核糖体DNA沉默缺陷的遗传筛选鉴定多种DNA复制和染色质调节因子

受影响基因的突变和鉴定。

利用转座子Tn诱变单倍体菌株JS306和JS3113:：lacZ:：LEU2如Burns等人之前所述(13). 从Mike Snyder的实验室（通过Susan Michaelis）获得了酵母基因组DNA文库。这个文库在大肠杆菌按随机Tn3:：lacZ:：LEU2集成事件。通过用不是通过使用高效的乙酸锂-聚乙二醇-二硫苏糖醇程序，I转化为JS306和JS311。将细胞接种到缺乏亮氨酸的合成完整（SC−Leu）培养基上（约200至250个转化子/平板），以选择Leu⁺转座子中断的DNA片段通过同源重组整合到基因组中的突变菌落。

亮氨酸⁺将生长3天的菌落复制到SC-Leu、SC-Ura、SC-His和MLA培养基上，以检测rDNA沉默表型的变化。在3天的时间里，每天监测复制板上的菌落，这些菌落与同一板上的其他菌落有显著差异。3天后，只有当菌落在SC−Ura和MLA平板上都改变了沉默表型时，才选择菌落进行进一步研究。两大类突变体，rDNA沉默缺失(lrs公司)增加rDNA沉默(国税局)获得了。这个HIS3型报告者对增加rDNA沉默筛查很有用，因为国税局突变菌落通常表现为Ura⁻但仍然是他的⁺使它们与仅仅失去mURA3/HIS3来自rDNA的记者磁带。在SC−Leu培养基上为单个菌落挑选突变菌落并进行重排，生长3天，并将复制品镀到SC−Ura、SC−His和MLA培养基上，以重新测试突变表型（2°屏幕）。

这个轻轨系统突变体被分为（i）那些具有通过MLA生长菌落的超分割测定的rDNA重组表型的突变体和（ii）那些不扇形的突变体。通过质粒拯救和DNA测序鉴定每个超敏突变中的转座子中断基因。对于大多数人轻轨系统突变体mURA3/HIS3报告基因首先从rDNA中去除，方法是简单地将细胞镀到YPD上，然后通过复制镀产生的菌落，将Ura⁻伊斯⁻菌落很容易识别。乌拉⁻每个的版本轻轨系统将突变体接种到10-ml YPD培养物中并生长约16h。然后用约0.5μg的Pvu公司I-线性化Yip5向量。乌拉⁺选择菌落，并使用Teeny prep球体成形法分离基因组DNA(6). 回收的DNA用Nsi公司I并在4°C下使用T4 DNA连接酶在夜间进行自我训练循环。结扎混合物转化为大肠杆菌DH5α，并在添加了羧苄青霉素（50μg/ml）的LB上选择。质粒DNA被恢复，转座子恢复通过限制性内切酶图谱进行验证。通过DNA测序鉴定了回收的转座子侧翼的基因组DNA。

对于国税局突变体，使用的程序类似，只是mURA3/HIS3盒式磁带未从rDNA中取出。相反，Sca公司I线性化pRS404(TRP1号机组)用于质粒拯救。回收的酵母基因组DNA用Spe公司我之前循环并转换为大肠杆菌.

优势测试。

每个突变体都与一个相反交配类型的菌株交配，该交配类型在rDNA中不包含报告基因，是Trp⁺简单地说，将突变菌株在SC−Leu上进行单菌落划线，培养3天，并将复制品镀到YPD平板上，以及JS314的草坪上(材料α） 或JS315(材料一). 让这两个菌株在30°C下交配5小时，然后将YPD交配板复制到SC−Leu−Trp上并生长过夜以选择二倍体形成。然后将得到的二倍体复制到沉默指示介质SC−Leu−Trp−Ura或MLA上，以测试优势。杂合子轻轨系统还将二倍体的单个菌落重新切割到MLA上，以通过rDNA扇区分析测试优势。回交分析用于确认突变表型与Tn的共分离3:：lacZ:：LEU2在屏幕上以单个分离物表示的突变体的转座子插入。

PCR介导的基因破坏。

对筛选出的几个基因进行完全开放阅读框（ORF）删除，以确认Lrs⁻或Irs⁻沉默该特定突变体的表型。PCR介导的基因破坏如其他地方所述(5,51). 主要耐药标志物，kanMX4码(79)，是否从pRS400中扩增出PCR(8,71)使用含有39个核苷酸的寡核苷酸引物，与靶向ORF的5′端和3′端互补。将得到的PCR片段转化为JS306或JS311，并用kanMX4码选择在含有G418（200μg/ml）的YPD培养基上生长。

抑制生长分析。

将待测菌株接种到YPD或选择性培养基上（如果它们含有质粒），并培养过夜。从平板上刮下细胞，并将其重新悬浮在1ml无菌水中。细胞悬浮液标准化为A类₆₀₀读数为0.5，然后以五倍的增量连续稀释；使用八通道移液管将每种稀释液中的5μl滴到非选择性或选择性SC琼脂平板上。培养板2至5天。2天后，对除SC−Ura外的所有平板拍摄了宝丽来照片。除非图形图例中另有规定，否则在4天后拍摄SC−Ura板的照片。

菌落颜色沉默分析。

将待测菌株贴在YPD上，隔夜培养。然后将细胞条痕化到MLA板上，每个板上有四个或六个扇区。这些盘子用草甘膦薄膜包裹以防止脱水，然后让它们生长5天。在第5天，使用配备35毫米彩色相机的徕卡立体显微镜拍摄照片。

端粒长度分析。

将每个突变体的两个独立菌落轻轻接种到10 ml YPD培养物中，并孵育约16 h。将细胞制成颗粒，并使用Teeny prep球状成形法分离基因组DNA，如前所述(6). 将核酸微丸重新悬浮在100μl Tris-EDTA（TE）中，并在30μl反应中消化15μl（2至4μg DNA）Xho公司我用0.7%琼脂糖凝胶分离。将DNA转移到Genescreen Plus（NEN-Dupont）中，进行紫外线交联，并在Church和Gilbert杂交溶液（1 mM EDTA，0.5 M Na）中与端粒特异性探针杂交₂高性能操作₄（pH 7.2]，7%十二烷基硫酸钠和1%牛血清白蛋白）在60°C下过夜。在室温下用洗涤液（2×SSC[1×SSC为0.15 M NaCl+0.015 M柠檬酸钠]，0.1%十二烷基硫酸钠）在60°C下洗涤印迹一次和三次（10分钟）。探针为350-bp生态质粒pYLPV中包含280-bp TG的RI片段_1–3端粒重复序列(81).

说明轻轨系统突变体及其沉默表型。

这个轻轨系统预测这类基因编码的蛋白质在结构上起作用或是rDNA沉默的正调控因子。在本文中，我们描述了LRS1(RFC1协议),LRS4系列(YDR439W型),LRS5(排名前1),轻轨7号(步枪1),LRS8型(CAC1公司)、和轻轨9号(CDC17型)（表​（表2）。2). 其余的LRS基因将在其他地方描述。图​图22显示了这些突变体的子集对mURA3型,HIS3型、和MET15型通过定量生长试验测定rDNA中的沉默，此前已证明与报告基因表达水平相关(71). 图​图3三显示了突变对MET15型通过定性菌落颜色测定测定的表达。每个轻轨系统突变体是更多的Ura⁺和他的⁺比WT（图。​（图2A）2A） 并在Pb上产生具有超重组扇形表型的白色菌落²⁺介质（图。​（图3）。三). 这个lrs5号机组在拓扑异构酶I基因中插入(排名前1)已知rDNA沉默因子(11,18)，因此验证了轻轨系统屏幕。

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图2

rDNA沉默所选突变体的表型。（A） 定量生长试验测量mURA3型和HIS3型在rDNA中。将五倍系列稀释的新鲜生长的细胞涂布在SC（完全）、SC−Ura（−Uras）或SC−His（−Hes）培养基上。所示应变为WT（JS306或JS311），前1名（M122），碳酸钙1（M179），cac1Δ（JS400），无线电频率1（M158），rif1Δ（JS418），lrs4Δ（JS574），sir2Δ（JS576），转速3（M480），rpd3Δ（JS490），sin3Δ（JS493），萨普30（M475），希尔3（M489），元组1（M419和M432），以及国税局4（M469）。照片是在第3天为SC−Ura板拍摄的轻轨系统突变体系列（面板顶部）和第4天国税局系列（面板底部）。（B） 定量生长测定沉默MET15型在NTS2中。将五倍系列稀释的细胞接种到SC和SC−Met−Cys培养基上。应变与面板A相同。

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图3

定性菌落颜色分析显示轻轨系统和国税局所选突变体的表型。从YPD培养基中刮取新鲜生长的细胞，并将其划到MLA培养基上进行单菌落培养。在拍照前5天培养细胞。轻轨系统突变体产生白色菌落，通常表现出高致病表型；国税局突变体产生较深的菌落颜色，表示减少MET15型与WT相比的表达式。轻轨系统所示菌株为WT（JS306），前1名（M122），无线电频率1（M158），碳酸钙1（M179），sir2Δ（JS576），以及lrs4Δ（JS574）；国税局所示菌株为WT（JS311），希尔3（M487），转速3（M480），sin3Δ（JS493）中，萨普30，M475中，国税局4（M469），和元组1（M419）。

轻轨S1被鉴定为单个转座子插入编码复制因子C大亚基的基因的启动子区域(RFC1协议)作为DNA聚合酶δ和ɛ的加工因子。RFC1协议是一个必需的基因，这种突变可能会改变其表达水平。这个轻轨9号基因被鉴定为编码DNA聚合酶α的基本催化亚单位(CDC17/POL1). 单身轻轨9突变由整合在ORF N末端部分的转座子组成。我们确认没有WT副本CDC17型通过PCR和回交分析（数据未显示），表明cdc17确实可行。这表明在无启动子的5′端可能存在一个隐蔽的酵母启动子lacZ公司转座子的基因，可以转录5′截短版本的CDC17型ORF公司。

轻轨7号被识别为RIF1级基因。RIF1级（Rap1-interacting factor 1）最初是从双杂交筛选中分离出来的与基本沉默因子Rap1p的C末端相互作用的蛋白质(38). 删除RIF1级增加端粒长度，增强TPE并减弱沉默HMR公司，可能是由于Sir3和Sir4蛋白在HM公司位点和端粒染色质室(12,38).

LRS8被识别为仙人掌1（染色质组装复合体），编码酵母染色质组装因子I（yCAF-I）的大亚单位。yCAF-I由三个蛋白亚单位（Cac1p[p90]、Cac2p[p60]和Cac3p[p50]）组成，优先将新合成的组蛋白H3和H4组装成新复制DNA上的核小体(45)类似于人类CAF-I（hCAF-I）的活性(72). 这个CAC公司基因不是必需的，但它们的缺失会导致适度的紫外线敏感性，并削弱TPE和HM公司消音(28,45). 虽然yCAF-I在沉默中的确切功能尚不清楚，但最近研究表明，它是稳定维持端粒和HM公司位点(27,54). 两份原件爱尔兰标准8(碳酸钙1)突变体和a碳酸钙1缺失突变体去除了所有三个rDNA报告基因（图。​（图2A2A和​和3）。三). 此外，删除CAC2公司或CAC3公司导致Lrs⁻表型（数据未显示），表明yCAF-I复合物整体上有助于rDNA沉默。

LRS4系列被确定为之前未标记的ORFYDR439W型该基因与任何已知功能的基因没有高度同源性，编码带正电荷的蛋白质（pI=10.34）。它似乎编码一种与肌球蛋白和其他线圈蛋白同源性有限的线圈蛋白。其在rDNA沉默中的功能尚不清楚。

说明国税局突变体及其表型。

这个美国国税局这类基因预计包括rDNA沉默的负调控因子。IRS1系统被确定为SIR4公司之前的研究表明，删除该基因会增加rDNA沉默(70). 隔离sir4因此，突变体验证了该筛选对国税局突变体。其他美国国税局本研究中描述的基因有IRS2系统(零售价3),IRS4系列(YKR019C型),IRS8标准(SAP30系列),IRS10型(HIR3型)、和爱尔兰共和国18(时间单位1)（表​（表2）。2). 每个基因（除了IRS4系列)之前已经证明具有染色质相关功能(26,39,44,64,73,84). 其他美国国税局基因将在别处描述。

IRS2系统被鉴定为组蛋白脱乙酰酶基因零售价3.Rpd3p是一种称为组蛋白脱乙酰酶B（HDB）的更大的多蛋白复合物的一部分(64)，其中还包含转录辅抑制因子Sin3p(41,43). Sin3p和特定DNA结合蛋白之间的物理相互作用将HDB靶向各种启动子，从而导致局部组蛋白脱乙酰化和转录抑制(41,65). 因此，在转速3导致rDNA沉默（Irs⁻)表型（图。​（图22和​和3）。三). 相同的Irs⁻当观察到表型时零售价3或SIN3号机组被删除（图。​（图2A2A和​和3），三)，表明irs2公司突变体是HDB复合体失去活性。虽然出乎意料，但这一表型与之前的研究完全一致，表明转速3或正弦3突变也增强TPE和HM公司消音(23,64,77).

HDB最近确定的另一名成员，称为SAP30系列(84)，与我们的屏幕隔离IRS8标准。类似于转速3和sin3Δ突变体国税8(萨普30)突变体有一个Irs⁻表型（图。​（图2A2A和​和3）。三). 然而，它在沉默方面的增加不如转速3或sin3Δ通过每个rDNA沉默试验测量的突变体（图。​（图2A2A和​和3）。三). 由于HDB活性的丧失改变了多个基因的表达，HDB突变体对沉默的影响可能是间接的。

IRS10型被鉴定为组蛋白调节基因HIR3型，比如HIR1型和希尔2，编码调节HTA1-HTB1型对细胞组蛋白H2A和H2B水平的反应基因(73).希尔突变在整个细胞周期中抑制组蛋白转录，而不是在G晚期正常情况下₁或早期S阶段(67). 有趣的是，希尔突变加剧了端粒沉默缺陷计算机辅助计算突变体，但自身很少或没有TPE表型(44,62). 与相比转速3突变体，希尔3突变体在增强rDNA沉默方面相对温和（图。​（图2A2A和​和3三).

爱尔兰共和国18被鉴定为全球转录抑制基因，时间单位1Tup1p及其伙伴Ssn6p通过与特定DNA结合蛋白的相互作用被招募到许多酵母基因中，以通过组蛋白H3和H4依赖机制抑制转录(39). Tup1p与组蛋白H3和H4的N末端尾部的直接相互作用有助于抑制(26). 尽管国税局18分离出M419和M420每个都含有mTn三在中插入时间单位1启动子，它们具有类似于M432的沉默表型，其中mTn三破坏了ORF。这个元组1突变体似乎对沉默mURA3型和HIS3型（图。​（图2A）2A） 但有一个更明显的Irs⁻表型MET15型记者（图。​（图2B2B和​和3）。三). 这是首次报道图1对…有影响统计资料记录-介导沉默。然而，这种效应可能是间接的，因为Tup1p抑制了许多基因的表达，而突变体增加了沉默的强度。

IRS4系列被认定为ORFYKR019C型其主要区别特征是C末端Eps15同源（EH）结构域，这是最近发现的蛋白质相互作用结构域(24). 酵母EH蛋白的原型是Pan1p，它参与肌动蛋白的组织和内吞(75). 有趣的是，Irs4p还包含一个DNA聚合酶B签名基序（YDDTDS），位于390到396个氨基酸位置。类似于元组1突变体国税局4突变体对mURA3型和HIS3型记者（图。​（图2A）。2A） ●●●●。更具戏剧性的Irs⁻观察到MET15型记者被安置在NTS2（图。​（图22B） ●●●●。

重要的是mURA3型或MET15型rDNA以外的记者没有被轻轨系统或国税局我们测试的突变（数据未显示）。这些突变包括cac1Δ,rpd3Δ,rif1Δ,lrs4Δ、和sin3Δ这些结果表明，这些突变对mURA3型和MET15型rDNA中的表达是由于rDNA染色质的一般影响，而不是对所使用的单个启动子的特定影响。

rDNA沉默轻轨系统和国税局突变体受Sir2p水平的控制。

rDNA沉默对证券投资风险2剂量(31,71). 因此，我们有兴趣确定轻轨系统和国税局突变体仍然容易受到证券投资风险2剂量效应。如果这些基因中有任何一个是证券投资风险2在沉默通道中，然后他们的Lrs⁻或Irs⁻表型应能抵抗证券投资风险2剂量。为了验证这个假设，我们过度表达了证券投资风险2在几个突变背景中，测试了Ura中rDNA沉默强度⁺和他的⁺生长分析。证券投资风险2过度表达增加了碳酸钙1(爱尔兰标准8)变种，用较少的Ura测量⁺与包含空向量的菌株相比，生长（图。​（图4A）。4A） ●●●●。然而，在His中观察到的影响较小⁺检测，与HIS3型报告者对这种突变中的rDNA沉默更具抵抗力。影响证券投资风险2过度表达对于顶部1Ura中的突变体⁺和他的⁺化验，表明前1名突变体对增加的证券投资风险2剂量。无线电频率1和lrs4号机组突变体对证券投资风险2剂量（未显示数据）。证券投资风险2过度表达也进一步加强了所有人的rDNA沉默国税局测试突变体，包括元组1,sin3Δ,萨普30（未显示），rpd3Δ、和希尔3（图。​（图4B）。4B） ●●●●。这些结果表明，大多数轻轨系统和国税局突变体对证券投资风险2他们将这些基因定位在SIR2上游或rDNA沉默的不同遗传途径中。

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图4

的影响证券投资风险2rDNA沉默突变体的过度表达。（A） 高拷贝数空向量pRS424或证券投资风险2载体pJSS70-9被转化为WT菌株JS306轻轨系统突变体包括碳酸钙1（M179）和前1名突变体（M154）。在SC−Trp上发现五倍的连续稀释液，该稀释液选择质粒SC−Trp−Ura来测量mURA3型，和SC−Trp−His来测量HIS3型.（B）五倍系列稀释液国税局含有高拷贝数空向量或高拷贝数的突变体证券投资风险2矢量。

一些端粒较长的突变体也会削弱rDNA沉默。

我们之前提出，由于rDNA和端粒之间竞争有限的Sir2p池，rDNA沉默强度可以由端粒长度调节(71). 同样，额外的端粒通过滴定一种未知的沉默因子来减弱端粒报告基因的沉默(82). DNA复制基因的某些突变cdc17(波尔1)和射频控制1，和的空突变无线电频率1与WT菌株相比，导致端粒延长(1,38). Lrs公司⁻每个基因的插入等位基因都被分离出来（表​（表2；2; 图。​图5A）。5A） ●●●●。Lrs系列⁻因此，这些突变体的表型可能是由于长端粒隔离Sir2p并将其从rDNA中耗尽。正如该模型预测的那样射频控制1(lrs1号机组)和cdc17(轻轨9)突变体的端粒确实比亲本菌株长得多（图。​（图5B）。5B） ●●●●。这个无线电频率1(lrs7号机组)突变体具有较长的端粒，与其他突变体相比，端粒产生的带型在性质上不同（图。​（图5B）。5B） ●●●●。这种不寻常的带状图案是特定于无线电频率1突变是因为它在回交中共分离。

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图5

一类端粒异常长的rDNA沉默突变体。（A） DNA复制突变体cdc17和射频1和端粒调节突变体步枪1，分别隔离为轻轨系统突变体。每个突变体被杂交到一个sir4Δ：：HIS3相反交配类型的突变体，产生杂合二倍体，对其进行孢子化和四分体切割。将产生的单倍体菌株培养在MLA培养基上，并对其沉默损失进行分析MET15型根据菌落颜色测量。所示应变为WT（JS333），sir4Δ（JS337），cdc17（JS432），cdc17 sir4Δ（JS436），射频控制1（JS443），rfc1 sir4Δ（JS445），无线电频率1（JS422），以及rif1 sir4Δ（JS426）。（B） 端粒稳定长度轻轨系统突变体与sir3Δ和sir4Δ突变。从列出的每个突变体的两个分离物中分离出基因组DNA，用Xho公司一、 并在0.7%琼脂糖凝胶上分离。转移的DNA用C检测_1–3A特异性DNA探针，在这个印迹上可以检测典型的Y′端粒（如下图所示）。可变长度的端粒被可视化为涂片（括号）。除了面板A中描述的突变体外，还有类似的突变体sir3Δ（JS335）中，cdc17 sir3Δ（JS434）中，rif1 sir3Δ（JS424），rif2Δ（JS495），以及rif2Δrif1（JS497）菌株。

每个rDNA重复都包含一个复制来源(74). 因此，除了对端粒长度的影响外，Cdc17p和Rfc1p可能在与其DNA复制功能相关的rDNA沉默中发挥更直接的作用。此外，Top1p和Dpb3p是我们分离的另外两种DNA复制蛋白轻轨系统突变等位基因没有延长端粒（数据未显示）。为了将这种复制模型与端粒竞争模型区分开来，我们将射频控制1,cdc17、和无线电频率1突变sir3Δ和sir4Δ突变并测试Lrs⁻双突变体的表型发生逆转。删除瑞士证券交易所3或SIR4公司在中轻轨系统预测突变体可以阻止Sir2p的端粒滴定到端粒并远离rDNA。Sir2p仅定位于sir4Δ突变株(32). 对于射频控制1和cdc17，双突变组合sir4Δ确实逆转了Lrs⁻表型为WT或略强于WT水平（图。​（图5A，5A、 底行）。然而，完整的Irs⁻预期的表型sir4Δ未观察到突变体。这些结果表明，对rDNA沉默的影响很大，但可能不是全部，由射频控制1和cdc17突变是由于端粒竞争引起的。当射频控制1和cdc17与sir3Δ突变（数据未显示）。这些双突变菌株的端粒长度也介于WT和单突变长度之间（图。​（图5B）。5B） ●●●●。此外，端粒长度在长期应变传代过程中没有变化（数据未显示）。

相比之下rif1 sir4Δ与WT相比，双突变体减弱了rDNA沉默，类似于无线电频率1单个突变体（图。​（图5A）。5A） ●●●●。这一结果表明，Rif1p可能在rDNA沉默中发挥直接作用，而rDNA沉默与端粒竞争无关。Rif1p与另一个名为Rif2p的Rap1相互作用因子发生物理相互作用(83)也具有调节端粒长度的功能。意外地，删除了RIF2级对rDNA沉默的强度没有影响（数据未显示），即使这些菌株有较长的端粒（图。​（图5B）。5B） ●●●●。此外，arif1 rif2Δ突变体的端粒非常长（图。​（图5B）5B） 但并没有削弱rDNA沉默无线电频率1单个突变体（数据未显示）。这些结果表明无线电频率1突变体可能与其Lr无关⁻表型。

lrs公司和国税局突变体改变rDNA染色质的结构。

确定削弱rDNA沉默的突变(轻轨系统)也破坏rDNA染色质结构，我们测试了每一个轻轨系统补骨脂素体内交联试验中的突变(22). 该试验测量rDNA对补骨脂素交联的细胞内可及性。Lrs系列⁻表型沉默信息调控因子2之前的研究表明，突变体与补骨脂素在rDNA上的交联增加有关，反映出染色质结构更加开放(70). 通过天然琼脂糖凝胶上分离的rDNA片段流动性较慢检测到补骨脂素交联增加。NTS在一个子集中的可访问性轻轨系统突变体如图所示。​图6A。6A.释放的2.5kb NTS片段生态RI消化显示每种凝胶的流动性较慢轻轨系统突变体，类似于sir2Δ控件。这一结果表明，NTS在大多数情况下具有更开放的染色质结构轻轨系统变种人，不仅仅是携带sir2Δ.

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图6

通过体内补骨脂素交联测定突变体的rDNA染色质可及性。（A） 对数期培养轻轨系统突变体在体内与补骨脂素进行紫外线交联。用生态RI并在1.3%琼脂糖凝胶上分离，用rDNA（C）NTS特异性探针检测转移的DNA。这个sir2Δ菌株（JS343）对增加补骨脂素交联的可及性起到了积极的控制作用。其他显示菌株为WT（JS306），前1名（M122）中，无线电频率1（M158），和cac1Δ（JS400）。（B） 使用相同的NTS特异性探针对国税局突变体。测试菌株为WT（JS311），rpd3Δ（JS490），sin3Δ（JS493），萨普30（M475），希尔3（M411），和元组1（M419）。控制车道显示2.5-kb生态当菌株未交联时观察到的RI片段。（C） 的示意图生态本试验检测到RI rDNA片段。ARS，自主复制序列。

自从轻轨系统突变体具有开放的rDNA染色质结构，我们预计国税局突变体可能具有更封闭的染色质结构，这与更强的沉默一致。为了验证这一假设，对补骨脂素交联试验的一个子集国税局突变体（图。​（图6B）。6B） ●●●●。所测试的唯一一个突变体产生的NTS片段凝胶流动性比WT稍快（交联较少），是国税局18(元组1). 这个sir4Δ（未显示数据）和希尔3在本试验中，突变体对rDNA染色质没有检测到影响。由于该分析测量了rDNA染色质的平均状态，我们不能排除与标记基因相关的染色质在这些情况下没有改变。出乎意料的是rpd3Δ,sin3Δ、和sap30（HDB）突变体每个都产生凝胶流动性较慢的NTS片段，表明染色质结构更开放（图。​（图6B）。6B） ●●●●。组蛋白乙酰化被认为可以增加转录相关因子对DNA的访问。更开放的染色质结构rpd3Δ,sin3Δ、和萨普30因此，突变体与缺乏组蛋白脱乙酰化导致的rDNA中组蛋白高乙酰化完全一致，这表明HDB可能直接脱乙酰化rDNA组蛋白。然而，这个结果再次与自相矛盾的Irs相矛盾⁻HDB突变体的表型。

爱尔兰人⁻一种表型转速3突变体被碳酸钙1,无线电频率1、和沉默信息调控因子2突变。

反沉默和染色质可及性表型转速3,正弦3、和萨普30突变体促使人们更深入地研究零售价3和轻轨系统基因。我们问爱尔兰人⁻表型由转速3突变取决于轻轨系统基因，特别是证券投资风险2,CAC1公司，或RIF1级生成双突变组合，并使用Ura在rDNA沉默强度的上位性分析中进行测试⁺和他的⁺生长分析和菌落颜色分析（图。​（图7）。7). 我们获得了与沉默报告基因在rDNA重复序列中的位置相关的不同上位性结果。例如，使用mURA3/HIS3磁带读数，转速3突变完全超过了cac1Δ和步枪1突变（图。​（图7A）。7A） ●●●●。然而，对于MET15型在同一菌株中，双突变体产生了Met⁺（数据未显示）和介于两个单一突变体之间的群体颜色表型（图。​（图7B）。7B） ●●●●。因此，rpd3Δ部分覆盖cac1Δ和无线电频率1Lrs公司⁻表型。因此，mURA3型和HIS3型都位于18S编码区内，似乎受到转速3突变效应大于MET15型位于NTS2内。或者，这些差异可能是由简单的启动子差异引起的。

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图7

之间的表观分析转速3和轻轨系统rDNA沉默表型的突变。（A） 沉默报告菌株是通过以下组合产生的转速3任何一种突变sir2Δ,cac1Δ，或无线电频率1突变。对产生的菌株进行尿酸rDNA沉默强度分析⁺和他的⁺生长分析。将每个单倍体菌株的五倍系列稀释液点在指示板上。加号表示菌株是特定基因的WT，减号表示特定基因的突变。（B） 将相同的菌株接种到MLA培养基上，并在菌落颜色测定中测试沉默强度。每一列代表生长在同一平板上的菌株。

这个rpd3 sir2Δ突变的组合产生了明显不同的结果。双突变体再次导致中间rDNA沉默表型，但在本例中具有Lrs⁻每个分析中与WT相关的表型（图。​（图7）。7). 这一结果表明证券投资风险2Irs需要⁻表型转速3突变体，但那sir2Δ并非完全上位转速3。对于rpd3 sir2Δ结合，根据rDNA重复序列中报告基因的位置，对沉默也没有不同的影响。要确定其他统计资料记录导致Irs的基因⁻一种表型转速3突变体，我们生成rpd3 sir3Δ通过回交获得双突变体。删除sir3在中转速3突变体没有逆转Irs⁻表型（数据未显示），表明Irs⁻一种表型转速3突变通过瑞士证券交易所3-独立，SIR2型-依赖机制。

端粒长度对rDNA沉默的影响。

Sir4p介导rDNA和端粒之间对限量Sir2蛋白的竞争(71). 因此，端粒长度的变化预计会通过改变rDNA和端粒之间Sir2p的平衡来影响rDNA沉默的强度。事实上，三种不同的轻轨系统分离出端粒显著长于WT的突变体。也与此竞争模型一致，引入了sir4Δ突变为射频控制1或cdc17突变株背景部分逆转了它们的Lr⁻表型恢复到至少WT沉默强度，也显著缩短了端粒长度。这是一个重要的结果，因为在没有Sir4p的情况下，所有细胞的Sir2p都定位于核仁而不是端粒(32). 综上所述，这两项发现表明射频控制1和cdc17突变削弱了Irs⁻a的表型sir4Δ突变体通过端粒长度依赖机制，可能与其复制功能有关。

我们的发现使这个模型变得复杂rif2Δ突变体具有较长的端粒，但并没有削弱rDNA沉默。此外，与以下情况不同cdc17和射频控制1突变体Lrs⁻表型无线电频率1突变体并没有通过引入sir4Δ或sir3Δ突变。这一结果表明无线电频率1在rDNA沉默中起直接作用，这部分解除了端粒长度控制与rDNA沉默的耦合。Rif1p和Rif2p相互作用，并与Rap1p相互作用(83). 最近在一项单杂交试验中，它们也被证明与端粒DNA序列相互作用(7). 删除步枪2导致端粒比WT株的端粒长，并改善TPE，但对HMR公司消音(83). 自删除以来RIF2级对rDNA沉默也几乎没有影响，rif2Δ突变端粒可能含有正常数量的Sir2p，尽管它们更长。

除了导致rDNA沉默的丧失（本研究），无线电频率1突变缩短了酵母的寿命(4). 使用寿命短rif1Δ突变体被认为是由较长的端粒隔离Sir2p-Sir3p-Sir4p沉默复合物引起的(4). 然而，我们的数据表明无线电频率1突变对端粒长度无关的rDNA沉默有负面影响。介绍sir4延长寿命的突变(47)增加rDNA沉默(71)，转换为rif1Δ突变背景只能部分逆转短寿命表型(4). 因此，在这些双突变体中观察到的剩余短寿命效应也与Rif1p在rDNA沉默中的直接作用相一致。Rif1p在rDNA沉默中直接作用的最后一个证据是，在2杂交和生化分析中，Rif1p直接与Sir2p相互作用(第67页).

DNA复制和rDNA沉默。

DNA复制和沉默之间的联系并不是前所未有的。首先，在HM公司基因座需要通过S期进行(30,53). 第二，六亚单位起源识别复合物（ORC）需要在HML公司和HMR公司(29,52). ORC在沉默中的一个作用HM公司基因座似乎是通过与Sir1p的相互作用募集Sir沉默复合体(16,76). 然而，ORC也需要在端粒沉默SIR1公司-独立的方式(30). 有趣的是，一个ORC亚单位（Orc5p）在HMR-E公司沉默可以从基因上与其复制起始功能分离，这意味着沉默不需要复制起始(25). rDNA沉默与HM公司以及端粒沉默，因此目前尚不清楚ORC是否在rDNA沉默中起作用。

每个rDNA重复序列都包含一个DNA复制来源，位于NTS2中5S rRNA的上游(68). 因此，DNA复制可能在rDNA沉默中发挥作用。事实上，我们已经证明射频控制1(lrs1号机组)和cdc17(轻轨9)rDNA沉默减弱。这种效应的部分原因可能是端粒延长（见上文），但并非所有这种效应都可以用这个模型来解释。Lr的其余部分⁻表型可能由复制缺陷引起。与此假设一致，另一个lrs公司突变基因(lrs6号机组)遭受Tn三插入DNA聚合酶的非必需亚单位(DPB3型). 与cdc17和射频控制1突变体dpb3型突变体具有正常长度的端粒，这表明复制突变体可以独立于端粒长度控制影响rDNA沉默。

发现DNA聚合酶（Pol）亚单位轻轨系统这种筛选很有趣，因为DNA Polɛ不仅是染色体复制所必需的，而且也是碱基切除修复所必需的(80). RFC-1也参与基底切除修复。此外，Polɛ（Pol2）的大亚单位是S期复制和DNA损伤检查点所必需的(57).dpb3Δ菌株具有较高的自发突变率，这表明它与维持复制保真度有关(三). 总之，解释DNA复制基因在rDNA沉默中的作用的另一种模型可能是DNA修复机制的贡献。

组蛋白平衡作用。

核小体由核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的两个分子组成，它们与146 bp的DNA紧密结合。组蛋白H3和H4已被证明在HM公司和端粒位点(35). 此外，组蛋白H2A和H2B对rDNA沉默很重要。删除HTA1-HTB1型，产生H2A和H2B的两个基因对之一，导致rDNA沉默缺失(11)这表明核小体内的组蛋白化学计量可能是关键的。我们在HIR3型我们屏幕上的基因国税局10突变体。中的突变HIR1型,HIR2型，或HIR3型导致转录反馈机制的放松管制HTA1-HTB1型表达式(73). 爱尔兰人⁻表型国税局10(希尔3)因此，突变可能是由于H2A H2B表达水平增加所致。与此模型一致，端粒沉默在希尔1突变株(44).

Lrs系列⁻表型碳酸钙1,碳酸钙、和碳酸钙突变也可能是组蛋白化学计量学改变的结果。hCAF-I和yCAF-I（染色质组装复合物）将新合成的组蛋白H3和H4组装到新复制的DNA上(45,72). 这个CAC公司基因在酵母中不是必需的，但这些基因的突变削弱了所有沉默位点的沉默(28,45). 因此，CAF-I可能对组装沉默活性核小体结构很重要。事实上HM公司和端粒沉默缺陷计算机辅助计算突变体是由沉默的染色质状态维持不良引起的(27,54). 在缺乏CAF-I活性的情况下，另一种核小体组装活性可能会接管并沉积沉默无活性的核小体，这些核小体缺乏适当的组蛋白乙酰化模式或组装不当，无法有效沉默。另一个简单的假设计算机辅助计算rDNA沉默突变体是指构建沉默的活性染色质需要一定的最小核小体密度。这个计算机辅助计算即使组蛋白水平正常，突变体也可能无法以足够的密度沉积核小体以维持沉默。rDNA在沉默和活跃染色质状态之间的表观遗传转换尚未被证实，这表明Lrs⁻表型计算机辅助计算突变是由于rDNA染色质的直接结构缺陷造成的。事实上，rDNA染色质的结构在cac1Δ通过体内补骨脂素可及性试验测量的突变（图。​（图6），6)，符合消音维护缺陷。

我们感谢Michael Hampsey、Danny Reinberg、David Shore和Susan Gasser在出版前传达了结果，感谢Paul Kaufman、Jasper Rine和David Shoe的有益讨论，感谢Greg Cost和Nurjana Bachman对手稿的评论。我们还感谢福雷斯特·斯宾塞（Forrest Spencer）提供了一个配备照相功能的立体显微镜，弗吉尼亚·扎基安（Virginia Zakian）和洛伦·皮卢斯（Lorraine Pillus）获得了端粒探针质粒，迈克·斯奈德（Mike Snyder）和苏珊·迈克利斯（Susan Michaelis）获得了转座子插入库。

J.S.S.得到了美国白血病学会博士后奖学金和NIH博士后培训补助金的支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）向J.D.B.提供的CA16519和GM36481赠款的部分支持。