蛋白激酶C同工酶激活IκB激酶β

体外翻译和免疫沉淀。

对于体外翻译研究，ζPKC^CAT公司按照制造商方案（Promega）中的描述，在兔网织红细胞裂解物中单独或与Flag-IKKα、Flag-IKKβ或其各自的催化和调节域一起在体外翻译λ/λPKC、αPKC或Raf，并且Flag标记的蛋白质用单克隆M2抗Flag抗体（Kodak）免疫沉淀，如前所述(8). 样品在InstantImager（Packard）中进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和放射自显影。对于共免疫沉淀实验，用10μg表达质粒转染接种在直径为10cm的培养皿上的亚融合293细胞。转染后（36小时），细胞受到或没有受到每毫升20 ng TNF-α（Promega）或5μM佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）（Sigma）不同时间的刺激。在一些实验中，在刺激之前，用10 nM GF109203X（钙生物化学）培养细胞10分钟。然后收获细胞，并在缓冲液A（40mM Tris-HCl[pH 8.0]、500mM NaCl、0.1%Nonidet P-40、6mM EDTA、6mM EGTA、10mMβ-甘油磷酸、10mM NaF、10mM PNPP[对位-硝基苯磷酸]，300μM Na_三VO（旁白）₄，1 mM苯甲脒，2 M PMSF[苯甲基磺酰氟]，抑肽酶[10μg/ml]，亮氨酸肽[1μg/ml].胃蛋白酶抑制素[1μg/ml]，1 mM-二硫苏糖醇[DTT]）。用3μg针对Flag表位（Kodak）的M2单克隆抗体和10μl蛋白g-琼脂糖沉淀IKK蛋白，然后用针对HA标记的PKC或内源性PKC的多克隆抗血清进行免疫印迹（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。免疫复合物在高盐缓冲液（500 mM NaCl）中洗涤。用ECL试剂（Amersham）检测蛋白质。在另一组实验中，用多克隆抗MKP-1（MAP激酶磷酸酶1）抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）对如上所述制备的细胞提取物进行免疫沉淀，并用单克隆抗λ/l.PKC抗体（Transduction Laboratories）通过免疫印迹法对广泛洗涤的免疫复合物进行分析。使用多克隆抗IKKα抗体（H-744；Santa Cruz Biotechnology）检测内源性IKK。

IKK激酶分析。

在由20 mM HEPES（pH 7.7）、10 mMβ-甘油磷酸盐、2 mM MgCl组成的溶液中测定激酶活性₂，2 mM氯化锰₂，10 mM PNPP，300μM Na_三VO（旁白）₄1 mM二硫苏糖醇、10μM ATP、1 mM苯甲脒、2 M PMSF、抑肽酶（10μg/ml）、亮氨酸肽（1μg/ml-³²P] ATP在30°C下保持30分钟。IκB底物蛋白从大肠杆菌按照上述方法分离标记的IKK免疫复合物，并在测定激酶活性水平之前在激酶缓冲液中洗涤。通过添加5×SDS-PAGE样品缓冲液，停止激酶反应，进行SDS-PACE分析，并在InstantImager中进行可视化。在一些实验中，如前所述，未经处理或用FSBA[5′-（4-氟磺酰苯甲酰）腺嘌呤]灭活的Flag-IKK的免疫沉淀物(7)与αPKC重组制剂（根据制造商的说明，由磷脂酰丝氨酸和二酰甘油最大限度地激活）或ζPKC的永久活性突变体（均由Sf9昆虫细胞中的杆状病毒产生）一起孵育。重组杆状病毒αPKC是从Panvera中获得的。重组ζPKC^CAT公司使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（生命技术）制备。

非典型PKC和αPKC与体内IKK的相互作用。

为了确定IKK在体内是否与非典型PKC结合，293个细胞被转染了HA标记的λ/ⅠPKC、ζPKC或αPKC以及标记的IKKβ或IKKα。细胞裂解物用抗HA抗体免疫沉淀，免疫沉淀用SDS-PAGE溶解，并用抗Flag抗体免疫印迹分析。与Flag-IKKβ相对应的免疫反应带仅在转染HA-λ/∏PKC细胞的免疫沉淀物中检测到（图。​（图2A，2A、 左面板），HA-αPKC（图。​（图2A，2A、 右面板）或HA-ζPKC（图。​（图2B，2B、 左侧面板）。当用抗标记抗体免疫沉淀细胞裂解物并用抗HA抗体免疫印迹时，也获得了类似的数据（图。​（图2A，2A、 左右面板，以及图。​图2B，2B、 左侧面板）。此外，当研究λ/λPKC、ζPKC或αPKC与IKKα的相互作用时，也得到了类似的结果（图。​（图2B，2B、 右侧面板和图的两个面板。​图2C）。2C） ●●●●。与此形成鲜明对比的是，当使用HA-Raf和Flag-IKKβ或Flag-IKKα进行此实验时，未检测到相关性（数据未显示）。

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图2

λ/λPKC和αPKC与体内IKKβ相互作用。用10μg pCDNA3或表达载体转染100 mm直径平板中293个细胞的亚流入培养物，表达HA-λ/l.PKC（A，左面板；B，右面板）、HA-αPKC（A，右面板；C，左面板）、HA-ζPKC；C）和足够的空载体，以提供20μg的总DNA。用10μg Flag-IKKβ或Flag-IKKα加上10μg HA-λ/∏PKC、HA-αPKC或HA-ζPKC转染平行培养物。转染后（36 h），用抗Flag抗体或抗HA抗体免疫沉淀细胞提取物。在高盐缓冲液（500mM NaCl）中广泛洗涤免疫沉淀物，通过SDS-PAGE分级，并通过抗HA或抗Flag抗体（IP）的免疫印迹进行分析。将等分（用于免疫沉淀的提取物【Ext.】量的十分之一）装入平行凝胶中，并用相应抗体进行免疫印迹分析。在另外两个独立实验中获得了基本相同的结果。面板右侧的数字以千道尔顿表示分子质量标记的位置。WB、Western blot。

综合以上数据表明，非典型PKC以及αPKC在293细胞中体外表达时可以与IKK相互作用。

内源性λ/ιPKC与IKKs和信号体的TNF-α依赖性相互作用。

为了进一步分析这些相互作用，293个转染Flag-IKKβ或Flag-IKKα的细胞受到或没有受到TNF-α或PMA的刺激。用单克隆抗Flag抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，用SDS-PAGE对免疫沉淀进行解析，并用多克隆抗λ/ⅠPKC抗体进行分析。有趣的是，TNF-α的添加而非PMA的添加促进了内源性λ/1 PKC与IKKβ的相互作用（图。​（图3A）三A） 和IKKα（图。​（图3B）。三B） 。当用ζPKC多克隆抗体分析免疫沉淀物时，也获得了类似的结果，该抗体也与λ/I PKC交叉反应（数据未显示）。由于缺乏对ζPKC具有绝对特异性的可靠抗体，因此无法在IKK复合物中确定这种非典型PKC亚型。然而，图。​图11和​和2，2结合下面显示的功能数据，强烈表明天然ζPKC很可能与TNF-α活化细胞中的IKK相关，如λ/l.PKC。值得注意的是，αPKC是293个细胞中唯一可检测到的其他PKC同型(第14页). 当用αPKC抗体选择性免疫印迹法分析IKK免疫沉淀物时，在未刺激细胞或经PMA-或TNF-α处理的细胞中未观察到内源性αPKC与IKKα或IKKβ的关联（数据未显示）。

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图3

内源性λ/ⅦPKC与IKKβ和信号体的相互作用。（A和B）用每毫升20 ng TNF-α或PMA（5μM）刺激转染10μg Flag-IKKβ（A）或Flag-IKKα（B）的100-mm直径平板中293个细胞的亚流培养5分钟。然后，用单克隆抗Flag抗体免疫沉淀细胞提取物（200μg），用多克隆抗λ/ⅠPKC抗体进行免疫印迹（WB）分析免疫沉淀物。免疫沉淀物在平行凝胶中用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。提取物（Ext.）含有20μg细胞蛋白。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。（C） 用每毫升20 ng TNF-α或PMA（5μM）不同时间刺激直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物。随后，用多克隆抗MKP-1抗体对细胞提取物（200μg）进行免疫沉淀（IP），并用单克隆抗λ/l.PKC抗体对免疫沉淀进行免疫印迹（WB）分析。免疫沉淀在平行凝胶中用抗IKK抗体进行免疫印迹分析。提取物（Ext.）含有20μg细胞蛋白。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。

最近的证据表明，IKK是一种称为信号体的大复合体的一部分，可以用MKP-1抗体进行免疫沉淀(22). 因此，确定非典型PKC是否可以在细胞刺激后募集到信号体中是很有意义的。为了解决这种可能性，用PMA或TNF-α刺激293个细胞不同的时间，用多克隆抗MKP-1抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用单克隆抗λ/ⅦPKC抗体免疫印迹分析。图的上面板。​图3C三C表明，TNF-α而非PMA刺激可促进λ/ⅠPKC向信号体复合体的募集。抗IKK抗体分析表明，抗MKP-1免疫沉淀物中含有类似数量的IKK（图。​（图3C，三C、 下部面板）。然而，在这些实验中没有检测到αPKC与信号体复合体的关联（数据未显示）。该观察结果以及内源性αPKC与转染的IKKβ或IKKα没有任何关联表明，与非典型亚型相比，αPKC在体内并不与IKK稳定相关，除非在共转染实验中过度表达。

为了进一步建立生理条件下非典型PKC与IKK的相互作用，293个细胞要么未经处理，要么用TNF-α或PMA刺激5分钟，然后用抗IKKα抗体免疫沉淀天然IKK复合物，该抗体也与IKK-β交叉反应，λ/ιPKC抗体分析非典型PKCs的相关性。有趣的是，用TNF-α而不是用PMA治疗，可以激发天然λ/l.PKC与天然IKK的可重复相互作用（图。​（图4）。4). 当用ζPKC多克隆抗体分析免疫沉淀物时，也获得了类似的结果，该抗体也与λ/I PKC交叉反应（数据未显示）。同样，当用抗αPKC抗体分析免疫沉淀物时，未观察到该PKC与IKK复合物的关联（数据未显示）。

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图4

内源性λ/ⅦPKC与内源性IKK的相互作用。用每毫升20 ng TNF-α或PMA（5μM）刺激100-mm直径平板中293个细胞的亚流培养物5分钟。然后，用多克隆抗IKK抗体对细胞提取物（200μg）进行免疫沉淀（IP），并用单克隆抗-λ/∏PKC抗体对免疫沉淀进行免疫印迹（WB）分析。免疫沉淀在平行凝胶中用抗IKK抗体进行免疫印迹分析。提取物（Ext.）含有20μg细胞蛋白。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。

PKC在激活IKKβ和IKKα以应对TNF-α和PMA中的作用。

综上所述，PKC可能在体内参与IKK活性的调节。为了开始分析这种可能性，用标记的IKKβ转染293个细胞，转染后36小时，这些细胞要么未经处理，要么用TNF-α或PMA刺激。随后，用抗Flag抗体免疫沉淀细胞提取物，并检测IKKβ磷酸化包含IκBα前250个氨基酸的GST-IκB结构的能力(25)已确定。用TNF-α或PMA刺激细胞激活IKKβ磷酸化GST-IκB的能力（图。​（图5A）5A） 但不是Ser32和Ser36被Ala取代的突变体（数据未显示）。PMA效应很可能是由αPKC的激活引起的。与这一概念一致，与GF109203X孵育完全消除了PMA对IKKβ的激活，而不是TNF-α的激活（图。​（图5A）。5A） ●●●●。这强烈表明，αPKC通过PMA而不是TNF-α介导IKKβ的激活，这与先前的观察结果完全一致，表明PMA-敏感的PKC亚型不参与TNF-(6,10,11以及其中的参考文献）。为了确定非典型PKC是否参与TNF-α激活IKKβ，将Flag-IKKβ与野生型或显性阴性ζPKC的质粒对照或表达载体一起转染293细胞。转染后36小时，用TNF-α或PMA刺激细胞7分钟，并如上所述测定IKKβ的活性水平。有趣的是，图。​图5B5B表明野生型ζPKC的简单过度表达足以刺激IKKβ，并协同增加TNF-α对其的激活（图。​（图5B）。5B） ●●●●。

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图5

αPKC和ζPKC在PMA和TNF-α激活IKKβ中的作用。（A） 用Flag-IKKβ（10μg）转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，转染36 h后，细胞未经处理或在用TNF-α（20 ng/ml）或PMA（5μM）刺激前15 min用GF109203X（10 nM）孵育7 min。之后，Flag-IKKβ被免疫沉淀，并用重组GST-IκB作为底物测定其活性水平，如材料和方法所述。（B） 用Flag-IKKβ（10μg）和10μg空质粒或表达载体转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，以获得HA标记的野生型（ζPKC）^重量)或显性阴性（ζPKC^MUT公司)ζPKC。转染后36小时，细胞要么未经处理，要么用TNF-α（20 ng/ml）刺激7分钟。然后，对Flag-IKKβ进行免疫沉淀，并如上所述测定其活性水平。（C） 用Flag IKKβ（10μg）和10μg空质粒或HA标记的显性阴性ζPKC（ζPKC^MUT公司). 转染后36小时，细胞未经处理，或用TNF-α（20 ng/ml）或PMA（5μM）刺激7分钟。之后，对Flag-IKKβ进行免疫沉淀，并如上所述测定其活性水平。（D） 用Flag-IKKβ（10μg）和10μg空质粒或表达载体转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，以检测HA-标记的显性阴性（λ/∏PKC）^MUT公司)λ/ιPKC。转染后36小时，细胞要么未经处理，要么用TNF-α（20 ng/ml）刺激7分钟。然后，对Flag-IKKβ进行免疫沉淀，并如上所述测定其活性水平。（E） 用Flag-IKKα（10μg）转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，转染36 h后，细胞要么未经处理，要么用TNF-α（20 ng/ml）刺激7 min。然后，对Flag-IKKα进行免疫沉淀，并按上述方法测定其活性水平。使用相应的抗抗原抗体测定不同结构的表达水平。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。P、 磷酸化蛋白。

重要的是，ζPKC显性阴性突变体的表达严重损害了TNF-α对IKKβ的激活（图。​（图5B5B和C），而不是PMA（图。​（图5C）。5C） ●●●●。当细胞转染λ/∏PKC显性阴性突变体时，也获得了类似的结果（图。​（图5D）。5D） ●●●●。接下来，将Flag-IKKα与野生型或显性阴性ζPKC的质粒对照或表达载体一起转染293个细胞。转染后36小时，用TNF-α刺激细胞7分钟，并如上所述测定IKKα的活性水平。值得注意的是，图。​图5E5E表明野生型ζPKC的过度表达对IKKα活性或TNF-α的激活几乎没有影响。同样，ζPKC显性阴性突变体的表达不会显著影响TNF-α对IKKα的激活（图。​（图5E）。5E） ●●●●。总之，这些结果表明，非典型PKC与IKKβ的TNF-α激活密切相关，而与IKK-α激活无关，而αPKC与PMA激活IKKα有关。

重组ζPKC和αPKC体外刺激IKKβ。

为了进一步探索这些PKC同型对IKK的激活，我们进行了一项体外偶联试验，将来自未经处理细胞的免疫沉淀的IKKβ或IKKα与重组αPKC制剂或ζPKC永久活性突变体（两者均由昆虫细胞中的杆状病毒产生）进行体外培养。数字​图6A6A和B表明，在体外，催化活性重组ζPKC的存在显著激活了IKKβ，但不激活IKKα，其程度与TNF-α刺激细胞产生的程度相当。同样，最大激活的αPKC在体外能够激活IKKβ，但不能激活IKK-α（图。​（图6A）。6A） ●●●●。对照孵育表明，在缺乏IKKβ的情况下，不同PKC亚型无法自行磷酸化GST-IκB（数据未显示）。此外，图。​图6C6C证明重组活性ζPKC直接磷酸化免疫纯化的IKKβ。为了进一步确定ζPKC对IKKβ的直接磷酸化，用FSBA处理IKKα的免疫沉淀物，使其激酶活性以及任何假设的污染物相关激酶活性失活。随后，测定失活IKKβ的磷酸化水平。结果如图所示。​图6D6D证明了重组活性ζPKC磷酸化灭活的IKKβ的能力（左面板）。有趣的是，丝氨酸177和181突变为丙氨酸实质上通过重组ζPKC抑制了IKKβ磷酸化（图。​（图6D，6D、 右侧面板）。

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图6

重组活性ζPKC和αPKC在体外刺激IKKβ，但不刺激IKKα。（A） 在未经处理的293细胞中表达的Flag-IKKβ（左侧）或Flag-IKKα（右侧）免疫沉淀物与αPKC（由磷脂酰丝氨酸和二酰甘油最大程度激活）或ζPKC永久活性突变体（ζPKC-^DEL公司)，均由昆虫细胞中的杆状病毒产生。在存在GST-IκB的情况下，在30°C下反应30分钟，然后如上所述测定IκB磷酸化水平。作为阳性对照，包括来自TNF-α活化细胞（20 ng/ml；7 min）的两种IKK的活性。（B） 以髓磷脂碱性蛋白（MyBP）为对照，测定这些实验中使用的PKC重组制剂的活性水平。（C） 在未经处理的293细胞中表达的Flag-IKKβ免疫沉淀物在没有GST-IκB的情况下与重组ζPKC在30℃孵育30分钟，然后测定IKKβ的直接磷酸化水平。左边的数字表示以千道尔顿为单位的分子质量标记的位置。（D，左图）如材料和方法中所述，通过FSBA处理使0.5或2 mg蛋白质提取物中的野生型IKKβ免疫沉淀物失活。随后，如上文所述，将其与重组ζPKC孵育或不孵育，并测定激酶活性IKKβ的磷酸化水平。（D，右图）用FSBA处理1 mg蛋白质提取物，使野生型（WT）或活化环突变体（AA）IKKβ的免疫沉淀物失活，如上所述，然后用或不用重组ζPKC孵育它们，并测定激酶活性IKK？的磷酸化水平。每个实验中的反应混合物在平行凝胶中用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。在其他三个实验中获得了基本相同的结果。P、 磷酸化蛋白。

这项工作得到了CICYT的SAF96-0216拨款、DGICYT的PM96-0002-C02拨款、欧盟的BIO4-CT97-2071拨款以及Glaxo Wellcome西班牙的资金支持，并从拉蒙地区基金会向缅甸中央银行提供的机构拨款中受益。

我们感谢Esther Garcia、Carmen Ibañez和Beatriz Ranera提供的技术援助，也感谢Gonzalo Paris和Isabel Perez提供的帮助和热情。我们感谢Dave Goeddel对手稿的批判性阅读以及在此工作中的有益评论。