甲基化赖氨酸特异性抗体识别抗原的结构基础

甲基化Fab克隆的结合特异性与非甲基肽

为了评估抗甲基化的特异性，我们将每个抗体制备成Fab结构体，它由抗体中的抗原结合域组成(15)，作为一种纯化的重组蛋白，利用表面等离子体共振（SPR）测定了未结合的三甲基肽和非甲基肽的结合亲和力和动力学参数(图2A类和图S2). 这个K（K）_D类所有Fab的甲基化和非甲基化肽的值绘制在图2B类，结合亲和力和相互作用的动力学参数总结如下表S2.

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图2

Fab肽结合的表面等离子体共振（SPR）分析。A类，每个克隆对甲基化和非甲基化肽的SPR响应曲线。B类，Fab亲和力图。垂直轴和水平轴分别表示每个Fab克隆对甲基化和非甲基化肽的亲和力。与对角线垂直距离最远的克隆具有最高的肽特异性。C类，通过对Fab克隆与含有K5三甲基化的组蛋白H4肽之间相互作用的SPR分析得出的亲和力曲线。C9和D6表现出可检测的结合亲和力。

结果表明，F9、C9、E6和D6优先结合甲基化肽，这与Fab ELISA一致。这些克隆的亲和力为3.0×10²甲基化肽分别为14、0.90和54 nM。非甲基肽的亲和力在毫摩尔至0.3-μM范围内。令人惊讶的是，E10与40μM的两种肽都表现出类似的弱结合K（K）_D类亲和力，与ELISA相反。有趣的是，E7在SPR中没有表现出任何显著的结合反应，尽管ELISA显示出与甲基化肽的强结合活性。这可能是两种分析中不同肽呈现的结果；ELISA使用固定化的、BSA缀合的肽抗原，SPR使用可溶性游离肽抗原（具有固定化的Fab）。为了验证这一假设，我们制备了与另一种载体蛋白人血清白蛋白偶联的甲基化肽，并进行了ELISA分析。结果表明E7与共轭肽结合(图S3)支持上述假设，即E7不仅识别肽序列，还识别与载体蛋白结合诱导的局部结构。

此外，由于MAP3K2 Lys260也可以是单甲基和双甲基的(16)，我们使用单甲基和双甲基肽进行SPR分析，以评估每个抗体对肽甲基化状态的特异性。结果表明，亲和力随着甲基化程度的增加而增加，尽管这种依赖性在抗体之间并不相同(表S3). 这些结果表明，尽管抗体也能识别单甲基和双甲基抗原，但它们对甲基化程度有一定的特异性（尤其是对C9和D6）。

为了评估对甲基化肽具有高亲和力的Fab的序列特异性，使用含有K5三甲基化的组蛋白H4肽通过SPR测试了F9、C9、E6和D6，该组蛋白H5肽具有围绕MAP3K2（GK（me3）GG）甲基化位点的三个共有氨基酸序列。虽然C9和D6与H4肽有可检测的结合，但亲和力明显低于与目标肽的亲和力(图2C类). 此外，C9和D6与组蛋白H3中含有三甲基化K27的肽基本上没有亲和力（大约毫摩尔水平），三甲基化赖氨酸周围有不同的氨基酸序列(图S4).

这些结果表明，这些Fab不仅具有甲基化赖氨酸特异性，而且具有甲基位点特异性，因为它们在MAP3K2周围氨基酸的背景下对甲基化赖胺酸具有很强的特异性。

在全长蛋白质的背景下识别抗原

接下来，我们试图测试这些Fab是否在其他细胞蛋白的背景下识别甲基化蛋白抗原。我们将克隆转换为兔IgG格式进行Western blot分析。将MAP3K2表达载体与模拟表达载体或SMYD3表达载体一起转染HEK293细胞，因为SMYD4上调了MAP3K3的Lys260甲基化(13,14). MAP3K2和SMYD3的表达分别通过HA或FLAG标签的分析得到确认(图3A类). 然后用Western blot检测每个IgG克隆(图3B类). F9染色出现两条非靶区带，均不符合MAP3K2的预期大小，其强度不依赖于SMYD3的表达。这一结果表明F9似乎不能识别蛋白质抗原。相反，用C9和D6以SMYD3表达依赖的方式染色，可以清楚地显示对应于MAP3K2的带。虽然一些条带可能来自其他三甲基化蛋白，这些蛋白在甲基化赖氨酸周围具有类似的氨基酸，但也以SMYD3表达依赖性的方式观察到，来自MAP3K2的条带占主导地位，保证了抗体的特异性。此外，为了验证这些抗体确实识别甲基化Lys260，测试了使用MAP3K2 K260A突变体的检测。C9和D6的突变显著降低了相应的带(图3C类)证明这些抗体特异性地识别甲基化Lys260残基。有趣的是，尽管Fabs对甲基化肽的亲和力最高，但E6染色仅显示出一条微弱的带。这些结果表明，在其他应用中，如Western blotting，仅抗原亲和力不能预测抗体行为，尤其是当应用涉及全长蛋白抗原时。

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图3

蛋白质印迹分析。A类，确认MAP3K2和SMYD2的表达。将HA-标记的MAP3K2和FLAG-标记的SMYD3或模拟表达载体共转染HEK293细胞的细胞裂解物用SDS-PAGE分离，印迹到膜上，并用抗HA、抗FLAG标记或抗β-肌动蛋白抗体染色。B类，使用每个IgG进行western blotting。用每种IgG对膜进行染色，然后用HRP缀合的抗兔IgG抗体孵育。F9和E6缺乏与蛋白抗原结合产生的清晰带信号，而C9和D6只有在SMYD3存在时才表现出强结合。C类，使用MAP3K2 K260A突变体进行western blotting。突变显著减少了相应的条带。

Fab肽复合物的结构分析

为了进一步了解抗体如何识别抗原，我们测定了每个Fab甲基化肽复合物的晶体结构。省略多肽的电子密度图表明，这些多肽与晶体中的抗体结合的可信度很高(图S5). 抗体F9和E6主要通过其重链与肽结合，甲基化赖氨酸指向轻链(图4A类). 由于F9和E6的重链CDR在CDR H1和H2中仅存在一个氨基酸的差异，因此可以预期这些类似的结合模式(图1E类). 另一方面，甲基化的赖氨酸残基被深埋在C9和D6的重链和轻链之间的界面上，两者都能在Western blotting中识别蛋白质抗原。事实上，每个复合物中甲基化赖氨酸残基侧链的计算可及表面积（F9，45.3²; C9，3.8欧²; E6，34.0奥²; 和D6，0.0º²)清楚地表明甲基化赖氨酸残基几乎完全穿透C9和D6的链间间隙。

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图4

Fab肽复合物的晶体结构。A类，显示了每个Fab的肽结合区域的概述。重链和轻链都有颜色绿色和青色分别为；C9结构与其他Fab的方向不同。强调了肽中的甲基化赖氨酸残基红色F9和E6显示了一种结合模式，其中甲基化赖氨酸指向轻链，而甲基化赖胺酸则深埋在C9和D6的链间界面。B类，显示了聚焦于甲基化赖氨酸残基和周围芳香笼的放大视图。甲基化赖氨酸残基(红色)被芳香族残留物困住(黄色的)在每个Fab结构中。

重要的是，在复合物中没有观察到肽的N端和C端部分，这表明每个末端都是紊乱的。这种结合模式可能与完整蛋白质背景下的抗原识别兼容，就像在蛋白质印迹中发生的那样。同时，在其他Fab的复合物结构中观察到肽的完整C末端。

通过研究甲基化赖氨酸残基周围的局部环境，我们发现所检测的四个抗体克隆通过协同使用几个芳香残基识别甲基化赖胺酸残基(图4B类). 在识别组蛋白修饰和抗甲基化组蛋白抗体的阅读蛋白中，也可以观察到由芳香残基形成的口袋，称为“芳香笼”(10)，专门识别甲基化赖氨酸残基(17). 这些结构强烈表明，这些Fab通过使用相同的结构原理获得了甲基化的特异性。考虑到每个Fab使用不同的芳香族残基组合，即。，F9使用两个Tyr和一个Trp，C9使用两种Phe和一种Tyr，E6使用三个Tyl，D6使用三种Trp，芳香残基的组合不太可能是甲基化赖氨酸残基识别的基础，而是表明了CH–pi相互作用的一般重要性(18)甲基化赖氨酸中的芳香残基和甲基之间。

从复合物中的整个肽来看，每个Fab还与肽的其他部分形成氢键和盐桥。PDBePISA计算的所有氢键和盐桥(19)，总结如下补充说明1F9和E6各自与甲基化肽结合17个氢键和4个盐桥(图S6). 另一方面，C9和D6分别与肽形成七个氢键(图S6). 与F9和E6相比，C9和D6中观察到的氢键更少，加上Fab之间的亲和力范围也相当，这也表明深层芳香笼在肽结合中发挥了巨大作用。

重要的是，F9和E6与肽的C-末端羧基参与了几个氢键和盐桥，这可能解释了为什么这些Fab不能识别全长蛋白质。为了证实这些非共价键与C末端羧基的作用，我们使用C末端酰胺化的甲基化肽进行了SPR分析(图S7). 结果表明，酰胺化肽对F9和E6的结合反应几乎消失，而C9和D6识别的酰胺化肽具有与非酰胺化肽相似的亲和力。这表明F9和E6不识别蛋白质抗原的主要原因是它们与C末端羧基的结合，这与完整蛋白质序列的结合不兼容。

兔免疫

在Prosci Inc（Poway，California）每隔2周用甲基化肽-KLH结合物对两只新西兰白兔进行四次皮下免疫。第一天，用含完全弗氏佐剂的PBS中200μg肽-KLH免疫家兔，获得免疫前血清。使用100μg含有不完全弗氏佐剂的PBS中的肽-KLH进行以下注射。在最后一次注射后1周获得血清，并通过ELISA检测抗体滴度。

图书馆建设与选择

对甲基化肽表现出最佳抗体滴度的兔子与选择非甲基化肽进行文库构建。根据制造商的说明，使用Tri-reagent（美国俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心有限公司）从骨髓和脾脏中获取总RNA。信使RNA是根据制造商的说明使用NucleoTrap mRNA（美国宾夕法尼亚州伯利恒Macherey-Nagel）自旋柱获得的。然后，使用公布的专利US 9890414中详细描述的方法制作库。简单地说，第一链cDNA是使用寡核苷酸dT和PowerScribe MMLV RT（Monserate Biotechnology Group，San Diego，CA，USA）从信使RNA合成的。使用Amplitaq聚合酶（Applied Biosystems）进行二级cDNA合成，然后使用Advantage 2聚合酶混合物（Clontech）进行单引物扩增，并将其整合到Fab噬菌体展示载体中，并将该噬菌体展现载体中的重链和轻链均为自然序列，与广泛使用的Fab噬菌体载体包含在同一载体中，以及每个自身的信号肽(25). 如之前的研究所述，将重链融合到M13噬菌体的截短基因III蛋白上(26). 为了放大大肠杆菌，将10μg文库DNA电穿孔到XL Blue细胞（Monserate）中，并在30°C下，在1mM IPTG和抗生素（羧青霉素、四环素和卡那霉素）存在下，用VCS M13辅助噬菌体诱导噬菌体产生过夜。用PEG/NaCl从细菌上清液中沉淀噬菌体，并将其重新悬浮在1%的BSA/PBS中。在4°C的PBS中以2μg/ml的速度将50μl甲基化肽-BSA结合物涂布在微滴度孔（Costar 3690）上过夜。用PBS清洗微孔五次，并填充1%BSA/PBS，然后在37°C下培养1h。弹出阻断剂，将200μl第1轮输入噬菌体添加到每个孔中，并在37°C下孵育1.5小时。用PBS洗涤三次后，洗脱结合噬菌体，中和并用于感染ER2738大肠杆菌细胞。使用VCS M13辅助噬菌体在30°C的条件下，在1 mM IPTG和抗生素（羧苄青霉素、四环素和卡那霉素）的存在下，隔夜扩增噬菌体，用于下一轮试验。随后的第2轮至第4轮，我们在微量滴定池中进行了上述操作，以吸收非甲基特异性结合物，无论是否存在非甲基肽作为最终浓度为2μg/ml的可溶性竞争对手。

Fab筛选

为了筛选单个Fab克隆，在1.2 ml含有50μg/ml羧苄青霉素的Super Broth培养基中培养圆形4个输出菌落4小时37°C（850 rpm）。用1 mM IPTG在OD600 0.5至0.7、30°C下诱导克隆过夜。用50μl甲基化肽-BSA结合物（1μg/ml，PBS）、50μl非甲基化肽（1μg/ml，PBS和抗兔Fab'2）包被微量滴度孔（Costar 3590），以在4°C下过夜测量表达水平（2μg/ml（PBS）；Jackson Immunoresearch#111-006-047）。用PBS清洗水井三次，并用100μl 1%BSA/PBS在37°C下封闭1h。旋转培养板，用50μl Fab-sup替换阻滞剂，并在37°C下培养约2小时。用PBS清洗微孔三次，并用山羊抗兔IgG F（ab’）2辣根过氧化物酶（HRP）结合物（Pierce 31461）（1%BSA/PBS中1:5000）在37°C下检测结合Fab 1小时。用PBS冲洗微孔3倍，并用50μl四甲基联苯胺底物混合物进行显影。20分钟后用50μl 2 N硫酸停止反应，并在450 nm处读取极板。

Fab制剂作为重组蛋白

将每个Fab克隆中编码重链和轻链的基因片段克隆到pcDNA 3.4中，pcDNA 3.4是一种具有Igκ信号肽序列的哺乳动物表达系统（ThermoFisher Scientific）表达载体。Expi293细胞（ThermoFisher Scientific）与每个Fab的重链和轻链表达载体共转染，转染4天后收集上清液。将上清液与20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、500 mM NaCl、5 mM咪唑（biding buffer）进行透析，并加载到与结合缓冲液平衡的Ni-NTA树脂（QIAGEN）上。用20 mM Tris-HCl（pH8.0）、500 mM NaCl、20 mM咪唑（洗涤缓冲液）洗涤树脂，然后用20 mM-Tris-HCl（pH8。将洗脱的Fabs与PBS进行透析，并使用与PBS平衡的HiLoad 26/600 Superdex 75-pg色谱柱（GE Healthcare）通过尺寸排除色谱进一步纯化Fabs。为了结晶，使用Resource Q色谱柱（通用电气Healthcore）通过后续阴离子交换色谱广泛纯化Fabs然后使用与上述相同的色谱柱在20 mM Tris-HCl（pH8.0）、20 mM NaCl中进行第二尺寸排阻色谱。收集单体峰分，通过SDS-PAGE和考马斯染色评估每个Fab的纯度。

表面等离子共振

在Biacore T200仪器（GE Healthcare）中分析肽与Fabs的结合。根据制造商的说明，采用胺偶联法将每个Fab固定在CM5传感器芯片（GE Healthcare）的表面。使用含0.005%吐温20的PBS作为运行缓冲液。通过向传感器芯片中注入浓度增加的肽，获得动力学数据。使用BIAevaluation软件（GE Healthcare）分析数据，并通过曲线的全局拟合计算结合亲和力和动力学参数。当Fabs/肽的特定组合显示出快速解离速率常数时，动力学参数很难通过全局拟合确定，因此结合亲和力是通过稳态分析确定的。

作为重组蛋白的IgG制剂

以一种IgG表达的抗体阳性对照载体（ThermoFisher Scientific）为模板，通过将重链与兔IgG Fc偶联，构建了IgG的表达载体。将Expi293细胞与每个IgG的重链和轻链表达载体共转染，转染4天后收集上清液。将上清液加载到与PBS平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）上。用PBS清洗树脂，然后用50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0）洗脱IgG。洗脱的部分立即用2M Tris-HCl（pH 8.0）中和，并使用与PBS平衡的HiLoad 26/600 Superdex 200-pg色谱柱（GE Healthcare）通过尺寸排除色谱进一步纯化。

蛋白质印迹

从William Hahn&David Root的表达载体pDONR223-MAP3K2（Addgene质粒#23454；http://n2t.net/addgene:23454; RRID:Addgene_23454）(27)并用HA标签序列克隆到pcDNA3.4中。将HEK293细胞与HA-MAP3K2和模拟或FLAG-SMYD3表达载体共转染。用放射免疫沉淀细胞裂解缓冲液（Santa Cruz）裂解HEK293细胞，并辅以完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche Applied Science），制备细胞裂解物样品。使用BCA蛋白质分析试剂盒（ThermoFisher Scientific）测定蛋白质总量，用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，并将其印迹到硝化纤维素膜上。通过与抗DDDDK-tag单抗-HRP-DirecT（MBL Lifescience）、抗HA tag单克隆抗体-HRP-DiecT（MBL Lifescience）或每个IgG孵育，然后与HRP-结合抗兔IgG、HRP-连接抗体孵育（细胞信号技术），检测蛋白带在室温下保持30分钟，并通过增强化学发光进行可视化（GE Healthcare）。

结晶、数据收集和精炼

将纯化的Fab与甲基化肽混合，然后使用Amicon Ultra MWCO 10000（Merck Millipore）浓缩至4.3（F9）、4.3（C9）、5.3（E6）和4.4 mg/ml（D6）。使用Oryx8蛋白质结晶机器人（道格拉斯仪器公司）进行初始结晶筛选。在0.2 M碘化钾、20%PEG3350（F9）、0.2 M六水合氯化镁、20%PEG 3350（C9）、0.1 M氯化钾、24%PEG330（E6）或0.2 M氯化钙、20%PEG-3350（D6）的溶液中获得每个Fab的单晶。采集合适的晶体，在补充有20%甘油的母液中短暂孵育，然后转移到液氮中储存，直到收集数据。

如上所述，在低温条件下（100 K），从光子工厂（日本筑波）的光束线BL5A和BL1A或Spring 8（日本兵库）的光束线上收集单晶衍射数据。衍射图像用程序MOSFLM进行处理，并用程序SCALA或AIMLESS进行合并和缩放(28)CCP4套件的(29). 使用Fab NVS-1-19-5（PDB输入代码5M63）的坐标，通过分子置换法确定D6的结构(30)使用PHASER程序(31). 其他Fab的结构也通过以D6坐标为模板的分子置换法确定。通过REFMAC5程序对模型进行了改进(32)并使用COOT手动构建(33). 使用PROCHECK进行验证(34). 数据收集和结构优化统计信息见表S3.

FLAG-tagged SMYD3的表达载体由滨本良治博士提供。我们感谢Photon工厂的员工提供的卓越技术支持。