慢性淋巴细胞白血病从诊断到临床进展的免疫学和遗传动力学

摘要

背景

通过使用不同的预后参数，包括IGHV基因或其替代物（如ZAP-70表达）的突变状态，可以加快识别慢性淋巴细胞白血病（CLL）进展到晚期临床阶段需要治疗的高危患者[1,2]染色体畸变和基因突变（即。，TP53型或槽口1), [三,4]或CLL-IPI等预后评分[5]. 尽管在过去十年中，对该病生物学的理解取得了巨大进展，但导致早期临床进展的潜在机制尚未完全阐明。。在诊断时和治疗前进行的纵向遗传学研究表明，大约一半的患者出现了非复发性和有限的变化[6——15]. 一致的是，白血病细胞基因表达谱的变化在进展中也不常见[16]. 这些发现表明，CLL早期进展并非主要由遗传进化驱动，这突出了白血病微环境在疾病演变中的潜在作用。

除了在CLL患者中观察到的全身免疫功能障碍外[17]这些患者的循环T细胞表现出功能失调和抗原耗尽的细胞比例增加，其特征是抑制受体高表达，增殖和细胞毒活性受损，以及与白血病细胞的免疫突触有缺陷[18——22]所有这些都表明有缺陷的抗肿瘤T细胞反应。此外，髓源性抑制细胞（MDSC）的扩张也促进了CLL中普遍存在的免疫抑制微环境[23]CLL细胞产生IL-10[24]以及其他因素。

这些观察结果使我们假设，疾病诱导的T细胞衰竭从诊断中积累，可以转化为逃避免疫监视，从而使CLL从早期无症状阶段发展为临床进展。为了确定临床进展的机制，我们研究了进展患者与长期无症状患者之间发生的特定变化。详细地说，我们使用来自经历临床进展的未经治疗的CLL患者（诊断时和进展时采样）和来自病情稳定的患者（诊断时和长期无症状随访时采样）的配对原始样本进行了遗传和免疫学纵向分析。我们的结果表明，CLL细胞在进展中表现出有限的和非复发性的遗传变化，而CD8⁺T细胞表现出增加的衰竭特征，这可能是由恶性B细胞分泌的IL-10和进展中的差异转录组诱导的。相反，没有进展证据的患者CD8随着时间的推移没有显著变化⁺与进展期患者的恶性细胞相比，T细胞耗竭状态和恶性细胞诱导T细胞耗竭和分泌IL-10的能力较低，并随着时间的推移而保持。。这些结果有助于为免疫系统早期治疗干预的临床试验奠定基础，以预防或延缓疾病的进展。

方法

结果

CLL细胞在临床进展中表现出有限的非复发性遗传变化

在25名经历临床进展的患者（中位年龄：63岁，范围40-82岁）中（中位进展时间（TTP）：29个月，范围5-96个月），我们收集了诊断时和治疗前进展时的系列配对样本。根据国际CLL（IWCLL）标准研讨会确定了进展定义和治疗要求[28]. 作为对照组，我们在诊断和随访时收集了13名病情稳定的患者的系列样本（中位年龄：66岁，范围47-81岁；第二次抽样的中位时间：39个月，范围为30-77个月）。该组的中位随访时间为77个月（范围41-101个月），只有一名患者（CLL46）病情进展（第二次采样后19个月）。表中总结了临床特征1详见补充表S2系列。

表1

进展期和非进展期患者的临床特征

	进展顺利		非营利组织
性别	M（68%）		M（69%）
诊断时的BINET/RAI阶段	A0（72%）		A0（92%）
IGHV状态	UM（56%）		UM（8%）
	中值的	范围	中值的	范围
诊断时的年龄	63	40–82	66	47–81
TTP（月）	29	5–96	——	——
随访无进展（月）	——	——	77	41–101
二次采样时间（月）	29	5–96	39	30–77
淋巴细胞·109/L诊断时	12.20	3.3-65.8	10.40	3.8-31.2
淋巴细胞·109/第二次取样时为L	73.05	2.3-287.1	22.40	5.2-85.3

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为了分析与临床进展相关的潜在遗传进化，我们在诊断和进展时对12名患者的配对样本进行了纵向WES。平均读取深度为110X，检测限设置为20次读取的最小覆盖率和0.1个变异等位基因频率（VAF）。根据先前在CLL中进行的WES研究，两个时间点的突变率都很低，由12.2±3.3（范围6-17）的平均值±SEM（平均值的标准误差）的体细胞单核苷酸变异（SNV）和每个外显子组的插入和缺失（indel）组成。（补充表第3页). 然后，我们通过计算每个患者检测到的改变的CCF的显著变化，筛选从诊断到进展的克隆转移[29]（请参见补充方法有关共因失效计算的详细信息）。如果诊断和进展样本中CCF的95%置信区间没有重叠，则确定有显著变化[29]. 我们发现，50%的患者在进展中表现出显著变化，至少影响一种变化的CCF。然而，其余50%的患者在临床进展中表现出克隆稳定性（图1a和b）。诊断时，CLL驱动基因突变[29,30]在12名患者中有9名患者（75%）被发现（每个患者1.4±1.2名驾驶员的平均±SEM）（图。​（图1a）。1a） ●●●●。在这些患者中，只有一名患者（CLL51）在进展中表现出驾驶员共因失效的大小增加：NFKBIE公司和自动取款机基因在进化过程中上升（图。​（图1b，1b、 粗体红色）。同样在该患者中，来自相同基因的另外两个变体在时间点之间固定了CCF（图。​（图1b，1b、 黑体）。此外，在那些没有改变驱动基因的患者中，有一名患者（CLL31）在进展中发生了影响基因的突变TENM1公司（CCF=0.31）（图。​（图1b），1b） ，以前未与CLL关联。

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图1

诊断时SNV和配对B-CLL细胞indels的CCF纵向分析以及治疗前的进展。一从诊断到进展期间CCF显著升高（红色）、降低（蓝色）或稳定（灰色）的SNV和indels的百分比。CLL驱动基因突变的患者标有星号。每个患者检测到的SNV和indels的绝对数量以斜体字显示在条形图中。b条每名患者检测到的每种变化的CCF与95%置信区间的比较(n个 = 12） 在诊断和进展之间。显示显著增加（红线）、减少（蓝线）或稳定共因失效（灰线）。CLL驱动基因用粗体线绘制，并用基因名称标记

我们还分析了9个CLL驱动基因的突变状态(TP53、BIRC3、ATM、NOTCH1、SF3B1、XPO1、MYD88、FBXW7和POT1（POT1）)通过对同一患者进行有针对性的下一代测序。在平均读取深度为2000X的情况下，检测极限设置为100次读取的最小覆盖范围和0.05 VAF的最小覆盖范围。尽管进行了深度测序，但随着时间的推移，未观察到影响这些驱动因素的其他变化（补充表S4系列).

关于通过WES检测到的CNV变化，在诊断时，12名患者中有10名（83%）检测到CNV，每名患者的平均±SEM为4.0±4.1（范围1-12）CNV（补充表第5章和补充图S1). 12名患者中有7名（58%）患有与CLL相关的复发性CNVs，包括del（13q）、tri（12）、del（11q）和del（17p）（3），但随着时间的推移，所有患者都保持稳定。尽管如此，我们确实观察到在同一患者的进展中，在驱动基因（CLL51）中显示CCF增加的情况下，获得了del（8p）和del（15p），CCF分别为72%和44%。

对于无临床进展的患者，我们分析了诊断和无症状随访时配对B-CLL细胞中CLL驱动基因的面板(n个 = 9名患者）。我们在9例（44%）无进展患者中发现了4例（诊断时）的突变。其中一个（CLL23）显示其中一个增加了VAF自动取款机变体,另一个（CLL47）在一个突变中显示VAF降低，影响FBXW7型第二次取样时（补充表S4系列).

总的来说，这些结果表明，遗传改变的获得或扩展与自然发生的临床进展无关，正如其他人之前报道的那样[6——12,14,15].

效应器存储器CD8⁺共表达抑制性受体的T细胞在CLL进展时积累，而在病情稳定的患者中，随着时间的推移，它们保持稳定

先前对诊断为慢性淋巴细胞白血病的患者的研究表明，有缺陷的循环CD8增加⁺与年龄匹配的健康献血者相比，T细胞表现出终末分化表型[18——21,31,32]. 然而，这些CD8⁺使用纵向样本的T细胞从诊断到临床进展的潜在进化尚未被研究。为了研究这一点，我们分析了来自我们两个队列的配对PBMC样本中T细胞的免疫表型：19名患者在诊断时和治疗前进展时进行了分析，10名患者在确诊时进行分析，第二个时间点在无进展的随访中进行了分析（从这里称为“无进展”）首先，第二次采样时的CD4/CD8比率仅在病情进展的患者中随时间显著降低，其中效应记忆CD8⁺T细胞（T_{相对长度单位}：CCR7⁻CD45RA⁻)是进展中唯一扩增的T细胞亚群，而CD8无明显变化⁺在非进展患者中观察到T细胞成熟亚群（补充图S2a和b）。

PD1在慢性刺激的CD8中表达⁺T细胞并在T细胞耗竭中起相关作用[33,34]. 它也被描述为优先在效应器存储器CD8中表达⁺与健康献血者相比，CLL中增加的T细胞[18,21]. 在这里，我们观察到PD1表达的CD8的积累⁺T细胞（补充图。S2系列c） PD1的富集⁺T型_{相对长度单位}和PD1⁺T型_EMRA公司CD8（CD8）⁺子集。耗尽CD8的增加⁺在非进展期未观察到T细胞（图2a至c）。进一步研究CD8中T细胞耗竭和效应器功能受损的其他特征⁺T细胞在CLL进展时也增强，我们测量了PD1与其他抑制性受体，即CD244和CD160的共同表达[33,35]. 根据我们之前的发现，我们观察到CD8⁺与CD244或CD160共同表达PD1的T细胞仅在进展时显著升高，尽管CD8的折叠变化增加⁺表达PD1的T细胞⁺CD160型⁺与在非进展患者中观察到的结果相比没有显著性差异（补充图。S2系列d至f）。此外，扩展的T_{相对长度单位}CD8（CD8）⁺进展期患者的亚群在进展时表现为严重疲劳，表现为PD1与CD244或CD160的高共表达（图。​（图2d2d和e）。总之，我们观察到抗原体验效应器记忆CD8从诊断到进展的纵向增加⁺T细胞亚群以及抑制性受体的共同表达增加。相反，随着时间的推移，在没有进展的患者中没有观察到明显的变化。

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图2

第1页⁺效应器存储器CD8⁺进展性和非进展性CLL患者的T细胞亚群和抑制性受体的共同表达。一PD1的绝对数⁺EM和b条第1页⁺EMRA CD8⁺进行中的T细胞（左，n个 = 18） 和非进展患者（中、，n个 = 10） 在诊断和进展或非进展时。PD1时间点之间的折叠变化⁺EM和PD1⁺EMRA CD8⁺进展期和非进展期患者的细胞（右）。c（c）T细胞分化亚群的代表性viSNE图（初始：CCR7⁺CD45RA⁺; 中央存储器，CM:CCR7⁺CD45RA⁻; 效应器存储器EM:CCR7⁻CD45RA⁻和EM CD45RA⁺，EMRA:CCR7⁻CD45RA⁺)CD4中PD1的表达⁺和CD8⁺每组一名代表性患者在两个时间点的T细胞。d日EM CD8的百分比⁺共表达CD244和PD1的细胞(n个 = 12） 以及e（电子）CD160和PD1(n个 = 10). 图表显示平均值±SEM或成对值。(*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; Wilcoxon配对检验或Mann-Whitney检验）

最终耗尽的CD8⁺T细胞（T-bet^暗淡/−脱中胚蛋白^你好PD1（PD1）^你好)CLL进展时积累

T-bet和Eomes是调节CD8分化过程的两种T-box转录因子⁺抗原接触后的T细胞协同维持长期免疫[36]. 一些研究指出，它们在CD8中都有作用⁺T细胞衰竭。T-bet抑制PD1表达和其他抑制受体[37]相反，Eomes与多种抑制性受体的高表达有关，包括PD1[38,39]. 因此，这两种转录因子的差异表达结合中度或高PD1水平定义了两种明显耗竭的CD8⁺T细胞亚群：祖细胞（T-bet^你好脱中胚蛋白^暗淡/−PD1（PD1）^中间)和终末后代（T-bet^暗淡/−脱中胚蛋白^你好PD1（PD1）^你好) [38]（补充图。第3页). 此外，CD8中Eomes的高表达⁺与HD相比，在诊断为CLL的患者中观察到T细胞，其功能对于CLL小鼠模型中T细胞的适当扩增至关重要[40]. 因为我们观察到CD8⁺CLL患者的T细胞在进展中表现出更严重的衰竭程度，我们假设终末子代也会在进展中增加。事实上，我们发现CD8⁺在进展型和非进展型中，祖细胞亚群随时间保持稳定（图三a和c），而最终耗尽的CD8⁺亚群（T淋巴细胞^暗淡/−脱中胚蛋白^你好PD1（PD1）^你好)仅在进展期患者中显著增加（图。​（图3b三b和c）。这些发现证实CD8⁺进展中的T细胞表现出严重的终末衰竭状态，可能损害其控制恶性细胞生长的能力。

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图3

先祖（T-bet^你好脱中胚蛋白^暗淡/−PD1（PD1）^中间)最终（T-bet^暗淡/−脱中胚蛋白^你好第1页^你好)耗尽的CD8⁺进展性和非进展性CLL患者的T细胞。一T-bet的百分比^你好脱中胚蛋白^暗淡/−PD1中的^中间CD8（CD8）⁺T细胞和b条T型赌注^暗淡/−脱中胚蛋白^你好PD1中的^你好CD8（CD8）⁺进展期（左侧，n=12）和非进展期患者（中间，n个 = 9） 在诊断和进展或非进展时。比较进展期和非进展期患者两个亚组的时间点之间的折叠变化（右）。c（c）CD4中PD1、T-bet和Eomes表达的代表性viSNE图⁺和CD8⁺每组一名代表性患者在两个时间点的T细胞。图表显示平均值±SEM或成对值。(*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; Wilcoxon配对检验或Mann-Whitney检验）

T细胞在CLL进展中获得不同的转录谱

为了大致描述与临床进展相关的CLL患者T细胞随时间发生的变化，我们对分离的T细胞进行了配对RNA-Seq分析（平均纯度为92%）：在诊断和进展时分析了13例患者，在诊断和随访时分析了6例患者（无进展）。在选择唯一映射读取后，对进展患者配对样本的无监督分层聚类分析定义了两个主要簇：一个簇专门对应于进展中的T细胞，另一个簇包括诊断时的T细胞加上两个进展中的样本，强调T细胞在进展中的转录谱与诊断时的T细胞转录谱明显不同（图4). 从诊断到进展，共有80个基因（包括蛋白质编码和lncRNA转录物）在T细胞中显著上调或下调，而相比之下，在监督分析后随访时，只有3个基因在未进展患者的T细胞中差异表达（所有基因padj<0.05详见补充表S6系列). 此外，在非进展患者中发现的3个差异表达基因也在进展中发现。简言之，T细胞在进展中的转录谱表明迁移和分化能力较低，线粒体氧化磷酸化受损（补充表第7部分)，维持T细胞效应器功能的基本过程[41]. 此外，与脂肪酸和氨基酸分解代谢和葡萄糖转运蛋白相关的基因上调，而与细胞成分合成和RNA加工机制相关的基因表达降低，表明T细胞代谢可能失调。进展中的T细胞也显示与免疫反应和衰竭相关的基因上调[42——44]. 总的来说，这些结果表明细胞骨架形成受损、线粒体代谢和免疫失调，与T细胞的衰竭和功能失调状态一致，这种状态在CLL进展时会加剧。

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图4

进展性CLL患者T细胞的RNA-Seq。热图显示诊断和进展时来自配对分类T细胞的前50个差异表达基因的无监督分层聚类(n个 = 13)

临床进展患者的CLL细胞诱导CD8中PD1表达的能力增强⁺T细胞通过可溶性因子包括IL-10

与没有进展的患者相比，观察到进展时的耗竭增加可能主要是由于肿瘤负荷增加，与恶性细胞的相互作用可能增加；或者，进展中的恶性细胞本质上更能诱导T细胞衰竭。为了深入了解可能触发CD8耗竭增加的功能机制⁺T细胞，我们比较了临床进展期患者获得的恶性B-CLL细胞与稳定期（非进展期）患者随访时获得的恶性细胞对T细胞的影响。为此，我们首先将来自慢性淋巴细胞白血病（T-CLL）患者的T细胞与不断增加的健康B细胞（B-HD）或来自进展期患者或随访期患者（非进展期）的自体B-CLL细胞共同培养。共培养7天后，我们发现CD8中PD1表达增加⁺在任何白血病细胞与T细胞比率下，有进展的B-CLL细胞的T细胞，而B-HD细胞并没有诱导PD1表达的变化（图5a） ●●●●。此外，来自未进展患者的B-CLL细胞只能诱导自体CD8中PD1的表达⁺检测到的最高B细胞与T细胞比率的T细胞表明，需要治疗的患者的恶性B细胞具有内在特征，这可能有助于观察到的T细胞衰竭。当观察PD1和CD244的共同表达时，获得了相同的结果（补充图。S4系列a） ●●●●。因此，为了进一步比较进展期患者和非进展期患者的恶性细胞诱导恶性B细胞耗竭的能力，我们将健康供体（T-HD）的T细胞与这两种类型的恶性细胞共同培养。在这种情况下，只有进展中的B-CLL细胞能够诱导CD8中PD1的表达⁺T细胞而非进展的B-CLL细胞则没有（图。​（图5c），5c） 而在诱导PD1和CD244共同表达方面没有差异。因此，尽管我们不能完全排除进展时观察到的耗竭增强仅仅是由肿瘤负荷增加引起的，但这些结果表明，进展中的恶性细胞本质上更能诱导自体或HD衍生T细胞中PD-1的表达。

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图5

CD8中PD1的表达⁺与B-HD细胞或B-CLL细胞共培养后的T细胞以及可溶性因子对PD1表达的贡献。一PD1的百分比⁺CD8（CD8）⁺进展中的CLL患者经抗CD3和抗CD28刺激7天（灰点）后的T细胞，以及进展时存在的B-HD细胞（黄点）或B-CLL细胞（红点），以指示的T:B比率（n=10）。b条PD1的百分比⁺CD8（CD8）⁺非进展性CLL患者经抗CD3和抗CD28刺激7天（灰点）后的T细胞，以及在无症状随访（蓝点）中出现的B-HD细胞（黄点）或B-CLL细胞（指示的T:B比率）(n个 = 7).c（c）PD1的百分比⁺CD8（CD8）⁺年龄匹配的健康供体（T-HD）的T细胞经抗CD3和抗CD28刺激7天（灰点），并且在进展期有B-CLL细胞（粗体红点）或在无症状随访期有B-CLL细胞（粗体蓝点），以指定的T:B比率(n个 = 6).d日PD1的百分比⁺CD8（CD8）⁺来自CLL患者的T细胞，在用抗CD3和抗CD28刺激7天后，并与B-CLL细胞接触或通过transwell插入物以1:10的T∶B比例分离(n个 = 14).e（电子）进展期血浆中IL-10的浓度（pg/ml）（左，n个 = 19） 和非进展患者（中间，n=10）。进展期和非进展期患者血浆中IL-10在不同时间点之间的增量（右）。（f）IL-10百分比⁺进展期（左侧，n=7）和非进展期患者（中间，n个 = 5） 在配对PBMC与骨髓基质UE6E7T-2细胞、CD40L和TLR9L共培养48小时后的两个时间点，IL-10增加⁺进展期患者和非进展期患者之间的CLL细胞（右）。克PD1百分比⁺CD8（CD8）⁺CLL中的T细胞与进展中的B-CLL细胞以1:10的T:B比共同培养7天后，按照之前描述的方案，并在添加抗人IL-10中和抗体后(n个 = 11） 。图表显示平均值±SEM或成对值(*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 0.0001; Wilcoxon配对检验或Mann-Whitney检验）

为了研究CLL细胞诱导的T细胞状态是通过细胞对细胞介导的机制还是由可溶性因子介导的，采用转染孔进行了T-CLL和B-CLL共培养。我们观察到CD8中PD1和CD244的诱导⁺当自体T细胞和白血病细胞之间没有接触时，T细胞是等效的（图。​（图5d5d和补充图。S4系列c、 提示可溶性因子的分泌导致耗竭标记物的上调。在这方面，已知CLL细胞具有调节性B细胞的特征，例如IL-10的产生[24]已经发现在CLL中具有免疫抑制功能[45,46]，与总体生存期缩短有关[47]并与实体瘤中肿瘤浸润淋巴细胞PD1的表达相关[48]. 基于此，我们最初测量了CLL患者配对血浆样本中IL-10的水平，发现血浆IL-10在进展中显著增加，而在非进展患者中随着时间的推移保持稳定（图。​（图5e）。5e） ●●●●。接下来，为了研究恶性细胞在进展中是否获得了增加的产生IL-10的能力，因此，较高的血浆水平不仅仅反映了进展中较高的肿瘤负荷，我们评估了微环境刺激后体外CLL细胞产生IL-10[27]. 我们检测到IL-10的百分比增加⁺仅在进展期获得的恶性细胞中有CLL细胞（图。​（图5f5f和补充图。S4系列d） 表明临床进展期患者的白血病细胞确实增加了创造免疫抑制微环境的潜力。此外，体外诱导CD8中PD1表达⁺IL-10中和后，T细胞被部分阻断（图。​（图5g）。5g） ●●●●。最后，我们分析了MDSC作为血浆IL-10额外来源的潜在积累，并观察到[49]这些免疫抑制细胞随着时间的推移在所有CLL患者中的积累，无论其临床进展如何，尽管进展期患者的增加程度更高（补充图。S4系列e） ●●●●。这些观察结果表明，在进展时，不仅白血病细胞的负荷增加，而且这些细胞还具有更高的IL-10能力，这有助于CD8的诱导增加⁺T细胞衰竭。

讨论

导致CLL患者从早期无症状阶段临床进展的生物学过程尚不清楚，因此，该疾病自然病史背后的发病机制尚不清楚。在这方面，从诊断到临床进展的纵向研究对阐明这些机制至关重要。据我们所知，这是第一次对CLL疾病进展的遗传和免疫过程进行全面的纵向分析。本文提出的纵向分子研究显示，CLL细胞在进展过程中发生了有限的非复发性分子变化，这表明遗传克隆进化并不像之前在其他系列中观察到的那样，是临床进展的主要驱动因素[6——15]. 相反，针对免疫微环境潜在变化的纵向研究尚未开展。我们对免疫动力学的分析发现CD8功能越来越不正常⁺进展期患者的T细胞室，在那些仍无症状的患者中未观察到。此外，我们发现CLL细胞产生的IL-10等可溶性因子在CD8中起作用⁺T细胞耗竭与疾病进展。

通过主要影响T细胞的多种因素，可以证明CLL的抗肿瘤免疫反应发生了改变[18——21,31,32]. 最近使用Eμ-TCL1小鼠模型的研究表明，CD8⁺T细胞可以在抑制性受体表达逐渐增加的同时延缓CLL的进展[50]. 此外，尽管只研究了3例，但在自发回归CLL的CD8中PD1的表达⁺当恶性细胞减少时，T细胞也减少[51]. 因此，我们对CLL患者的纵向免疫分析表明，效应记忆CD8⁺表达PD1的T细胞亚群在临床进展中特异性积累。此外，EM CD8⁺T细胞与CD244和CD160共同表达PD1并最终耗尽（T-bet^暗淡/−脱中胚蛋白^你好PD1（PD1）^你好)CD8（CD8）⁺T细胞在进展中显著增加，表明CD8严重功能障碍⁺T细胞随时间变化。重要的是，在非进展患者中未观察到这些变化，支持免疫功能障碍在CLL进展中的主要作用。

对转录组变化的广泛分析还显示，与诊断相比，进展期T细胞的表达谱存在显著差异，而在非进展期患者中，随着时间的推移，仅发现轻微差异。尽管我们获得的低质量RNA阻碍了更广泛的分析，但当仅使用唯一映射读取以避免因低输入而产生的潜在伪影时，我们能够识别与临床进展特别相关的转录组中的变化。

在这项研究中，我们还发现，进展时获得的CLL细胞增强了诱导自体和HD衍生CD8衰竭的能力⁺与来自稳定疾病患者的恶性CLL细胞相比，T细胞在微环境刺激下分泌IL-10的能力增加。此外，我们发现PD1的上调主要依赖于可溶性因子。因此，虽然累积了耗尽的CD8⁺进展中患者的T细胞可能仅仅是大多数患者肿瘤负荷增加的结果，这是进展的特征（见补充表S2系列对于临床数据），我们的数据显示，体外诱导T细胞耗竭和产生IL-10的能力增强，这与恶性细胞在疾病过程中积累也会获得更高的免疫抑制特性的情况相一致，只有在最终会进展的患者中。然后，这些细胞将促进参与阳性反馈系统，进一步增加CD8⁺T细胞耗竭，最终促进临床进展。在这方面，Gonnord等人最近描述了CD8⁺分析后6个月内需要治疗的未治疗CLL患者的T细胞显示出一个独特的特征，这与CD8的时间无关⁺T细胞已暴露于CLL细胞[52]这再次表明，T细胞的耗竭不仅仅是在时间上或肿瘤负荷上与恶性细胞接触增加的产物。进一步的研究试图明确地找出CLL中免疫系统和恶性细胞共同进化背后的机制，这绝对值得进行。

我们的结果提供了临床前证据，以支持旨在改善抗肿瘤T细胞反应的临床研究的设计。这在使用来自晚期患者的自体嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗的情况下可能特别有利，这些细胞显示出低细胞毒活性，并实现低应答率[53]. 值得注意的是，伊布替尼治疗的免疫调节作用能够恢复T细胞功能，并随后提高对CAR-T细胞治疗的反应率[54,55]. 此外，这些结果为在疾病早期进行免疫治疗的临床测试奠定了基础，以防止或延缓临床进展。此外，未来可以利用免疫抑制增强的迹象来提高对可能进展的患者的早期检测。

结论

总的来说，我们的研究结果表明，在临床进展阶段，CLL细胞在诊断时表现出有限的遗传变化，而CD8⁺恶性B细胞分泌的IL-10可诱导T细胞过度耗竭。相比之下，随着时间的推移保持稳定的患者的基因或T细胞区室没有发生显著变化。此外，临床进展期患者的恶性细胞表现出更强的诱导CD8衰竭相关特征的能力⁺T细胞体外培养。

这些结果为探索早期免疫治疗干预措施以避免或延缓疾病的临床进展提供了证据。此外，在更大的患者队列中进一步分析免疫学和恶性B-CLL细胞内在因素将有助于我们更好地识别那些在诊断后不久更有可能进展的患者。

补充信息

致谢

缩写

基金

这项工作得到了卫生研究基金会卡洛斯三世研究所（PI17/00950，M.C.，PI18/01392，P.A.和PI17/0943，F.B.）的支持，并得到了欧洲区域发展基金（ERDF）和埃斯帕尼奥拉·康特拉癌症基金会（M.C.和P.A.）、吉利德奖学金（GLD16/00144，GLD18/00047，F.B和Fundacióla Maratóde TV3（201905–30-31 F.B）。S.B.获得了Fundación Alfonso Martin Escudero的博士后奖学金。R.V-M.由西班牙科学与创新部托雷斯·奎维多奖学金（PTQ-16-08623）资助。A.E-C.由ISCIII/MINECO（PT17/0009/0019）资助，后者由FEDER共同资助。M.C.持有Innovación y Universidades Ciencia部长的合同（RYC-2012-2018）。

数据和材料的可用性

有关原始数据，请联系相应作者。本研究期间产生的WES和RNA-Seq数据存放在EGA和GEO，登记号为EGAS00001004116和｛“type”：“entrez geo”，“attrs”：｛“text”：“GSE141787”，“term_id”：“141787”｝GSE141787分别是。

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