前已经描述过T细胞系L42、L45、L46、L48和L96的分离和繁殖(16). 淋巴细胞保存在含有10%胎牛血清（Hyclone）和5×10−537°C下5%CO下的Mβ-巯基乙醇2如前所述，通过磷酸钙沉淀法将质粒DNA瞬时或稳定转染至293T细胞(5). 表达全长Notch1（Notch8.0）、N的293T细胞的单个稳定克隆Δ银行，N（欧共体）纳尔或pcDNA3puro载体，在含有10%胎牛血清的Dulbecco最小必需培养基（HyClone）中每毫升5μg嘌呤霉素培养2周后，通过选择菌落获得。表达N（EC）的293T细胞库斯图或pcDNA3（neo）载体，在400μg/ml G418中筛选2周后获得。
蛋白质提取和蛋白质印迹。
对于Western blot分析，细胞在4°C磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗两次，并直接溶解到RIPA缓冲液中（10 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，1%Triton X-100，0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]，1.0%脱氧胆酸钠）使用蛋白酶抑制剂（每毫升2μg抑肽酶、每毫升2微克亮肽、每毫升1微克胃蛋白酶抑制素、每毫升50微克1-氯-3-对甲苯酰胺-7-氨基-L-2-庚酮（TLCK）、每毫升100微克苯甲基磺酰氟）。在150000×克将蛋白质提取物与双强度SDS样品缓冲液与二硫苏糖醇或β-巯基乙醇混合30分钟，煮沸5分钟，使用6%丙烯酰胺凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），然后转移到尼龙膜上。蛋白质分子质量标准品包括甲状腺球蛋白（～330 kDa）和肌球蛋白（205 kDas），购自Sigma（SDS-6H）和Bio-Rad。过滤器用5%的奶粉在TBST中堵塞（10 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，0.1%吐温20），然后用0.5%奶粉在TBST中的初级抗血清进行探测。Notch1特异性抗血清extra-2、extra-1、intra-1和intra-2的制备和表征已在前面描述过(16). 使用二级辣根过氧化物酶结合抗兔抗血清（Sigma A0545）进行免疫检测，然后进行化学发光检测（Amersham）。初级Western分析后，在50°C下将印迹在剥离缓冲液（62.5 mM Tris[pH6.8]，100 mMβ-巯基乙醇，2%SDS）中培养1 h，然后用另一抗血清重新分析。使用HP Deskscan II扫描所有得到的放射自显影图，并使用Powerpoint（Microsoft）软件复制以供出版。
细胞胰蛋白酶化。
电池（5×107)将每个细胞系的细胞在37°C RPMI中冲洗，按每种条件分为五等分，并在37°C的5 ml RPMI中培养15分钟，RPMI中每ml含有0、0.1、1、10或100μg胰蛋白酶。将细胞制成颗粒，然后在4°C含有苯甲基磺酰氟的PBS中冲洗两次。在含有蛋白酶抑制剂的250μl RIPA缓冲液中溶解最终细胞颗粒。将等体积的每种裂解物与双强度SDS样品缓冲液混合，煮沸5分钟，加载到6%丙烯酰胺–SDS凝胶上，并用抗Notch1抗血清进行Western blotting分析。
Notch1外结构域分离分析。
T淋巴细胞（3×107在室温PBS中短暂冲洗两次，然后在37或4°C下250μl PBS中培养10分钟，或在4°C条件下250μl PBS与1 mM EGTA培养10分钟。瞬时转染293T细胞（2×106)（转染后48小时）在室温PBS中冲洗两次，然后在37或4°C的100μl PBS中培养10分钟。10分钟后，将细胞在台式微型离心机中造粒15秒。回收上清液，并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中溶解细胞颗粒。上清液在150×克在4°C下放置30分钟，然后丢弃颗粒。用上述extra-1抗血清对等量的每个样品进行Western分析。然后剥离印迹，用抗gp70抗体重制，然后用辣根过氧化物酶结合抗羊（Sigma）抗血清重制，并进行化学发光检测。使用上述软件对胶片进行扫描和处理，以便发布。
结果
许多I型插件槽口1突变等位基因产生截断的Notch1外结构域蛋白，N（EC）静音来自截短的RNA，而不是来自加工。
I型肿瘤的分析槽口1突变显示一些肿瘤表达高水平的截短5′槽口1RNA和无全长Notch1转录物也产生了较高水平的～280-kDa蛋白。这表明这些肿瘤中产生的280-kDa蛋白中的一些是由截短的槽口1RNA模板，代表突变的Notch1外结构域[N（EC）静音]. 如果包含I型整合的肿瘤表达并分泌N（EC）静音蛋白质，这可能会对Notch1的转化机制产生潜在影响。因此，我们进行了实验来测试N（EC）静音蛋白质被表达，如果它们存在于分泌室中，以及它们是否被分泌。由于在大多数I型肿瘤中作为未排列等位基因保留的正常Notch1受体被加工成外结构域[N（EC）]，这一分析变得更加复杂重量]和胞质内结构域[N（IC）重量]. N（欧共体）重量蛋白质的结构应该与N（EC）几乎相同静音截短的蛋白质编码槽口1在I型肿瘤中检测到RNA。因此，两种肿瘤细胞系L96和L45在分析假定的N（EC）时至关重要静音蛋白质，因为这些细胞系具有独特的I型整合和丰富的截短型槽口15′RNA(16)（图。). 这两种细胞系均使用四种抗血清进行了Western分析(16)其先前已被证明特异性识别Notch1的细胞外和细胞内表位（图。).
I型和II型前病毒插入的示意图槽口1MMTV T细胞肿瘤中编码截短5′转录物和蛋白的突变等位基因D类/myc-Tg小鼠。（A） 在缺乏配体结合的情况下，细胞膜上野生型处理的Notch1受体的简单示意图。分子发生裂解，细胞外和细胞内碎片形成复合物（垂直双细线）。编码域表示为：EGF，EGF重复；NLR，Notch-Lin12重复；TM，跨膜结构域；ANK，锚蛋白重复；OPA和PEST，图案；out，胞外；in，细胞内。（B） 在中段和C末端观察到两个不同的前病毒整合簇槽口1基因。在肿瘤（T）和细胞系（L）中发现突变插入。类型I插入先前已映射(16,17). 内含子不一定按比例绘制，外显子可以任意编号。PCR和序列分析欣dIII位点和C末端未发现内含子。符号：细线、内含子；开放矩形，外显子；垂直箭头，前病毒整合位点；水平箭头，前病毒5′至3′的转录方向。限制场所：B，巴姆你好；比格，Bgl公司II；H、，欣dIII；K、，千磅我；P、，Pst（磅/平方英尺）我；Pv、，Pvu公司II类；RV、，生态RV；S、，囊I.（C）Notch1 cDNA，编码域如图A所示；黑色卵圆形，furin分裂一致序列。显示了用于DNA探针（粗线）和用于提高抗体（双杠）的片段。限制位点与B组相同；同样为N，纳尔我；街，斯图I.（D）截断示意图槽口1不同T细胞系中检测到的转录物（粗线）及其相应的初级翻译产物(16,17). L42细胞没有重新排列槽口1而L45和L96细胞具有I型Notch1突变。显示了转录物的分子量（千碱）和Notch1中氨基酸的数量。符号：LTR、MuLV LTR；AAAAA，聚（A）尾；来自LTR区域的三条无意义编码区域。正常处理的p280 N（EC）重量和p110 N（IC）重量来自全长前体的产品在本节中没有说明，但在面板A中显示。
对含有I型Notch1前体整合的T细胞系产生的Notch1蛋白进行Western blot分析，并与293T细胞中外源性表达的全长和截短Notch1受体进行比较。对RIPA细胞裂解物进行6%丙烯酰胺SDS-PAGE，然后使用抗extra-1（A）、抗extra-2（B）、抗intra-1（C）或抗intra-2（D）抗体进行Western blot分析。单个样品的蛋白质来源标记在每个通道上方，包括以下内容：293T细胞（通道1）和293T体外表达全长Notch1的细胞（克隆Notch8.0）（通道2和10）或突变NΔCT（车道3），NΔ银行（车道4），N（EC）纳尔（车道5）或N（EC）斯图（车道6）或T细胞系L42（车道7）（野生型[WT]槽口1重新排列）、L96（第8车道）或L45（第9车道）槽口1). 图中显示了表示各种Notch1蛋白的符号。
L96细胞先前显示表达一个截断的6-kb槽口15′RNA，无全长Notch1转录物(16)（图。D） ●●●●。通过Western分析，L96细胞表达丰富的～275-kDa蛋白，该蛋白被extra-1识别（图。A、 8号车道；另请参见图。)以及额外的2（图。B、 但这两种抗血清都不能识别细胞内表位（图。C和D车道8）。因此，这种p275蛋白可能仅来源于截短的6-kb槽口1RNA。L45细胞先前显示表达两种全长槽口18-kb和10-kb RNA，此外，5-kb被截断槽口15′RNA(16)（图。D） ●●●●。L45细胞表达一种～280-kDa蛋白，用extra-1和extra-2检测到该蛋白（图。A和B车道9）。这个280-kDa蛋白与野生型加工的280-kDa外结构域[N（EC）]结合重量]由L42细胞产生，不进行Notch1重排(16)，很可能是由于全长槽口1抄本。此外，L45细胞表达一种独特的～250-kDa蛋白，该蛋白用extra-2抗血清检测到（图。B、 更重要的是，extra-1抗血清未被检测到（图。A、 车道9）。5-kb的编码潜力槽口1L45细胞中的转录在extra-1表位之前终止（图。D） ●●●●。胸腺瘤蛋白提取物中检测到类似的～250-kDa蛋白｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“T28860”，“term_id”：“610958”，“term_text”：“T28860”｝T28860型，其前叶整合接近L45细胞（数据未显示）。总的来说，这些数据表明N（EC）静音截短的5′稳定产生蛋白质槽口1独立T细胞或胸腺瘤中的RNA（见图。).
所研究Notch1蛋白的数据总结。给出了每个蛋白质的结构示意图。列出了在每个细胞系中免疫检测到的单个Notch1蛋白，以及每个特征Notch1蛋白质中存在或不存在的表位及其不同的分子量。N（EC）重量和N（IC）重量据报道，蛋白质会结合并形成异二聚体(7,26). 符号与图中相同。.
截短N（EC）的分子质量（～250至280 kDa）静音或加工N（EC）重量外结构域蛋白远大于这些蛋白的预期质量（在没有翻译后修饰的情况下，约215kDa或更少）。因此，我们构建了两个不同的截短的Notch1 cDNA，N（EC）纳尔和N（EC）斯图，其编码潜力与我突变的类型大致相同槽口15′RNAs为我们的SDS-PAGE系统中的Notch1外结构域生成一个内部分子量标记。N（欧共体）纳尔编码整个1651-aa外结构域，位于aa1654的furin裂解位点之前。N（欧共体）斯图编码36个EGF重复（1468 aa）。每种结构都在293T细胞中瞬时表达，其表达非常低水平的内源性Notch1受体，并通过Western blotting分析得到的翻译产物（图。). N（EC）产生的蛋白质纳尔在～275kDa（通道5）迁移，而N（EC）产生的蛋白质斯图（车道6）在～250 kDa时迁移更快（图。A和B）。虽然N（EC）的C终点斯图该蛋白仅含有部分extra-1表位，该蛋白仍被extra-1抗血清检测到（图。A、 车道6）。由I型插入肿瘤中的突变等位基因和体外构建的突变等位基因产生的蛋白质的分子量（~250至280kDa）槽口1缺失突变体是一致的，强化了～250-至280-kDa N（EC）的概念静音在I型肿瘤中检测到的蛋白质来源于5′截短的RNA。
总之，我们的西方分析表明，Notch1外结构域可能由完全不同的机制产生：通过野生型Notch1前体的正常加工，或通过I型突变等位基因产生的截断RNA。
与加工的280-kDa N（EC）相比重量蛋白质，突变截断N（EC）静音蛋白质并不位于细胞表面，而是存在于分泌室中。
根据截断的预测翻译产物槽口15′RNA，似乎N（EC）静音蛋白质会被分泌出来。这些N的预测编码序列（EC）静音蛋白质包括一个信号识别（先导）序列，该序列将这些蛋白质导向分泌途径。然而，这些截短的蛋白质没有TM序列，预计不会滞留在质膜中。因此，我们测试了N（EC）静音在L96和L45细胞中检测到的蛋白质（包含I型槽口1突变）通过用越来越多的胰蛋白酶处理活细胞，然后进行Western分析，滞留在细胞表面。相比之下，我们分析了正常处理的Notch1受体[N（EC）]的胰蛋白酶敏感性重量]在L42细胞中，没有插入槽口1突变。用extra-1对所得免疫印迹的探测显示p280N（EC）重量L42细胞随着胰蛋白酶数量的增加而逐渐降解（图。A、 上部面板）。这表明在L42细胞中检测到的几乎所有处理过的Notch1外结构域在细胞表面以组装受体的形式存在。为了支持这一观点，p110 N（IC）亚单位和Notch1前体仍然具有胰蛋白酶抗性（图。A、 下部面板）。这些结果与早期的结果一致(7,26)表明Notch1前体的细胞外裂解发生在加工的Notch1受体输出到细胞表面之前或同时。
胰酶处理活T细胞后Notch1蛋白的Western blot分析。本分析选择的T细胞系包括两个具有I型突变的细胞系L45（B）和L96（D），以及一个具有II型突变的基因系L48（E）。对照品包括L42（A）（野生型[WT]，无槽口1重排）和表达N（EC）的293T细胞斯图作为分子质量标准（C）。相同数量的细胞（～107)用于每种胰蛋白酶条件。细胞在37℃用无血清RPMI培养基清洗一次，然后在37℃在不含胰蛋白酶的RPMI中培养15分钟（通道1和6），或用胰蛋白酶在0.1μg/ml（通道2）、1μg/ml。细胞在4°C的PBS中用胰蛋白酶抑制剂清洗两次，然后立即在RIPA缓冲液中用蛋白酶抑制剂溶解，以进行随后的Western blot分析。首先用extra-1（A和D）或extra-2（B、C和E）抗血清处理免疫印迹（上图）。然后剥离抗血清的印迹，并用intra-1抗血清进行重制（下面板）。免疫反应带的符号如图所示。.
相反，～p275截断了N（EC）静音L96细胞对胰蛋白酶有抵抗力（图。D、 上部面板）。此外，在L45细胞中，突变体~p250N（EC）静音尽管p280 N（EC）重量加工的Notch1受体对胰蛋白酶敏感（图。B、 上部面板）。综上所述，这些结果表明截断的N（EC）静音蛋白质不接触质膜的外表面，因此很可能存在于分泌途径中。
测试截断的～p275 N（EC）静音蛋白质被分泌，我们通过在37或4°C的PBS中培养活L96细胞15分钟，然后分析PBS上清液中p275的出现来进行体外检测。当活L96细胞在37°C而非4°C下培养时，～p275 N（EC）静音蛋白出现在PBS培养基中（图。C） ●●●●。用intra-1对Western膜的再疏水显示，在任何测试条件下，没有N（IC）释放到PBS培养基中（数据未显示）。由于截断N（EC）静音L96细胞中表达的蛋白质与膜无关（胰蛋白酶抗性，图。D） ，它们存在于L96调节PBS培养基中，表明它们已被分泌。
对T淋巴细胞系培养基中释放的Notch1胞外区和瞬时转染的293T细胞进行Western blot分析。检测的细胞包括一个I型突变株L96（C）和一个II型突变株L 48（B）。对照组为L42（A）系细胞（野生型[WT]，无Notch1重排），以及瞬时转染含有全长Notch1（Notch8.0）（D）、NΔCT（E） 或仅表达向量（F）。电池（3×107)分别在37°C（1道）的PBS、4°C的PBS（2道）或4°C下的PBS加1 mM EGTA（3道）中培养10分钟。对于瞬时转染的细胞，用5μg质粒载体DNA转染一个100 mm的细胞培养皿。转染后两天，将细胞分为两等分，并在PBS中4或37°C培养15分钟，如图所示。培养后，通过低速离心（1000×克)上清液用30分钟高速离心（150000×克). 用extra-1抗血清（顶部面板）或抗gp70包膜蛋白（底部面板）对上清液进行Western blotting分析。用RIPA提取细胞颗粒，并用extra-1抗血清进行Western blotting分析，作为细胞数量的对照（中间面板）。
新II型插页槽口1突变等位基因编码C-末端截断的Notch1受体，PEST结构域缺失，正常处理。
我们对新的II型整合簇的表征表明，编码的突变Notch1蛋白可能是Notch1的一种新的致癌形式。为了破译突变的Notch1蛋白结构，我们研究了我们之前建立的T细胞系L48(16)后来发现了一个II型插入物槽口1突变。我们对L48细胞中表达的Notch1蛋白进行了Western分析。L48 Notch1前体（图。A和B，通道7和12）似乎被截断，迁移速度略快（约320 kDa），比L42细胞（通道3）的野生型受体（330 kDa，或比293T细胞（通道11）的全长Notch1受体快。使用intra-2（识别C末端OPA结构域）未检测到该～320-kDa前体（图。D、 车道12），表明前兆缺少C终点。
使用1内抗血清在L48细胞中检测到两种不同的N（IC）细胞质裂解产物：p110，可能来自未排列的等位基因，以及更丰富的p89，最可能由突变的等位蛋白编码（图。C、 车道7和12）。intra-2无法识别89-kDa蛋白（图。D、 通道12），表明该蛋白是一种C末端截断的胞质Notch1蛋白[N（IC）ΔCT]. L48突变体槽口1等位基因也表达正常的280-kDa外结构域[N（EC）]（图。A和B，第7和12道）与野生型p280结合，发现于对照未排列细胞系L42（第3道）和瞬时转染的293T细胞表达全长槽口1DNA（11号通道）。这些数据表明，L48细胞中检测到的丰富的280和89kDa蛋白是经过加工的N（EC）和N（IC）ΔCT分别从截断前体生成的结构域（图。). 这些数据得到了L48细胞提取物的免疫沉淀和Western分析的进一步支持，其中用锚蛋白重复序列导向的抗血清intra-1进行的免疫沉淀能够将N（IC）与280kDa蛋白共沉淀(16)后者被细胞外定向抗血清识别（结果未显示）。总之，我们的数据表明，受体处理不需要C末端OPA和PEST序列。
为了确定其他携带II型前病毒插入突变的肿瘤是否产生突变的Notch1受体蛋白，对4例具有不同II型C末端插入的胸腺瘤进行了Western分析（图。). 分析结果（图。、通道4至6和8）与L48细胞获得的结果相似。1内抗血清检测到截短的N（IC）ΔCT分子量从～70到90 kDa的蛋白质，与绘制的整合位点非常一致（图。A） ●●●●。肿瘤还产生110-kDa细胞质Notch1蛋白和280-kDa-外结构域N（EC）。可以预测大部分p280是由截短的Notch1受体的加工产生的。p110很可能对应于肿瘤细胞中未排列等位基因的加工N（IC）。肿瘤内的基质细胞和多克隆细胞也可能表达野生型Notch1，从而促成在p280和p110处观察到的信号。这些数据表明，3′-截断槽口1等位基因产生了大量经过加工的突变Notch1受体。
为了独立确认C末端截断的Notch1受体产生的表达谱，我们构建了小鼠Notch1接收器的C末端缺失突变体NΔCT，删除除欣dIII现场（图。B和A） ，并对293T细胞的体外表达蛋白进行了分析。同时，作为对照，我们还分析了一个完全不同的Notch1缺失突变，其中锚蛋白重复序列缺失（NΔ银行). NΔ银行突变的特征是果蝇属有明显的功能丧失(25,34). 每个克隆的高水平表达都是在任一瞬间实现的（图。，3号和4号车道；图。293T细胞的稳定转染（数据未显示），其表达极低水平的内源性Notch1（图。A、 车道1）。NΔCT和NΔ银行构建体产生截短的Notch1前体，该前体被细胞外定向的抗血清和每个细胞内定向的抗血清中的一个识别（图。，车道3和4）。两个NΔCT和NΔ银行构造产生了一个经过处理的280-kDa N（EC），它被extra-2和extra-1识别，但不被intra-1或intra-2识别（车道3和4）。正如在体外表达的全长Notch1中观察到的那样，p280在表达缺失突变体N的293T细胞的Western blot中表现为双重ΔCT或NΔ银行当使用anti-extra-1进行分析时（图。A、 通道3和4），可以识别小鼠和人类Notch1表位（未发表的观察结果）。该p280倍体也在外胚层表达的全长Notch1（车道2）中观察到。这些数据表明，异位处理的Notch1受体（全长或细胞质缺失突变体）的高水平表达增强并稳定了293T细胞内源性人类Notch1感受器的表达。值得注意的是，外源性表达的N（EC）未表现出这种明显的稳定性纳尔或N（EC）斯图蛋白质（通道3和通道4）。每个缺失突变产生的加工细胞质结构域较短（～80～～89 kDa），并且缺少缺失的表位：N（IC）Δ银行缺乏1内表位，并且N（IC）ΔCT缺乏2内表位（图。C和D，车道3和4；图。C、 车道9和10）。由于每个构建物在转染细胞中产生一种RNA（数据未显示），这排除了cDNA产生的转录物的人工选择性剪接以某种方式产生截短蛋白的可能性。这些结果强烈表明，p280和p80/89分别对应于正常处理的N（EC）和截断的N（IC）亚基。此外，这些数据表明，在没有锚蛋白重复序列或C末端结构域的情况下，Notch1受体可以进行加工。
由C末端截短的II型突变Notch1前体产生的加工280-kDa N（EC）蛋白在细胞表面表达，N（EC重量蛋白质。
如上所示，II型C末端截短的Notch1受体似乎被正常处理。为了证实这些受体在细胞表面表达，用越来越多的胰蛋白酶处理活L48细胞以降解细胞外蛋白，并用extra-1或intra-1的Western blotting分析产生的细胞蛋白。该分析结果表明，L48细胞表达的加工p280 N（EC）蛋白随着胰蛋白酶数量的增加而逐渐降解（图。E、 上部面板）。C-末端截短的前体～p320和截短的N（IC）亚单位p89仍然对胰蛋白酶具有抵抗力，如1内免疫印迹中这些蛋白的稳定存在所示（图。E、 下部面板）。L48细胞的细胞表面蛋白碘化证实，经过处理的p280存在于细胞表面，因为p280/N（EC）蛋白而非p320、p110或p89 Notch1蛋白被强烈碘化（数据未显示）。这些数据表明，经过处理的N（EC）位于L48细胞的细胞表面。
加工后的Notch1 p280 II型胞外域N（EC）蛋白以温度依赖和钙敏感的方式从转化的T淋巴细胞中脱落。
产生Notch1胞外域（我们称之为p280N（EC））的蛋白水解切割可能发生在前体的细胞外、膜旁位点(26). 我们的数据与这一论点一致，因为呋喃加工的N（EC）蛋白（1654 aa）的分子量与截短的N（CE）的分子质量几乎相同静音在L96细胞（1640 aa）和N细胞（EC）中产生纳尔体外产生的突变株（1651aa）。作为一种严格意义上的细胞外蛋白，加工后的Notch1胞外区在某些情况下可能会与细胞表面分离。为了验证这一假设，在不同条件下培养后，分析表达Notch1细胞的上清液中的脱落p280。由于Notch1受体的粘附是钙依赖性的(15)，我们选择在4°C的PBS–1 mM EGTA中寻找外结构域分离，以测试钙是否可以介导N（EC）与细胞表面的关联。T细胞在37°C下与1 mM EGTA孵育会引起高水平的细胞死亡，因此无法测试这种情况。细胞也在37或4°C的PBS中培养10分钟。通过Western blotting分析细胞上清液中处理过的N（EC）释放到PBS上清液（图。).
在37°C的PBS中培养细胞后，无论细胞是否表达全长Notch1受体（对照L42细胞），都会将可溶性p280释放到培养基中（图。A、 通道1）或C末端截断受体（L48细胞）（图。B、 车道1）。在任何条件下，培养基中均未检测到Notch1前体或Notch1细胞质结构域，这表明细胞并非简单地被溶解并将细胞内容物释放到PBS中（数据未显示）。我们在上面显示，几乎所有在L42和L48细胞中表达的加工Notch1 p280都对胰蛋白酶敏感，因此存在于细胞表面（图。A和E）。因此，在来自L42和L48细胞的PBS培养基中发现的p280可能已经脱落，而不是分泌。在4°C孵育期间，细胞中几乎没有p280的释放（图。A和B，通道2），表明细胞释放p280依赖于温度。然而，将EGTA添加到4°C孵育中，导致L42和L48细胞（第3通道）中p280的可测量释放。这些数据表明，细胞表面检测到的部分p280通过钙敏感的相互作用结合。在所有测试条件下，大部分免疫反应性p280仍与细胞颗粒相关（图。，中间面板）。在不同条件下，细胞释放的p280的差异量对于组成性脱落的不同病毒蛋白来说是不存在的(42)，MuLV包膜gp70蛋白（图。，底部面板）。
对瞬时转染全长Notch1（Notch8.0）、C末端切割的Notch1细胞（NΔCT)或仅表达向量。在37°C而非4°C培养的所有三组细胞中，可以检测到培养基中存在p280（图。D至F）。值得注意的是，293T细胞内源性表达的人Notch1蛋白的外结构域也在37°C时释放（图。F、 车道1）。
总之，我们的数据显示，由野生型~p330前体或II型C-末端截短突变体~p320前体产生的经处理的Notch1 p280N（EC）表现相似，并在生理条件下释放到细胞外培养基中。
讨论
两个不同的槽口1前病毒插入突变等位基因与小鼠T细胞白血病的发生有关。
我们报告了两个不同的前病毒插入突变簇的比较分析槽口1基因分离约20kbp。一个集群，以前报告过(16)第二个新发现的簇发生在Notch1 C末端（II型）外显子编码的800-bp片段内。这两种类型的插入有几个区别槽口1突变体。首先，在I型突变体中，前病毒以正反义方向插入TM编码区周围，而在所分析的所有16个II型C末端突变体中的前病毒整合在正反义定向中。这表明对前病毒的这种感觉定向有很强的选择性，并表明可能需要LTR作为启动子发挥作用（启动子插入），尽管可能从LTR启动子合成的1.3-kb 3′末端RNA尚未被检测到。其次，截短的细胞质N（IC）I型突变蛋白是由截短的3.5到4.0kb RNA合成的，而N（ICΔCTII型突变蛋白是通过受体处理产生的。第三，在任何细胞质加工之前，由I型突变等位基因产生的N（IC）突变蛋白编码TM结构域和完整细胞质结构域，而N（ICΔCTII型突变蛋白含有胞外柄、TM结构域和胞质结构域，PEST基序缺失。第四，N（IC）I型突变蛋白是在代理启动子（LTR或隐式，分别用于正、反义前病毒方向）的调控下组成性产生的，而N（ICΔCTII型C-末端截短的突变蛋白是在槽口1启动程序本身。最后，N（EC）静音由I型突变等位基因产生的截短蛋白具有胰蛋白酶抗性，并且似乎不存在于细胞表面，而是存在于分泌途径中。相反，C末端截短的II型突变受体产生的N（EC）蛋白似乎是正常加工的，并在细胞表面表达（对胰蛋白酶敏感）。因此，在这个生物系统中产生的I型和II型Notch1突变蛋白具有非常不同的结构。
去除PEST作为一种新的激活机制槽口1致癌。
C-末端截断突变槽口1或哺乳动物的其他成员槽口此前尚未报道该家族。然而，胸腺瘤中出现的II型C末端截短与果蝇属突变体N个60克11和l（l）牛顿三，两者都删除了果蝇属缺口OPA和PEST序列(8,27). 仅从全长切除OPA结构域，但不切除PEST结构域果蝇属Notch受体产生一种行为类似于野生型受体的蛋白质(25,34). 因此，现有数据似乎表明，PEST结构域而非OPA结构域的去除是导致突变Notch1受体活性的原因。是否存在争议l（l）N三和N个60克11等位基因表现为功能缺失突变(4,27)或者不是(8). 如果为NΔCT在我们的系统中表现为低形态等位基因，II型突变的发生率可能高于I型突变槽口1+/−-背景不足；然而，我们没有观察到这种偏差（表) (17). 此外，野生型槽口1等位基因在含有II型C末端插入的肿瘤中被保留和表达，表明NΔCT突变表现为显性等位基因。为了进一步支持这一论点槽口1在T细胞肿瘤形成中，人们严重倾向于认为槽口1会产生致癌蛋白(2,10,13,31). 基于前病毒整合的高频率槽口1MMTV肿瘤的C末端D类/myc-Tg小鼠，II型N是有争议的ΔCT等位基因，如截短的N（IC）Notch1突变体(2,三,14,16,17)，是否与c细胞协同参与肿瘤形成的获得性功能突变-myc公司转基因。
C末端截断的Notch1突变体可能通过几种可能的机制参与T细胞转化。假设PEST序列的缺失可能导致Notch1致癌形式的产生，这似乎是合乎逻辑的。从c中删除PEST域-福斯原癌基因参与其致癌激活(40). 已知从各种蛋白质中删除PEST序列可以稳定并增加其水平（参考文献中综述35). Notch1胞质内结构域[N（IC）ΔCT]，因为C端截断N（IC）的水平较高ΔCT在L48细胞和其他含有C末端前病毒整合的肿瘤中检测到（89kDa）。此外，先前对L48细胞中表达的突变Notch1受体的脉冲相分析表明，截断的N（IC）ΔCTp89的半衰期比共表达的野生型p110 N（IC）蛋白长(16). 从各个方面的分析槽口1插入突变体，似乎需要组成性高水平的N（IC）蛋白进行转化。这可以通过过度表达截断的槽口13′端RNA（I型突变）或通过PEST结构域的缺失（II型突变）。因此，通过看似不同的机制，两个结构不同的突变体槽口1等位基因可能对细胞质信号传导具有相同的最终影响。
除了单纯增加N（IC）蛋白水平外，Notch1 C末端的缺失也可能影响Notch1信号传导。众所周知，锚蛋白重复序列的C区末端含有一个与蓬乱的（dsh）和麻木的基因。Dsh是无翅信号通路的下游成分，Numb是不对称定位的细胞命运决定因素。这两种基因产物通过结合其C末端结构域抑制Notch信号(4)更具体地说，在Numb的情况下，其PEST域(41). 删除其Dsh绑定域或PEST域（绑定Numb）可以使Notch避开Dsh的抑制(4)或Numb(41)分别是。此外，转基因果蝇中仅C-末端Notch结构域的异位表达足以抑制依赖Dsh的鬃毛生成，可能是通过竞争性结合野生型Notch受体的抑制性Dsh蛋白(4). 由于这里分析的II型C末端整合100%发生在感觉定向，这就打开了3′转录物由LTR启动子产生并积极产生C末端Notch1蛋白的可能性。据报道，此类蛋白质将与Dsh样蛋白质结合并滴定出Dsh样蛋白并抑制其功能果蝇属(4). 然而，到目前为止，我们还无法在肿瘤或产生II型C末端截断Notch1受体的细胞中检测到此类转录物或蛋白质。这种含有短PEST的Notch1蛋白在相对较低的水平上具有活性。未来的工作应该是确定这一途径是否参与细胞转化。
野生型和突变型Notch1胞外结构域的命运。
我们对胰蛋白酶化T细胞的研究结果与提出的模型一致，该模型表明Notch1受体前体位于亚细胞隔室中，在处理后，受体转移到细胞表面(7,26,30). 此外，正如Kopan小组所观察到的那样，突变的N（IC）蛋白可能在其细胞质表面经历了额外的加工过程(12,22,36). 我们发现截断的N（EC）静音尽管蛋白质的结构与加工过的p280N（EC）非常相似，但它们仍然具有胰蛋白酶抗性重量亚单位。这些数据表明，只有正常处理并随后与N（IC）细胞质亚单位结合，才能在细胞表面稳定表达野生型胞外区。我们的联合免疫沉淀分析表明，部分经过处理的p280 N（EC）重量与细胞内N（IC）或N（ICΔCT片段，作为异二聚体(16). 由于锚蛋白重复结构域中缺失的Notch1受体也产生加工的N（EC）和N（IC）Δ银行亚单位，该受体可能也以组装的异二聚体的形式存在于细胞表面。因此，我们的数据与其他人使用野生型Notch2获得的结果一致(7)和槽口1(26)并将其延伸到携带细胞质缺失的Notch1受体。
在我们的分离分析过程中观察到N（EC）蛋白的另一个不寻常特性。我们发现，在生理条件下，从野生型或C末端截短的II型突变体前体加工的N（EC）蛋白脱落，而N（EC静音由I型突变体产生的突变体在表达细胞的培养基中以显著的速度分泌（图。). 脱落和分泌是以对温度敏感的方式发生的，至少释放的一部分胞外区可以通过培养基中钙离子的螯合作用而增强。从II型C末端截短的Notch1受体中去除N（EC）可能会产生一个非偶联的细胞质结构域，该结构域类似于先前确定的Notch2致癌版本(2,10,14,16,31). 有趣的是，由I型等位基因N（EC）产生的截短的Notch1蛋白静音和N（IC）实际上也是去耦Notch1受体的单独成分。
这两个缺口1（图。)及其配体Delta(32)可能会在不同的生理环境中自然脱落其外结构域，这为Notch信号级联增加了另一个有趣但复杂的方面。最近有报道称果蝇属δ是通过细胞表面的分裂产生的，这些形式起到Notch活性激动剂的作用(32). 相反，发现Notch配体Delta和Serrate人工截短和分泌的胞外域可拮抗Notch信号传导(39). 人类同源基因的类似截断突变塞拉特,锯齿状1在Alagille综合征患者中发现，可能产生细胞外分泌形式并拮抗Notch1信号(24,29). 总之，这些数据表明，Delta的精确加工对于产生激动剂可溶性形式至关重要。由于Notch及其配体具有相同的一般结构，有趣的是，先前研究的Notch配体的可溶性形式与我们系统中I型和II型突变产生的Notch1外结构域的可溶性形式非常相似。如果Notch与其配体采用相同的范式，则观察到II型肿瘤中经过处理的N（EC）的细胞外脱落预计会刺激Notch1配体的信号传导，而截短的N（CE）的分泌静音I型肿瘤的外结构域有望拮抗Notch1配体的信号传导。分布在肿瘤细胞本身（自分泌效应）或其他基质细胞（旁分泌效应）上的Notch1可能不止一种配体的这种信号增强或减弱可能在某种程度上有助于肿瘤的发展。这将为可溶性Notch1外结构域在复杂的肿瘤形成机制中发挥新的作用。
